Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Физиолого-биохимические основы хранения и прорастания семян 12
1.1. Покой - эволюционный механизм хранения семян 12
1.1.1. Покой семян растений 12
1.1.2. Роль фитогормонов и ингибиторов роста 13
1.1.3. Окислительные процессы в семенах, находящихся в состоянии покоя 19
1.2. Влияние внешних факторов на хранение семян 22
1.2.1. Изменение жизнесопособности семян при хранении 22
1.2.2. Влияние условий хранения на жизнеспособность семян 23
1.2.3. Биохимические механизмы старения семян 25
1.3. Физиолого-биохимические процессы при прорастании семян 29
1.3.1. Подготовка к прорастанию и триггерная роль воды 31
1.3.2. Физиолого-биохимические изменения при прорастании семян. 34
1.3.3. Влияние внешних факторов на прорастание семян 37
Глава II. Окислительный стресс и активные формы кислорода . 44
2.1. Окислительный стресс в живых организмах 44
2.2. Активные формы кислорода и их биологическая роль 46
2.2.1. Супероксид анион-радикал 46
2.2.2. Синглетный кислород 48
2.2.3. Гидроксильный радикал 48
2.2.4. Перекись водорода 49
2.3. Влияние неблагоприятных факторов внешней среды на перекисное окисление липидов 51
Глава III. Антиоксиданти растений 55
3.1. Низкомолекулярные антиоксиданти 55
3.1.1. Соединения, содержащие енольные группы 55
3.1.2. Тиоловые соединения - ингибиторы свободных радикалов 59
3.1.3. Антиоксиданти других классов 61
3.2. Высокомолекулярные антиоксиданты 61
3.2.1. Супероксиддисмутаза 61
3.2.2. Каталаза 62
3.2.3. Пероксидазы растений 63
3.2.4. Глутатионзависимые ферменты 65
Заключение по литературному обзору 66
Цель и задачи исследования 70
Экспериментальная часть 71
Глава IV. Материалы и методы исследования 71
4.1. Условия, объекты и материалы исследования 71
4.2. Использованная аппаратура 81
4.3. Приготовление реактивов 82
4.4. Схема и методики проведения исследований 83
Результаты и их обсуждение 95
Глава V. Влияние условий хранения на антиоксидантную систему и окислительные процессы семян растений 95
5.1. Влияние влажностно-температурного стресса на перекисное окисление липидов и антиоксидантную систему зерновок ячменя 96
5.2. Влияние условий хранения на активность антиоксидантной системы и физиолого-биохимические процессы зерна 100
5.3. Изменение антиоксидантного статуса и окислительные процессы при длительном хранении зерна в естественных условиях 111
Глава VI. Влияние внешних факторов на антиоксидантную систему и окислительные процессы при прорастании семян растений 117
6.1. Активность оксидоредуктаз при набухании и прорастании семян 119
6.2. Окислительные процессы и активность антиоксидантной системы при набухании и прорастании семян 125
6.3. Участие пероксидазы и антиоксидантов в прорастании семян пшеницы 135
6.4. Влияние температуры на активность антиоксидантной системы и окислительные процессы 139
6.4.1. Активность, каталитические свойства пероксидазы и содержание антиоксидантов при прорастании семян пшеницы 140
6.4.2. Роль пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов в защите проростков от окислительного стресса 146
6.4.3. Влияние температуры замачивания на окислительные процессы и активность антиоксидантной системы проростка 150
6.5. Биохимические процессы и антиоксидантныи статус при различных режимах аэрации ячменя 153
6.6. Влияние ультрафиолетового облучения на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы 162
6.6.1 Влияние ультрафиолетового облучения на активность окислительных ферментов ячменя 162
6.6.2 Влияние ультрафиолетового облучения на всхожесть и состояние антиоксидантной системы при прорастании семян ячменя 166
6.6.3 Совместное действие ультрафиолета с низкой температурой и этанолом 170
Глава VII. Низкомолекулярные антиоксиданти - субстраты и регуляторы активности пероксидазы 173
7.1. Низкомолекулярные антиоксиданты - субстраты растительных пероксидаз 174
7.1.1. Аскорбиновая кислота - медленно окисляемый субстрат пероксидазы 175
7.1.2. Гидрохинон-быстро окисляемый субстрат пероксидазы 180
7.2. Совместное окисление антиоксидантов - регуляторный механизм с участием пероксидазы растений 184
7.2.1. Механизм совместного пероксидазного окисления гидрохинона и аскорбиновой кислоты 185
7.2.2. Совместное окисление аскорбиновой кислоты с медленно и быстро окисляемыми субстратами пероксидазы 192
7.2.3. Механизм совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина 200
7.3. Антиоксиданти - регуляторы активности пероксидазы растений. 205
7.3.1. Влияние кверцетина на реакции пероксидазного окисления о-дианизидина 205
7.3.2. Норадреналин и витамина К - регуляторы пероксидазного окисления антиоксидантов 208
7.3.3. Салицилат натрия - ингибитор пероксидазы в реакциях окисления ферроцианида калия и о-дианизидина 216
7.3.4. Участие растительных гликозидов в реакциях пероксидазного окисления 221
7.3.5. Индолил-3-уксусная кислота - низкомолекулярный регулятор пероксидазы 227
7.4. Влияние моно- и олигосахаридов на стабильность и каталитические свойства пероксидазы 237
7.5. Пероксидазный катализ антиоксидантов и его биологическая роль. 243
Глава VIII. Влияние анти- и прооксидантов на всхожесть и физиолого-биохимические процессы семян 253
8.1. Влияние низкомолекулярных антиоксидантов на всхожесть и физиологические процессы семян пшеницы 255
8.2. Действие аскорбиновой кислоты и гидрохинона на физиолого-биохимические процессы семян 262
8.3. Влияние растительного гликозида на всхожесть и физиологические процессы семян 266
8.4. Участие аскорбиновой кислоты и растительных стероидных гликозидов в формировании гипобиотического состояния семян. 269
8.5. Влияние перекиси водорода на всхожесть и физиолого биохимические процессы семян 275
Глава IX. Перспективы применения антиоксидантов в производстве солода 281
9.1. Антиоксид анты как показатель оценки качества зерна и биохимических процессов при производстве солода 282
9.1.1. Состояние антиоксидантной системы у ячменя с различными технологическими показателями качества 282
9.1.2. Изменение активности антиоксидантной системы и процессов перекисного окисления липидов при производстве светлого пивоваренного солода 287
9.2. Содержание антиоксидантов в отходах солодовенного производства и перспективы их использования 295
9.2.1. Антиоксидантная активность отходов солодовенного производства. 296
9.2.2. Влияние экстрактивных антиоксидантов на солодоращение. 299
9.2.3. Описание технологической схемы использования экстрактивных антиоксидантов в солодовенном производстве 303
Заключение 306
Выводы 318
Рекомендации производству 321
Список литературы 322
Приложение 355
- Роль фитогормонов и ингибиторов роста
- Изменение антиоксидантного статуса и окислительные процессы при длительном хранении зерна в естественных условиях
- Норадреналин и витамина К - регуляторы пероксидазного окисления антиоксидантов
- Описание технологической схемы использования экстрактивных антиоксидантов в солодовенном производстве
Введение к работе
Актуальность темы. Способность семян находиться в состоянии покоя является важным приспособительным механизмом, позволяющим человеку в определенных условиях длительно хранить семена сельскохозяйственных растений (Николаева, 1999). В то же время наличие покоя у семян весьма затрудняет культивирование многих пищевых, кормовых, технических и других полезных растений, а также осложняет работы в ботанических садах по созданию коллекций растений и интродукции перспективных для хозяйства видов и т.д. Свежеубранные зерновые культуры почти всегда прорастают плохо, поскольку в них велик процент зародышей, неспособных к прорастанию. Наибольшую энергию прорастания зерновки получают в процессе дозревания, которое в зависимости от свойств сорта, условий роста и хранения может длиться многие недели (Трисвятский, 1985). Вся цепь процессов, происходящих в семенах при дозревании, прорастании и превращении их в новое растение постоянно находится в поле зрения физиологов растений (Хавкин, 1982; Николаева, 2001).
Прорастание семян сопровождается активацией генома и различных физиолого-биохимических процессов (Зауралов, Лукаткин, 1997; Обручева и др., 1999). Энергетическое жизнеобеспечение клеток зародыша, выходящего из покоя, поддерживается достаточно сложным комплексом митохондриальных окислительно-восстановительных реакций (Робертси, 1982; Обручева, 2001). С повышением метаболических процессов в клетках прорастающих семян наблюдается образование активных форм кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы в составе низко- и высокомолекулярных соединений (Кения, Лукаш, 1993). Действие компонентов системы антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях (Мерзляк, 1989).
Активные формы кислорода выполняют в клетках важные сигнальные функции не только при стрессе, но и в обычных условиях произрастания растений (Аверьянов, 1999; Тарчевский, 2000). Стрессовые воздействия (низкая температура, ультрафиолет, химические соединения и др.), применяемые для прерывания покоя и повышения всхожести семян, могут быть инициаторами окислительных процессов, таких как перекисное окисление липидов. В тоже время публикации, отражающие роль анти- и прооксидантного баланса при прорастании семян встречаются крайне редко. Наконец, остается открытым вопрос о взаимной регуляции анти- и прооксидантной системы, а также перспективы использования данного механизма в сельскохозяйственной практике и перерабатывающей промышленности.
Субстратами пероксидазы могут быть фитогормоны, цитохром с, НАДФН, триозы, аскорбат, флавоноиды и др. (Садвакасова, Кунаева, 1987; Рогожин, Верхотуров, 2004). Поскольку активность пероксидазы и метаболизм гормональных и негормональных соединений тесно взаимосвязаны, то повышение активности фермента должно отражаться в изменении метаболизма его субстратов. Динамика роста научной литературы, посвященной активным формам кислорода, антиоксидантной системы, окислительным реакциям и их участием, говорит о стремительно растущем к ним интересе физиологов и биохимиков.
Цель работы состояла в изучении роли анти- и прооксидантной системы при хранении, прорастании и переработке зерновых культур, установлении закономерностей проявления ее активности на действие физических и химических факторов, а также исследовании перспективы применения антиоксидантов в сельском хозяйстве и солодовенном производстве. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать окислительные процессы и антиоксидантный статус зерновок злаковых культур при различных условиях хранения.
-
Определить активность и каталитические свойства некоторых оксидоредуктаз при хранении и прорастании зерновок пшеницы.
-
Проследить за изменением активности антиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов при набухании и прорастании зерновок.
-
Изучить влияние химических и физических факторов на окислительные процессы и антиоксидантный статус семян и проростков.
-
Предложить механизм окисления низкомолекулярных антиоксидантов с участием пероксидазы и исследовать влияние регуляторов на каталитические свойства фермента.
-
Исследовать влияние экзогенных анти- и прооксидантов на прорастание и всхожесть зерновок пшеницы.
-
Исследовать влияние технологического режима проращивания ячменя на антиоксидантный статус и качество светлого пивоваренного солода.
-
Определить содержание низкомолекулярных антиоксидантов в отходах солодовенного производства и предложить перспективы их использования при солодоращении ячменя.
Защищаемые положения.
Длительное хранение семян, а также их хранение при неблагоприятных условиях, способствует накоплению продуктов ПОЛ и снижению активности антиоксидантной системы. Поэтому показатели состояния про- и антиоксидантной системы могут быть использованы как критерий оценки жизнеспособности семян в условиях хранения и переработки. Низкая активность окислительных процессов и высокое содержание низкомолекулярных антиоксидантов в зерновках является одним из биохимических механизмов, обеспечивающих жизнеспособность семян при длительном хранения.
Перекисное окисление липидов является показателем активации кислородных метаболитов, участвует в запуске программы прорастания семян и активации антиоксидантной системы.
Низкомолекулярные антиоксиданты способны регулировать активность пероксидазы растений в условиях in vitro и in vivo. Взаимное влияние низкомолекулярных антиоксидантов и высокомолекулярного антиоксидантного фермента – пероксидазы является одним из регуляторных механизмов прорастания семян растений.
Низкомолекулярные экзогенные анти- и прооксиданты являются эффективными регуляторами прорастания зерновок злаковых культур. Участие низкомолекулярных антиоксидантов в механизме покоя семян обусловлено ингибированием фермента антиоксидантной защиты – пероксидазы, что подтверждается в экспериментах in vitro и in vivo. Понижение активности фермента высокими концентрациями антиоксидантов способствует углублению покоя семян, а активация пероксидазы – ускоренному их выходу из состояния гипобиоза и быстрому прорастанию.
Научная новизна. Показано участие компонентов антиоксидантной системы в регуляции биохимических процессов при хранении и прорастании семян растений. Установлено, что стресс-факторы (температура, ультрафиолет, химические соединения), способствуют стимуляции прорастания семян, через активацию перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы. Результаты проведенных исследований дают возможность рассматривать ПОЛ как один из пусковых механизмов активации программы прорастания семян. Знания механизмов активации биохимических процессов прорастания семян позволяют разработать новые методы, повышающие всхожесть семян и устойчивость растений к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.
Впервые изучены механизмы индивидуального и совместного пероксидазного окисления низкомолекулярных антиоксидантов. Определены каталитические константы реакций и предложены механизмы взаимной регуляции пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов, реализуемые в биологической системе. Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы проявляются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса. Фермент, не проявляющий избирательность по отношению к природе окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.
Впервые в производственных условиях исследована активность антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов в зерновках ячменя при производстве светлого пивоваренного солода. Предложено использовать показатели активности антиоксидантной системы для оценки протекания окислительных процессов при производстве пивоваренного солода.
Практическая значимость работы. Диссертационная работа выполнена в рамках тематики НИР кафедры пищевой технологии ИрГТУ "Техническая биохимия, биотехнология и химия биологически активных веществ" (госбюджетная тема №378). Исследования были поддержаны грантом Министерства образования и науки РФ “Биохимия процессов, протекающих при хранении и переработке растительного сырья” (код ГРНТИ 62.09.37).
Показатель состояния анти- и прооксидантной системы может быть использован как дополнительный критерий оценки качества при хранении и солодоращении зернового сырья. Замачивание семян в растворах низкомолекулярных антиоксидантов, приводит к повышению всхожести и устойчивости проростка к неблагоприятным факторам среды. Полученные данные позволят предложить наиболее оптимальное время замачивания семян в растворах регуляторов, которое по результатам наших исследований приходится на первые четыре часа набухания. Полученные результаты могут быть рекомендованы для практического использования в сельскохозяйственном производстве для увеличения всхожести и сопротивляемости семян к неблагоприятным факторам.
Результаты, посвященные изучению влияния низкомолекулярных антиоксидантов на солодоращение пивоваренного ячменя, могут быть использованы при разработке технологии применения этих регуляторов в солодовенном производстве. Исследования, посвященные определению содержания низкомолекулярных антиоксидантов в отходах пивоваренного и солодовенного производства, могут быть полезны для разработки технологии использования отходов в регуляции биотехнологических процессов при солодоращении зернового сырья.
Материалы используются для проведения занятий по курсам “Физиология и биохимия растений”, “Биохимия”, “Прикладная энзимология”, и "Биотехнология переработки растительного сырья" для студентов технологического и сельскохозяйственного профиля, обучающихся в ИрГТУ и ЯГСХА.
Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на научно-практической конференции "Физиология, биохимия и экология растений" (Якутск, 1997, 1998); на V-ой Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999); на ежегодных семинарах СИФИБР СО РАН (Иркутск, 1999, 2000); на республиканской научно-практической конференции "Научное сопровождение образовательного процесса агровуза" (Якутск, 2001); на научно-практических конференциях "Региональные проблемы сельскохозяйственного производства" (Якутск, 2001), "Проблемные вопросы Восточно-Сибирского региона" (Иркутск, 2001), "Перспективы развития технологии, экологии и автоматизации пищевых производств" (Иркутск, 2004), “Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания” (Иркутск, 2006, 2007); на Всероссийской научной конференции “Биологически активные добавки и здоровое питание” (Улан-Удэ, 2001); на V съезде общества физиологов растений “Физиология растений – основа фитобиотехнологии” (Пенза, 2003 г); на Международной научно-практической конференции “Прогрессивные технологии развития” (Тамбов, 2004); Всероссийской конференции “Пищевые технологии” (Казань, 2004), на VIII Международной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); на Всероссийской научно-технической конференции “Молодые ученые - Сибири” (Улан-Удэ, 2003); на 2-й Международной научно-практической конференции “Составляющие научно-технического прогресса” (Тамбов, 2006); на смотре-конкурсе НИР работа на тему "Ресурсосберегающие технологии в производстве пива" удостоена дипломом (Иркутск, 2006); на V-ой Международной научно-практической конференции “Современные тенденции развития АПК в России” (Красноярск, 2007).
Достоверность и обоснованность научных положений и выводов обеспечены проведенным объемом лабораторных исследований; профессионализмом проведения измерений на современном оборудовании; подтверждены сходимостью расчетных и экспериментально полученных результатов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано более 40 печатная работа, в том числе 17 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов докторских диссертаций, а также 2 монографии (в соавторстве) и 1 учебное пособие.
Объем и структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 360 страницах машинописного текста, включает 44 таблиц, 73 рисунков, а также список цитируемой литературы из 452 наименований. Диссертация состоит из введения, десяти глав, заключения, выводов, рекомендаций производству, списка использованной литературы и приложения.
Личное участие автора. Личный вклад соискателя заключается в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке, интерпретации и публикации полученных результатов.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту проф. В.В. Рогожину за профессиональное и доброжелательное руководство; с.н.с. Т.Т. Курилюк, к.б.н., Т.В. Рогожиной, В.Ю. Гребенщикову, Г.В. Пинигиной, В.К. Франтенко, О.В. Соколовой – за помощь и ценные советы, высказанные в процессе обсуждения диссертационной работы. Автор искренне благодарит сотрудников ОАО "БПК", ЯГСХА, ИрГТУ, ИГСХА и СИФИБР СО РАН за всестороннюю помощь и поддержку, оказанные при подготовке диссертации.
Роль фитогормонов и ингибиторов роста
Гормональная система является обязательной составной частью регуляторных механизмов, обеспечивающих согласованное функционирование клеток, тканей, органов и растений в целом. В настоящее время различают пять типов фитогормонов: три из них - ауксины, гиббериллины и цитокинины - чаще всего действуют как стимуляторы роста; два других - абсцизовая кислота и этилен - относятся к фитогормонам ростоингибирующего действия [28, 32]. Однако фитогормоны контролируют не только ростовые и морфогенетические процессы, но и выполняют регуляторную роль в процессах покоя, созревания, старения, поглощения и транспорта веществ, активируют механизмы устойчивости к различным неблагоприятным факторам среды [33, 34]. Индукция покоя обусловлена накоплением в тканях этилена и АБК, а поддержание глубокого покоя обеспечивается ингибирующим действием АБК, тогда как его прерывание сопряжено со стимулирующим действием гиббериллиновой кислоты и отчасти цитокининов. Регуляция роста побегов после прерывания глубокого покоя сопровождается повышением активности цитокининов и ауксинов [35].
Гиббереллины представляют собой фитогормоны, активно участвующие в процессах роста. На семена, находящиеся в экзогенном покое, в большинстве случаев гиббереллины заметно не действуют. Они, как правило, устраняют неглубокий физиологический покой. Известно около 70 видов растений, у которых обработка ГК3 стимулирует прорастание покоящихся семян, заменяя действие света, сухого хранения и кратковременной холодной стратификации [8]. Стимуляция прорастания семян с неглубоким покоем наблюдается под влиянием растворов ГК в широком диапазоне концентраций; однако оптимальные концентрации варьируют в зависимости от вида семян и структуры ГК. Семена видов рододендрона хорошо прорастают под действием растворов ГК3 от 100 до 300 мг/л. Двухдневная обработка свежесобранных семян бальзамина садового раствором ГК3 (500 мг/л) вызывает энергичное прорастание [36].
У семян, находящихся в покое промежуточного типа (ясень зеленый, лещина), ГКз в более высокой концентрации вызывает слабую стимуляцию, если при обработке семя находится в околоплоднике, и гораздо более сильную - при удалении околоплодника. ГК в той или иной мере стимулирует рост изолированных зародышей из семян с глубоким физиологическим покоем [37]. Между тем на интактные семена с глубоким покоем ГК, как правило, не действует даже после частичной стратификации.
Весьма важным аспектом действия ГК является их способность стимулировать доразвитие зародыша в семенах, находящихся в морфофизиологическом покое. Стимулирующее действие ГК на прорастание семян и на рост зародышей естественно наводило на мысль, что покой семян связан с недостатком этих гормонов. Гиббереллиновая активность в покоящихся семенах разных (главным образом плодовых растений) сильно возрастает под влиянием холодной стратификации. Показано, что при пониженной температуре происходят подготовительные изменения, необходимые для синтеза соответствующих гиббереллинов. Этот синтез протекает в большей или меньшей степени и на холоде, но особенно успешно идет, если стратифицированные семена или зародыши попадают в условия, благоприятные для роста. У клена татарского во время стратификации на холоде наблюдалось увеличение гиббереллиновой активности в несколько раз [17, 37]. Абсцизовая кислота играет важную роль в процессах роста и развития растений. Так, например, показано ее участие в процессе развития, созревания и в период покоя семян [31, 38, 39]. При этом значительное накопление АБК наблюдается в период развития семян, а к моменту их созревания ее уровень снижается [40-42]. Показано, что АБК способствует переходу семян в состояние покоя, подавляет преждевременное прорастание незрелых семян. Кроме того, АБК принимает участие в регуляции функционирования устьиц [43], влияет на рост побегов и корней [28, 44], формирование клубней, рост гипокотиля [45], дифференцировку зимующих почек, вызывает развитие плодов [46].
Абсцизовая кислота играет ключевую роль в развитии защитных механизмов растений в ответ на действие засухи, гипо- и гипертермии, засоления и т.д. Поскольку считается, что абсцизовая кислота накапливается при стрессах и принимает участие в процессах адаптации растений к неблагоприятным условиям внешней среды, ее принято считать гормоном стресса. Накопление в тканях АБК вызывают различные по природе стрессовые воздействия: засуха [47- 49], засоление [50, 51], осмотический шок, высокие и низкие температуры [17, 52] и другие факторы. Холодная и теплая стратификация приводили к значительному снижению уровня гормона и последующему прорастанию семян [37].
Выход семян из глубокого покоя под влиянием стратификации обычно объясняют снижением содержания АБК. Предполагается, что это снижение содержания АБК происходит как за счет ее связывания или превращения в менее активные вещества, так и вследствие диффузии в окружающую среду. Чувствительность семян и зародышей к АБК варьирует у разных видов, а также в зависимости от их физиологического состояния и условий проращивания [42].
Прорастание семян, не имеющих покоя, сопровождается исчезновением или снижением содержания АБК и ИУК до концентрации, благоприятной для роста. В условиях, препятствующих прорастанию (например, при низкой температуре), в таких семенах сохраняется высокий уровень ИУК [17].
Цитокининам принадлежит важная роль в регуляции жизни растений, начиная от развития оплодотворенной яйцеклетки и заканчивая процессами старения [53,54]. Цитокинины участвуют в регуляции деления клеток и дифференцировке хлоропластов, они индуцируют стеблевой морфогенез, рост боковых побегов [55], активируют прорастание семян, задерживают процессы старения листьев, участвуют в регуляции транспорта метаболитов в растении [56], а также ингибируют рост корней в длину [57] и формирование боковых корней [58]. Цитокинины оказывают влияние на фотосинтетический аппарат, световые реакции фотосинтеза и углеродный метаболизм [59,60], биосинтез нуклеиновых кислот и белков [54], метаболизм азота [61].
Цитокинины в отличие от гиббереллинов не обладают столь широким спектром действия на покоящиеся семена разных видов. Кроме того, их стимулирующее влияние проявляется в узком диапазоне концентраций, специфичном для разных видов. Кинетин снимает торможение прорастания светочувствительных семян некоторых видов в темноте, например, салата, табака и ряда других [37]. Однако в полной темноте действие кинетина проявляется слабо; он более активен в сочетании хотя бы с очень коротким периодом освещения. Имеется довольно много данных о том, что кинетин резко стимулирует прорастание зародышей, извлеченных из семян с глубоким физиологическим покоем (груши, яблони, рябины, клена). Вероятнее всего, непосредственной точкой приложения действия цитокининов являются семядоли, посредством которых и возникает эффект, стимулирующий их прорастание [17].
Важным аспектом действия цитокининов является их способность в отличие от ГК3 полностью инактивировать ингибирующее действие абсцизовой кислоты на семена и зародыши. Эти данные пока довольно неопределенны, но показывают, что цитокинины участвуют в процессе нарушения как неглубокого, так и глубокого физиологического покоя [37].
Ауксины, в частности индолилуксусная кислота, являются важным фактором роста, многочисленные попытки ускорить с помощью ауксина прорастание семян практически не имели успеха. Роль ауксинов в растениях заключается в следующем: стимулируют растяжение клеток, образование и рост корней; участвуют в дифференцировке клеток, созревании плодов и цветении [32,33]; замедляют процессы старения листьев, участвуют в формирования фото -и гравитропизмов побегов и корней [28]; определяют распределение ассимилятов, воздействуя на флоэмный транспорт [62].
В настоящее время общепризнанно, что ИУК является активатором роста растяжением осевых органов. В частности было выяснено, что ауксин индуцирует увеличение растяжимости клеточных стенок, усиливает дыхание, синтез белков и нуклеиновых кислот и многие другие процессы [32]. Во время созревания семян, связанного с отложением запасных веществ и переходом зародыша в покоящееся состояние, ауксин полностью исчезает из зародыша, а в эндосперме или семядолях переходит в связанное состояние. При прорастании связанный ауксин переходит в свободное состояние и появляется в зародыше, однако убыль ауксина в эндосперме значительно больше, чем его появляется в зародыше. Считается, что в щитке и зародыше во время прорастания активируется ферментативная система инактивации ауксина, включающая в себя ПО [32]. В набухших семенах, находящихся в глубоком физиологическом покое, было обнаружено высокое содержание ИУК. Выдвинуто предположение, что ИУК в семенах, характеризующихся глубоким или промежуточным физиологическим покоем, выступает как фактор торможения прорастания семян и нарушения нормального роста изолированных зародышей [17, 63,64].
В условиях теплой стратификации, не выводящей семена из состояния физиологического покоя, содержание ИУК в семенах остается высоким. Между тем, под влиянием стратификации на холоде оно постепенно снижается, а перед прорастанием резко падает. Следует отметить, что высокое содержание ИУК обнаружено также в набухших семенах ряда видов, не имеющих покоя. С началом прорастания оно резко падает, однако в условиях, неблагоприятных для прорастания, остается высоким. Таким образом, ИУК в семенах, как находящихся в вынужденном покое, так и характеризующихся глубоким или промежуточным физиологическим покоем, выступает как фактор торможения прорастания, а нередко и нарушения нормального роста изолированных зародышей [17].
Обработка этиленом устраняет физиологический покой семян некоторых: видов. Вместе с тем имеющиеся данные свидетельствуют, что действие этилена даже на семена, характеризующиеся сходным неглубоким покоем, неоднозначно. Оно зависит от видовой специфики, степени зрелости семян, проницаемости их покровов, температуры, газового состава и т. д., вызывая сильную стимуляцию прорастания при одних условиях и не действуя при других [37].
На семена, характеризующиеся глубоким физиологическим покоем, этилен не оказывает стимулирующего действия, а только несколько ускоряет рост зародышей, например, у клена татарского. Имеется много данных, согласно которым прорастание семян сопровождается усиленным образованием этилена. У покоящихся семян наблюдается зависимость между темпами выхода из покоя и интенсивностью выделения этилена [37].
Изменение антиоксидантного статуса и окислительные процессы при длительном хранении зерна в естественных условиях
Старение организма - сложный физиолого-биохимический процесс, который не может быть сведен к одному конкретному механизму, но среди групп изменений, играющих важную роль в старении, безусловно, важное значение имеет механизм повреждения мембран и биомолекул самыми разнообразными внешними влияниями. Старение включает в себя взаимосвязанные изменения на молекулярном, клеточном, органном и организменном уровнях. Универсальной причиной старения служит свободно-радикальное окисление липидов мембран, белков, нуклеиновых кислот под действием активных кислородных метаболитов. Возможно АФК стимулируют и апоптоз - программируемую гибель клеток, путем раскрытия каналов мембран для белка, находящегося в мембранном пространстве и запускающего этот процесс [3,4].
Причины, приводящие семена к потере жизнеспособности в результате длительного хранения, неоднократно привлекали внимание исследователей. Причинами старения семян по Робертсу и Харингтону являются разнообразные физиолого-биохимические изменения: разрушение хромосом, потеря митохондриальной дыхательной активности, нарушение проницаемости мембран, инактивация биомолекул, накопление токсичных продуктов, образование свободных радикалов и др. [1,17].
Результатом метаболических изменений при естественном старении семян является частичная или полная утрата ими жизнеспособности. При этом решающую роль могут играть нарушения различных обменных процессов и клеточных структур семян. Семена зерновых культур характеризуются довольно быстрой потерей всхожести при хранении. Поэтому изучение биохимических превращений, обусловливающих старение семян, имеет не только научное, но и практическое значение. Одним из возможных путей познания механизмов старения семян является детальное изучение их энергетического обмена. Уровень энергетических процессов определенным образом зависит от состояния окислительно-восстановительных ферментов, в первую очередь дегидрогеназ и оксидаз терминального дыхания [37,98].
В качестве основных звеньев, ответственных за сохранение жизнеспособности семян, могут выступать окислительные процессы, от функционирования которых зависят поддержание гомеостаза, включение механизмов, противодействующих старению, концентрации соединений, определяющих прорастание семян, сохранность и стабильность биомембранных структур, обусловливающих и определяющих процессы старения [74]. Одной из важнейших причин потери семенами жизнеспособности является нарушение процессов биологического окисления. Предполагают, что снижение интенсивности дыхания у семян, потерявших всхожесть, является следствием физиолого-биохимических изменений в структуре и функциях митохондрий.
Нами исследована активность ключевых дыхательных ферментов -алкогольдегидрогеназы (спиртовое брожение), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (пентозофосфатный путь), пероксидазы и полифенолоксидазы (аэробное окисление) в процессе хранения ячменя в течение 5 лет в естественных условиях. Показано, что понижение жизнеспособности семян коррелировало с уменьшением активности АДГ и Г6ФДГ, а снижение активности ПО и ПФО - с понижением всхожести.
Алкогольдегидрогеназа - фермент, катализирующий обратимое окисление этанола в ацетоальдегид. Субстраты и продукты реакций, катализируемых АДГ, выполняют разнообразные физиологические функции в клетках растений [273]. Так, этанол обладает антиоксидантными свойствами по отношению к гидроксильному радикалу, влияет на физико-химические свойства и проницаемость мембран; при гипоксических состояниях может выступать энергетическим соединениям [154,155]. Равновесие реакции в физиологических значениях рН смещено в сторону образования этанола, который участвует в различных физиолого-биохимических процессах устойчивости семян к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Накопление этанола в клетках зародыша способствует поддержанию жизнеспособности и длительному сохранению всхожести семян. Нуклеотидфосфаты могут выступать регуляторами накопления эндогенного этанола и ацетоальдегида в семенах, находящихся в состоянии покоя. Полученные данные позволяют сделать выводы, что изучаемые дегидрогеназы необходимы, прежде всего, для сохранения семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием (табл. 3).
С биохимической точки зрения ПФП выполняет две основные функции: во- первых, поставляет НАДФН для различных восстановительных и синтетических реакций; во-вторых, продуцирует различные промежуточные углеводные соединения, которые используются для синтеза нуклеиновых кислот и физиологически активных соединений [273]. Снижение активности Г6ФДГ -ключевого фермента ПФП указывает на нарушение функционировании основного метаболического пути, участвующего в поддержании жизнеспособности семян при хранении [74].
Ухудшение качества семян растений разных видов при хранении может быть обусловлено нарушениями в различных процессах и структурах, но чаще всего оно связано с комплексом изменений. В связи с этим представляет интерес выявление таких показателей обмена, которые позволят оценить способность семян к росту и дальнейшей жизнедеятельности. В настоящее время жизнеспособность семян обычно оценивают по результатам испытаний их лабораторной всхожести и энергии прорастания. Эти показатели дают неполную характеристику семенных образцов, особенно после длительного хранения.
По литературным данным [351], за уровень жизнеспособности при старении семян в наибольшей степени ответственны изменения в липопротеидных мембранах клеток. Предполагают [352], что в семенах происходит образование свободных радикалов, ведущее к окислению липидов мембран, постепенно увеличивающемуся их повреждению и накоплению токсичных продуктов. Изменения в мембранах, установленные на ультраструктурном уровне, проявляются не только в деструктивных нарушениях, но и в повышенной вымываемости электролитов при набухании семян [353]. При старении семян наблюдается ослабление дыхательной активности в результате ингибирования процессов энергообмена. Установлена некоторая связь между изменениями активности ряда оксидоредуктаз и жизнеспособностью семян [333].
Сведения о продолжительности жизни семян и познание механизмов ее регуляции важны в теоретическом и практическом аспектах. Проблема сохранения жизнеспособности семян неизменно возрастает при длительном их хранении, связанном с созданием продовольственных и семенных фондов [76].
Известно, что антиоксидантная система является одним из физиолого-биохимических механизмов поддержания жизнеспособности клеток живых организмов. Проблема сохранения жизнеспособности и качества семян приобретает особую актуальность для зернового хозяйства, поскольку семена испытывают на себе технологические и физико-химические воздействия в процессе хранения и переработки.
Норадреналин и витамина К - регуляторы пероксидазного окисления антиоксидантов
Витамин К - природный антиоксидант широко распространен в растительном мире, особенно в зеленых листьях люцерны, шпината, в цветной капусте, хвое, зеленых томатах и др. [273]. Синтетические препараты витамина К, сохраняя основное нафтохиноновое ядро естественного витамина, имеют менее сложное строение и вместе с тем отличаются большей активностью.
Норадреналин - биомедиатор, участвующий в распространении возбуждения в виде электрического сигнала, выполняя роль химического посредника между клетками. Кроме того, установлено, что нейромедиаторы способны регулировать метаболические и энергетические процессы, способствуя адаптации организма к изменениям окружающей среды как модуляторы [295].
Интерес к этим соединениям возник и в связи с их обнаружением в растениях, а также в связи с предположением о существовании в растительных мембранах химических сенсоров, напоминающих холинорецептор [296]. Обнаружение компонентов холинэргической и адренэргической систем регуляции в растительных мембранах делает вполне реальной идею об универсальных принципах сигнализации и передачи информации в виде электрического и химического сигналов у всех живых организмов. Различия имеются в основном в частных механизмах межклеточной сигнализации у многоклеточных животных и растений, обусловленных специализацией, структурной организацией, особенностями энергетического и метаболического обмена.
Следует отметить также большой недостаток знаний о передаче информации между растительными клетками. Участие химических соединений типа медиаторов как генераторов изменений мембранного потенциала и их возможная роль в возникновении потенциалов действия у растений пока лишь постулируется на основе представлений, установленных для синаптических клеток животных. На уровне клетки как у одноклеточных, так и у многоклеточных организмов, не имеющих синаптических контактов, в том числе у растений, присутствие ацетилхолина и биогенных аминов может объясняться их двойной ролью: как регуляторов внутриклеточного метаболитического обмена и как локальных внутриклеточных медиаторов, взаимодействующих с органеллами в ответ на внешний сигнал, полученный плазмалеммой из окружающей клетку среды.
Биогенные амины принимают участие в окислительно-восстановительных процессах хлоропластов и являются активными регуляторами роста. Они влияют на метаболизм растительных клеток путем регуляции активности ферментов или (и) включения в отдельные реакции в качестве субстратов. Известно, что биомедиаторы оказывают регуляторное действие на пероксидазную активность растительных тканей [296]. Однако молекулярные механизмы действия биогенных аминов на растительную клетку еще недостаточно изучены. Хотя такие исследования позволяют разобраться в механизме действия пероксидазы и понять особенности метаболизации витамина К и норадреналина в растительных тканях.
В последнее время для стимуляции метаболических процессов в растительных тканях широко используются функционально активные вещества из животных тканей, с помощью которых предполагается расширить спектр веществ, повышающих реактивность и устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды.
Ингибирование пероксидазного окисления о-дианизидина норадреналином и витамина К изучали путем добавления в кювету вместе с субстратами пероксидазы ингибиторов при насыщающей концентрации одного из субстратов. На рисунке 41 показаны зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты при различных концентрациях аскорбиновой кислоты и норадреналина в координатах Лайнуивера-Берка.
Видно, что в присутствии норадреналина скорость пероксидазного окисления АК возрастает. Графики скоростей в обратных координатах при рН 4,5-5,0 имели вид прямых с точкой пересечения в правом верхнем квадранте, что указывает на смешанный тип активирования. При рН 5,5-6,5 активатор не влиял на kcat, но уменьшал Кт(каж) пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты. Это соответствует типу активации, которая называется синергической, когда связывание активатора с активным центром ПО увеличивает сродство фермента к субстрату, и наоборот (а 1, (3=1) [338].
Изучено влияние норадреналина на пероксидазное окисление о-дианизидина (рис. 42). В координатах Лайнуивера-Берка графики начальных скоростей при рН 5,5-7,0 имели вид семейства прямых, пересекающихся в общей точке в левом верхнем квадранте, что свойственно, для смешанного типа ингибирования. При рН 4,5-5,0 тип ингибирования ПО норадреналином изменялся и соответствовал полному конкурентному ингибированию. Константу конкурентного ингибирования К; определяли, откладывая экспериментальные данные в координатах (Кт(каж), [НА]) [338].
Витамин при рН 4,5-6,0 не ингибировал фермент в реакциях пероксидазного окисления ОДН и АК. Тогда как при рН 6,5 наблюдался конкурентный, а при рН 7,0-8,0 смешанный тип ингибирования ПО (рис. 43). Витамин конкурентно ингибировал ПО в реакциях окисления аскорбиновой кислоты при рН 6,5-7,5.
Описание технологической схемы использования экстрактивных антиоксидантов в солодовенном производстве
Предложена принципиальная схема использования отходов солодовенного и пивоваренного производства при солодоращении пивоваренного ячменя (рис. 73), состоящая из следующих стадий: 1) замачивание отходов солодовенного производства в воде с целью получения экстрактов антиоксидантов; 2) отделение осадка от экстракта; 3) применение экстракта при замачивании с целью активации биохимических процессов; 4) применение экстракта при солодоращении с целью снижения потерь сухих веществ на дыхание и ростовые процессы; 5) удаление влаги из осадка в барабанной сушилке и применение его в качестве кормовой добавки при кормлении сельскохозяйственных животных.
Согласно схеме экстракт из солодовых ростков, содержащий эндогенные стимуляторы роста, целесообразнее использовать при замачивании пивоваренного ячменя с целью повышения прорастаемости зерна и сокращения потерь сухих веществ. Экстракт из хмелевой дробины как источник фенольных антиоксидантов эффективнее использовать после трех суток солодоращения для снижения дыхательных и ростовых процессов.
Для повышения стабильности коллоидов и улучшения вкуса пива используют пищевые добавки - антиоксиданты: аскорбиновая кислота (Е 300) и ее соли (Е 301); изоаскорбиновая кислота (Е 315) и ее соли (Е 316); а-токоферол (Е 307) и др. Среди пищевых синтетических антиоксидантов наибольшее распространение получили производные фенолов, например, эфиры галловой кислоты (Е 310-313), ионол (Е 321), тетробутилгидрохинон (Е319).
Растительное сырье характеризуется высоким содержанием таких антиоксидантов, как токоферолы, аскорбиновая кислота, глутатион, каротиноиды, флавоноиды, полифенольные соединения и др. [445, 449-452]. Большой популярностью в технологии продуктов питания пользуются природные антиоксиданты, имеющие ряд преимуществ по сравнению с синтетическими соединениями. Перечислим только основные достоинства природных антиоксидантов: безвредность для организма человека; предотвращение окисления всех натуральных составляющих; оказание антиоксидантного эффекта при малых дозировках; дешевизна и простота в использовании.
На наш взгляд, отходы солодовенного и пивоваренного производства могут рассматриваться как перспективный и доступный источник антиоксидантов и биологически активных веществ, регулирующих окислительные процессы. Не исключено, что представленные в данной работе результаты могут быть полезны при разработке технологии использования низкомолекулярных антиоксидантов из отходов для ингибирования окислительных процессов при производстве солода и пива, а также в кормопроизводстве для составления пищевого рациона для сельскохозяйственных животных.
Физиолого-биохимические исследования покоя и прорастания семян несут обширную информацию о свойствах растений. Они, в частности, предоставляют возможность оценить пластичность метаболизма семян, а также позволяют прогнозировать жизнеспособность, посевные и технологические качества зерна. В настоящей диссертационной работе приведен анализ результатов экспериментальных исследований, посвященных роли окислительных процессов и антиоксидантной системы в физиолого-биохимических механизмах хранения, прорастания и переработке зерновых культур.
Семена, находящиеся в состоянии покоя, способны переживать неблагоприятные условия внешней среды. Действие любого естественного стресса на такую стабильную систему, как семя, незначительно. Однако несоблюдение условий хранения приводит к снижению качества и потере всхожести семян зерновых культур. В настоящей работе было показано, что одной из причин гибели семян в результате неправильного хранения являются необратимые изменения в клеточных мембранах, инактивация ферментов и снижение активности антиоксидантной системы защиты растений. Следствием нарушения целостности мембран является повышение активности протеолитических ферментов зерна под воздействием стресса. Поэтому снижение активности антиоксидантных ферментов объясняется как снижением метаболических процессов, так и инактивацией молекулы в результате действия свободных радикалов. Интересно отметить, что использованные в эксперименте сорта по-разному реагировали на стрессовое воздействие при хранении.
Сдвиг равновесия в сторону прооксидантов является наиболее информативным показателем для оценки степени влияния различных факторов на организм. В то же время активация ПОЛ представляет собой один из первых неспецифических звеньев в общей стресс-реакции организма и может инициировать включение других механизмов защиты. Состояние антиоксидантно-прооксидантного равновесия можно рассматривать как показатель жизнеспособности семян и устойчивости их к условиям окружающей среды.
Семена многих растений требуют для прорастания определенного периода послеуборочного дозревания. Для многих видов семян в этот период между сбором и прорастанием необходимо воздействие температурного стресса в течение определенного времени. В результате наших исследований было показано, что период повышения всхожести семян в результате дозревания коррелировал с небольшим повышением концентрации продуктов перекисного окисления липидов и повышением активности антиоксидантной системы. В начале ускоренного старения покой семян прерывается, так как тепловой стресс активирует окислительные и ростовые процессы. Снижение показателей всхожести и силы роста при длительном хранении семян указывает на окончание процессов послеуборочного дозревания, а также на нарушение антиоксидантно-прооксидантного равновесия.
Ухудшение качества семян растений разных видов при хранении может быть обусловлено нарушениями в различных процессах и структурах, но чаще всего оно связано с комплексом изменений. Длительное хранение зерна в неблагоприятных условиях приводит к снижению активности антиоксидантных ферментов вследствие катаболических процессов, происходящих в семенах по мере их старения. В результате активации свободно-радикальных реакций происходит окислительная модификация белков и ферментов, приводящая к потере их физиологических функций и атакуемости со стороны протеолитических ферментов.
Похожие диссертации на Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке
