Содержание к диссертации
Введение
1. Вакцины 11
1.1. Типы вакцин 12
1.2. Съедобные вакцины .13
1.2.1. Критерии мукозных вакцин на основе трансгенных растений 14
1.2.2. Съедобные вакцины на основе растительного материала 15
1.2.3. Вакцина против гепатита В 16
2. Основы функционирования мукознои иммуной системы человека 19
3. Вирусный гепатит в 22
3.1. Краткая характеристика вирусного гепатита В 22
3.2. Структура генома гепатита В 23
3.3. Строение и функции внешней оболочки вируса гепатита В 27
3.4. Репликация и размножение вируса гепатита В в гепатоцитах 28
4. Получение трансгенных организмов 31
4.1. Генетическая трансформация растительных объектов 31
4.2. Методы получения трансгенных растений 38
4.2.1. Агробактериальная трансформация . 38
4.2.2.Трансформация методом микроинъекций 46
4.2.3. Электропорация 47
4.2.4. Биобаллистическая трансформация 48
4.2.5. Трансформация с помощью липосом— 48
4.3. Агробактериальная трансформация растений томата 49
4.4. Способы генетической модификации животных ..51
4.5. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач
исследования 52
Экспериментальная часть 55
5. Объекты и методы исследования 55
5.1. Растительный материал 55
5.2. Приготовление сред для проращивания семян и пересадки трансформированых проростков 55
5.3. Обработка и проращивание семян 55
5.4. Бактериальный штамм Agrobacterium tumefaciens используемый для трансформации растений томата . 56
5.5. Культивирование Agrobactetium tumefaciens 59
5.6. ПНР анализ бактериальной ДНК колоний 60
5.7. Трансформация эьссплантов и пересадка их на селективную среду 61
5.8. Селекция и адаптация эксплантов 61
5.8.1. Селективный отбор проростков на среде с канамицином и пересадка их в сосуды с влажной фильтровальной бумагой 61
5.8.2. Адаптация проростков, прошедших селекцию на канамицине, к условиям внешней среды 62
5.8.3. Пересадка проростков в почвенную среду 62
5.9. Трансформация растений, выращенных в почве 62
5.10 Высадка растений в теплицу и уход за ними 63
5.11. Сбор и обработка плодов 63
5.12. ПНР анализ ДНК, выделенного из листьев и плодов растений, прошедших селекцию на канамицине 64
5.13. ИФА экстрактов полученных из листьев и плодов трансформированных растений томата 65
5.14. Использованные реактивы. 66
6. Результаты исследований ...67
6.1. ПНР анализ плазмидной ДНК, выделенной из бактериальных колоний 67
6.2. Получение трансформированных растений и отбор трансформантов по активности селективного гена nptll 68
6.2.1. Получение проростков растений томата 68
6.2.2. Трансформация эксплантов ..69
6.2.3. Отбор трансформированных растений на селективной среде 69
6.3. Адаптация растений, прошедших селекцию на канамицине, к условиям внешней среды 71
6.3.1. Адаптация к внешней атмосфере 71
6.3.2. Адаптация к почвенной среде 72
6.4. Высадка растений в грунт и уход за ними 73
6.5. Молекулярно-генетические доказательства трансформации 75
6.5.1. ПЦР-анализ плодов трансформированных растений томата поколения То 76
6.5.2. Иммуноферментный анализ 79
6.5.2.1. Иммуноферментный анализ листьев растений томата поколения То 79
6.5.2.2. Иммуноферментный анализ плодов растений томата поколения То 83
6.5.2.3. Иммуноферментный анализ листьев растений томата поколения Ті 86
6.5.2.4. Подтверждающий иммуноферментный анализ экстрактов плодов растений томата поколения| 89
Обсуждение 98
Заключение 105
Выводы . 107
Литература
- Критерии мукозных вакцин на основе трансгенных растений
- Строение и функции внешней оболочки вируса гепатита В
- Агробактериальная трансформация
- Бактериальный штамм Agrobacterium tumefaciens используемый для трансформации растений томата
Введение к работе
Актуальность проблемы Одним из перспективных и быстро развивающихся направлении растительного "биофарминга" является использование трансгенных растений в качестве продуцентов съедобных вакцин нового поколения, создающих перспективу широкой и эффективной иммунизации населения Съедобные вакцины обладают существенными преимуществами во-первых, они дешевы и относительно легки в получении, что позволит распространять их в страны с разным уровнем экономического благополучия, во-вторых, применение оральных вакцин сводит к минимуму риск возникновения аллергических реакций Съедобные вакцины являются более безопасными, так как не содержат живых ослабленных патогенных организмов Кроме того, в отличие от инъекционных вакцин процесс применения оральных вакцин не вызывает болевых ощущений, что немаловажно при вакцинации детей Инъекционные вакцины в основном индуцируют системный иммунитет, в то время как иммунизация слизистой часто приводит к стимуляции не только мукозного, но и системного иммунитета
Гепатит В очень распространенная и опасная вирусная инфекция Каждый год в мире фиксируется 50 млн заболевших только острой формой гепатита В Из них до 600 тыс больных умирает [Амосов, 2006] Число носителей этого заболевания возросло за 10 лет с 200 млн до 300 млн человек [Purcell, 1994, Thanavala et al, 1995]
В 1992 году появилось первое сообщение об экспрессии поверхностного белка гепатита В HBsAg в трансгенных растениях табака [Mason, 1992] Позже проводились эксперименты с использованием других растений в качестве продуцентов основного поверхностного антигенного белка гепатита В, так, в частности, польские ученые создали вакцину на основе трансгенных растений люпина [Kapusta, 1999] Однако, применение таких вакцин в широкой практике вызывает некоторые затруднения, одним из которых является непривлекательность для человека табака и люпина в качестве пищевого продукта Для создания эффективной и в то же время приятной при употреблении в пищу съедобной кандидатной вакцины против гепатита В желательно было выбрать растительный объект, который можно употреблять в сыром виде Кроме того, этот растительный объект должен культивироваться почти во всех климатических зонах земного шара и иметь низкие затраты при выращивании Растения томата удовлетворяют этим условиям Поэтому последние работы по созданию съедобной вакцины против гепатита В часто осуществляются на основе томата [Salyaev et al, 2004, Shchelkunov et a!, 2004, Щелкунов и др , 2004, Щелкунов и др , 2005, Xiao-Ming et al, 2007]
Большинство эти\ работ основано на введении в геном растения гена S, который кодирует основной антигенный поверхностный белок вирусной
частицы гепатита В HBsAg Однако некоторые исследования показывают, что при совместной экспрессии генов S и preS2 иммунный ответ проявляется сильнее Из этого следует, что при введении двух этих генов в геном растения, можно получить более эффективную вакцину против гепатита В Для большей стабильности и увеличения содержания антигенного белка в ряде работ используют сигнальную последовательность HDEL (гистидин-аспартат-глутамат-лейцин), адресующую синтезируемый антиген в эндоплазматический ретикулум Поэтому в настоящей работе в качестве целевого гена использована последовательность preS2-S-HDEL
Цель и задачи исследований Целью настоящей работы явилось получение и биохимическая характеристика трансгенных по гену preS2-S-HDEL растений томата, продуцирующих основной аиппенный белок вируса гепатита В HBsAg
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи
Подобрать необходимый состав питательных и селективных сред для выращивания Agrobactermm tumefauem с плазмидами, несущими селективный ген nptH и целевой ген preS2-S-HDEL
Провести генетическую трансформацию эксплантов томата геном preS2-S-HDEL
Провести селекцию полученных эксплантов на среде с канамицином
Подобрать методику адаптации прошедших селекцию на канамицине трансформированных проростков к условиям внешней атмосферы и субстрата
Провести ПЦР и иммуноферментные анализы для установления инсерции и экспрессии целевого гена preS2-S-HDEL
Получить плоды трансформированных растений поколения Т0 и Т|, содержащие антигеный белок гепатита В HBsAg
7, Определить влияние степени зрелости плодов на содержание в них основного антигенного белка гепатита В
Научная новизна Проведена успешная трансформация растений томата геном preS2-S-HDEL, который кодирует поверхностный белок оболочки вирусной частицы гепатита В и сигнал адресации в эндоплазматический ретикулум Разработана эффективная методика адаптации растений, подвергшихся генетической трансформации, к условиям внешней среды Получены плоды трансформированных растений поколений Т0 иТ|, содержащие поверхностный антигенный белок гепатита В
Теоретическая и практическая значимость работы Результаты работы открывают перспективу дальнейших исследований в области создания кандидатной вакцины орального применения на основе трансгенных растений томата Плоды генетически модифицированных геном preS2-S-HDEL растений томата в дальнейшем могут быть использованы в
предклинических и клинических испытания, как кандидатная вакцина Полученный экспериментальный материал может быть полезным для создания съедобной вакцины против гепатита В
Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликовано 4 работы Результаты исследований по теме диссертации были представлены на международной научной конференции «Современная физиология растений от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), а также на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Экология в современном мире взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007) и на научной сессии СИФИБР СО РАН (2008)
Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописною текста, содержит 5 таблиц и 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и библиографии Библиография включает 165 наименования, из них 41 на русском языке
Критерии мукозных вакцин на основе трансгенных растений
В последние годы внимание специалистов - вакцинологов было обращено на неинфекционные формы вакцинации (мукозные вакцины). Мукозные вакцины способны создавать "иммунитет входных ворот", предотвращая тем самым размножение патогенных микроорганизмов в слизистой оболочке и их проникновение в другие ткани человека. Проекты под общим названием "Съедобные вакцины" ведутся сравнительно недавно. Идея была запатентована в 1990 году. Однако применение съедобных вакцин может сопровождаться развитием иммунологической толерантности организма на патогенный агент [Strobel, 1999]. Так, например, при ежедневном поступлении с пищей антигенов возможно ослабление иммунного ответа организма. Для того чтобы избежать подобного эффекта ведутся интенсивные исследования по повышению эффективности иммунизации "съедобными вакцинами". Одним из факторов способным повысить эффективность мукозных вакцин могут выступать некоторые белки играющие роль адъювантов [Foss, 2000]. Одним из таких белков является интерлейкин-18 (ИЛ-18). Интерлейкин-18 постоянно образуется в организме человека и участвует в формировании врожденного и приобретенного иммунитета. Его использование в качестве адъюванта при интраназальной вакцинации лабораторных животных, в частности мышей, позволило избежать иммунологической толерантности [Bradney, 2002; Eaton, 2003]. В связи с этими результатами группой ученых были получены трансгенные растения табака, которые являлись продуцентами человеческого интерлейкина-18 [Турчинович, 2004].
Другими веществами, способными увеличить эффективность мукозных вакцин, могут быть полимерные нано- и микрочастицы, способные защитить и увеличить время пребывания антигенов в кишечнике. В роли таких полимерных систем могут выступать иммуноглобулины, микробные адгезины и М-клеткоспецифические лектины. В настоящее время идет активный поиск и оценка подобных нано- и микрочастиц [Vyas et al., 2007].
Создание мукозных вакцин было бы невозможно без современных знаний вирусологии, иммунологии, знания последовательностей генов, кодирующих поверхностные белки антигены и создания гетерологических систем экспрессии этих генов в микроорганизмах [Рекославская и др., 2001]. 1.2.1. Критерии мукозных вакцин на основе трансгенных растений I. Создание высокоэкспрессивных конструкций для усиления активности мРНК; П. использование растений разных видов и Семейств для отбора наиболее эффективной экспресирующей системы; III. подбор кодонов в последовательностях с учетом встречаемости тРНК в растениях; IV. проведение стабильной агробактериальной трансформации, при которой будет осуществляться передача необходимого признака потомству. 1.2.2. Съедобные вакцины на основе растительного материала
Научными исследованиями показана перспективность использования трансгенных растений как продуцентов эпитопов болезнетворных агентов животных и человека для оральной иммунизации [Mason, 1995]. Для получения рекомбинантных белков также широко используются клетки бактерий, дрожжей, млекопитающих и насекомых. Однако такие системы имеют ряд существенных недостатков. В клетках прокариот не происходят посттрансляционная модификация и фолдинг полипептидных цепей многих эукариотических белков. Клетки дрожжей, млекопитающих и насекомых имеют эти недостатки в значительно меньшей мере, но их использование в качестве биопродуцентов ограничено высокой себестоимостью выхода рекомбинантных белков [Russel, 1999]. К тому же клетки животных MorvT нести в себе опасные для человека вирусы и прионы, печально известные нам по такому заболеванию как "коровье бешенство".
Ученые пришли к выводу, что в качестве продуцентов антигенов экономически выгоднее использовать трансгенные растения по сравнению с трансгенными животными, культурами клеток млекопитающих или дрожжами, так как наибольший вклад в стоимость полипептидов, получаемых из растений, вносит их очистка. Необходимость в ней отпадает при экспрессии целевых генов в съедобных тканях растений и при их использовании в качестве съедобных вакцин. При этом клеточная стенка растений выступает частично в роли защитной капсулы для антигена тем самым, обеспечивая проникновение необходимого количества антигена в неизмененном состоянии в кишечник. Кроме того, перенос фрагментов экзогенной ДНК в растительный геном и регенерация у растений происходят значительно проще по сравнению с животными [Daniell et al., 2001; Поздняков, 2005].
Строение и функции внешней оболочки вируса гепатита В
Вирус гепатита В с помощью своих поверхностных рецепторов осуществляет прикрепление и проникновение в клетки печени (гепатоциты). После того, как вирусная частица проникла в цитоплазму гепатоцита, происходит освобождение ее от оболочки, затем геном вируса попадает в ядро клетки. В ядре происходит удлинение короткой цепи ДНК вируса и репарация ковалентно замкнутой кольцевой ссДНК, при этом клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза на вирусной ДНК-матрице осуществляет синтез РНК размером 3,5 тыс. пар нуклеотидов. Этот транскрипт с дополнительными концевыми повторами содержит полную РНК-копию вирусного генома и называется прегеномом. Также осуществляется транскрипция коротких мРНК длиной 2,4; 2,1 и 0,7 тыс. пар нуклеотидов для обеспечения синтеза всех вирусных белков в цитоплазме. Прегеном, обратная транскриптаза, вирусная ДНК-полимераза во временно образованном капсиде переносятся в цитоплазму клетки, где происходит обратная транскрипция прегенома с участием вирусной обратной транскриптазы, и синтезируется полноразмерная длинная цепь вирусной ДНК. На матрице длиной цепи происходит синтез короткой цепи. После синтеза длиной цепи прегеном и временный капсид разрушаются. Вирусная ДНК, обратная транскриптаза и ДНК-полимераза заключаются в коровый капсид из НВс и НВе белков, которые синтезировались в цитоплазме. Вновь образовавшийся вирусный комплекс может снова пойти в ядро, где будет осуществляться повторная репликация генома вируса. Также возможен вариант, когда коровый нуклеопротеиновый комплекс с недостроенной короткой цепью окажется в области эндоплазматического ретикулума клетки, где будет собираться в вирусную частицу. Во время сборки вирусной частицы происходит упаковка сердцевины вируса в гликозилированую внешнюю оболочку, состоящую из среднего, большого и основного белков. Эти белки синтезировались за счет трансляции коротких вирусных мРНК. Собранная вирусная частица транспортируется через мембрану и выходит из клетки [DonGanem, 1996].
Координация вирус-клеточного взаимодействия на этапах репликации вируса в клетки, по-видимому, осуществляется на уровне трансактивации промоторов вирусного генома с участием клеточно-специфическцх белковых факторов.
Размножение вируса в клетке и его выход не вызывают прекращения жизнедеятельности клетки и ее гибели, так как все собственные внутриклеточные процессы метаболизма в гепатоцитах идут параллельно [Don Ganem, 1996]. Повреждение гепатоцитов происходит из-за накопления избытка поверхностных белков вируса гепатита В.
Из всего выше изложенного становится очевидным, что при создании вакцины против гепатита В следует оперировать синтезом поверхностных антигенов вириона. Это субъединица S-основной антиген HBsAg, preS2 и preSl субъединицы. Поскольку, как уже упоминалось, в научной литературе имеются указания на то что субъединица preS2 усиливает иммуногенные свойства основной субъединицы S , очевидно более предпочтительным будет строить вакцину на основе preS2-S комплекса. В этом случае больше вероятность получения достаточной иммуногенности вакцины. Для увеличения количества и усиления стабильности антигена в клетках трансформированных растений в генетической конструкции также крайне желательно присутствие и нуклеотидного участка, кодирующего С-концевой сигнал HDEL (гистидин-аспартат-глутамат-лейцин), необходимого для адресования антигенного белка в эндоплазматический ретикулум.
Поэтому при синтезе целевого гена, синтезированного в ГНЦ " Вектор" и переданного нам для генетической трансформации, избран вариант гена preS2-S с последовательностью HDEL.
Одним из существенных достижений современной биотехнологии является генетическая трансформация, в частности перенос чужеродных генов в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками. Уже сегодня во многих лабораториях мира, в том числе и в России, с помощью методов генетической инженерии созданы принципиально новые трансгенные растения, животные и микроорганизмы, имеющие практическое значение [Лещинская, 2000].
Но, несмотря на успехи, достигнутые в получении генетически модифицированных организмов и в особенности трансгенных растений, существуют некоторые аспекты, к которым следует относиться с осторожностью. Поскольку генетическая трансформация приводит к изменению ядерного генома растения, то она сопряжена с некоторыми нежелательными проблемами. Например, при получении трансгенных растений в сельскохозяйственных масштабах существует опасность утечки трансгена в окружающую среду в результате переопыления с близкородственными дикорастущими видами. Не исключено также появление непредусмотренных нежелательных свойств, в том числе и в продукции генетически измененных организмов.
Агробактериальная трансформация
Создание трансгенных растений основано на переносе в геном растений различных генов из вирусов, микроорганизмов, животных, человека и осуществляется с помощью методов генной инженерии.
Уникальным примером горизонтального переноса ДНК между различными царствами живого мира является агробактериальная трансформации.
Агробактерия представляет собой мезофильный организм, обитающий в почве. Это короткие подвижные грамотрицательные палочки с перитрихиальными жгутиками. Агробактерии являются аэробами, формируют на своей поверхности полисахаридную капсулу, но не образуют эндоспор. Оптимальная температура роста для них 25-30С [Kerr, 1992]. Агробактерии разделяют на три большие подгруппы: A. tumefaciens, A. rhizogenes и A. rubi. В соответствии с различиями по переработке вторичных метаболитов, которые синтезируются в корончатых галлах, агробактерии стали делить на два семейства: с октопиновыми плазмидами и нопалиновыми плазмидами. Круг хозяев фитопатогенов рода Agrobacterium необычайно широк. Он включает в себя 596 видов двудольных покрытосемянных, 5 видов однодольных покрытосемянных и 42 вида голосемянных. Исследования возможности трансформации агробактериями низших растений дали отрицательный результат [De Cleen, 1976].
Однако у агробактерии существует некоторая избирательность при заражении растений, все зависит от Ti-плазмиды. Так, например, некоторые штаммы (A. vitis), выделенные из винограда, не инфицируют подсолнечник, табак, томаты [Knauf et al., 1982].
Эффект корончатых галлов, образование которых вызывают агробактерии, описан еще древнегреческим ученым Аристотелем. Первые же современные исследования, посвященные агробактерии, появились более ста лет назад. Бактериальная этиология этого заболевания была открыта в 1907году [Smith et al.,. 1907].
В 1969 году было доказано то, что свойство вирулентности у агробактерии может передаваться от одного вида к другому [Kerr, 1969]. В 1977 году было доказано то, что корончатый галл у растений возникает в результате включения фрагмента Ti-плазмиды агробактерии в растительный геном [Chilton et al., 1977]. Данный фрагмент Ti-плазмиды получил название Т- ДНК. Т-ДНК ограничена двумя прямыми повторами, которые состоят из 25 нуклеотидов. Эти повторы обозначаются RB-правый повтор и LB-левый повтор. То, что находится между этими повторами, переносится в растительный геном. Механизм интеграции Т-ДНК был изучен путем секвенирования нуклеотидных последовательностей в зоне контакта Т-ДНК с ДНК растений, затем было проведено сопоставление результатов секвенирования с теми же участками ДНК, но до начала инсерции [Cheysen, 1991]. Исследования показали, что интеграция Т-ДНК не является сайт-специфичной и представляют собой интеграцию по типу рекомбинации "незаконного" типа; при интеграции Т-ДНК в месте инсерции происходят делеции 13-73 пар нуклеотидов ДНК хозяина. При интеграции правый край Т-ДНК очень консервативен вплоть до нуклеотида, который прилегает к месту рестрикции у плазмиды бактерии. Левый край Т-ДНК при интеграции теряет от 3 до 100 нуклеотидов, кроме того, наблюдается гомология с прединсерционным участком, состоящим из пяти прилегающих нуклеотидов [Tinlandetal., 1995].
Имеются данные о том, что перенос Т-ДНК из бактерии в растительную клетку занимает до 30 мин [Yusibov et al., 1994]. Ті- плазмида обладает двумя системами переноса генетической информации.
Первая система - представлена vir генами. Эти гены отвечают за контроль синтеза Т-ДНК, перенос ее в растение. Комплекс vir генов включает в себя семь локусов и регулируется рН, ацетосирингоном, сахарозой. Вторая система ответственна за перенос Ті- плазмиды между бактериями и плазмиды RSF1010 в растение. Данная система носит название -oriT/tra и регулируется опинами. Система oriT/tra имеет три области возле региона асе [Cook et al., 1997].
Область vir генов состоит из шести комплементарных групп vir A, virB, virC, virD, virE, virG. Кроме генов вирулентности на Ті- плазмиде находятся хромосомные гены: chvA, chvB, chvE, chvD, chvG, miaA, ros, pscA, ivr. Они также участвуют в процессе трансформации. Первые три гена обусловливают способность прикрепления агробактерии к поверхности клетки хозяина.
В состав Т-ДНК входят гены, ответственные за синтез индолилуксусной кислоты, цитокининов, опинов. К этим генам относятся гены ocs, которые ответственны за синтез октопина, nos - обеспечивают синтез нопалина и гены asc - обусловливают продукцию агроцинопина. Кроме того, в Т-ДНК присутствуют гены roi - ингибиторы корнеобразования (root inducing), shi - ингибиторы побегов (shoot inducing). Комплекс генов vir имеет особое значение для переноса генетической информации в организм растения. Он кодирует белки, необходимые для интеграции Т-ДНК, причем эти белки синтезируются не в клетке хозяина, а в самой бактерии, так как Т-ДНК, в отличие от других мобильных элементов, таких как транспозоны и ретровирусы, не содержит гены, отвечающие за синтез интеграционных белков. Индукция кластера vir генов осуществляется воздействием вещества образующегося у растений при повреждении - ацетосирингона. В некоторых случаях индукция вирулентных генов может осуществляться также под воздействием низкого рН и некоторых моносахаров. Ацетосирингон, взаимодействуя с VirA белком, который располагается на мембране бактерии, запускает процесс экспрессии vir генов.
Экспрессия осуществляется под контролем белков VirA и VirG, а также белком, который кодируется локусом ros [Чумаков, 2001]. Основными белками вирулентности являются два типа белков: VirD2 и VirE2. Белок VirD2 представляет собой сайт-специфичную эндонуклеазу, которая совместно с белком VirDl распознает и разрезает пограничные последовательности Т-ДНК. В этом процессе также принимают участие белки VirCl, VirC2. После того как произошла рестрикция ДНК, VirD2 присоединяется фосфотирозиновой связью к 5 концу ssJIHK, которая переносится в растительную клетку [Citovsky et al., 1993].
Бактериальный штамм Agrobacterium tumefaciens используемый для трансформации растений томата
К настоящему времени по данным литературы одним из перспективных и быстро развивающихся направлений растительного "биофарминга" является использование трансгенных растений в качестве продуцентов съедобных (мукозных) вакцин нового поколения, создающих перспективу широкой и эффективной иммунизации населения [Мог et al., 1998]. с
Съедобные вакцины обладают существенными преимуществами: они дешевы и относительно легки в. получении,. применение оральных вакцин сводит к минимуму риск возникновения аллергических реакций. Съедобные вакцины не содержат живых ослабленных патогенных организмов, поэтому являются более безопасными. Кроме того в отличие от инъекционных вакцин процесс применения оральных вакцин не вызывает болевых ощущений, что немаловажно при вакцинации детей [Xiao-Ming et al., 2007].
В качестве производителей мукозных вакцин предлагался и исследовался широкий спектр живых организмов. Однако исследования показали перспективность использования трансгенных растений как продуцентов съедобных вакцин для оральной иммунизации животных и человека [Mason, 1995].
На сегодняшний день уже созданы и изучается ряд оральных вакцин на основе трансгенных растений, таких как картофель, салат, кукуруза, шпинат, люцерна, бананы, арабидопсис [Thanavala et al, 1995; Modelska et al, 1998; Wigdorovitz et al., 1999; Carrillo et al., 2001; Kong et al., 2001; Lauterslager et al, 2001; Dus Santos et al., 2002; Kumar et al., 2005] и другие растения. Получены вакцины против широкого спектра возбудителей
инфекционных заболеваний, таких как малярия [Turrpen et al., 1995], ящур [Carrillo et al., 1998], болезнь Норфолка [Mason et al., 1996], холеры [Мог et al., 1998], полиомиелита [Гендон, 2001], папилломы человека [Franconi et al., 2002; Warzecha et al., 2003], против СПИДа и гепатита В [Salyaev et al., 2004; Shchelkunov et al., 2006] и других. В настоящий работе сделана попытка путем генетической трансформации получить растения томата, продуцирующие основной антиген вируса гепатита В - HBsAg.
Об опасности и распространенности этого инфекционного заболевания говорят следующие цифры. Каждый год в мире фиксируется 50 млн. заболевших только острой формой гепатита В. Из них до 600 тыс. больных умирает. Из числа последних около 100 тыс. человек погибает от редких, особо фульминантных форм инфекции, смертность от которых достигает 70-90% [Амосов, 2006]. Число носителей этого заболевания возросло за последние 10 лет с 200 млн. до 300 млн. человек [Purcell, 1994; Thanavala et al., 1995].
Получением съедобной вакцины против гепатита В уже и ранее занимались различные исследователи [Mason, 1992; Ehsani, 1997; Kapusta, 1999; Thanavala et al., 2005]. Большинство этих работ основано на введении в геном растения гена S, который кодирует основной поверхностный белок вирусной частицы гепатита В. Однако некоторые исследования показывают, что при совместной экспрессии генов S и preS2 иммунный ответ проявляется гораздо сильнее [Jilg, 1998; Joung et al., 2007].
Из анализа литературы, как уже упоминалось в соответствующем разделе, считается перспективным также использование при трансформации последовательностей адресующих і синтезируемый антиген в эндоплазматический ретикулум (ЭПР), что должно увеличивать содержание антигена. Поэтому в данной работе была использована генетическая конструкция preS2-S-HDEL. В этой конструкции сигнал HDEL является адресирующей компонентой в ЭПР.
Для трансформации растений, в работе применена агробактериальная трансформация как более естественная для генетической модификации растений. Этот способ генетической трансформации успешно применяется многими исследователями.
Целью настоящей работы явилось получение и биохимическая характеристика трансгенных по гену preS2-S-HDEL растений томата, продуцирующих основной антигенный белок вируса гепатита В HBsAg.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Подобрать необходимый состав питательных и селективных сред для выращивания Agrobacterium tumefaciens с плазмидами, несущими селективный ген nptll и целевой ген preS2-S-HDEL. 2. Провести генетическую трансформацию эксплантов томата геном preS2-S-HDEL. 3. Провести селекцию полученных эксплантов на среде с канамицином. 4. Подобрать методику адаптации прошедших селекцию на канамицине трансформированных проростков к условиям внешней атмосферы и субстрата. 5. Провести ПЦР и иммуноферментный анализы растений томата для установления инсерции и экспрессии целевого гена PreS2-S-HDEL. 6. Получить плоды трансформированных растений поколений Т0 и Ть содержащих антигеный белок гепатита В HBsAg. 7. Определить влияние степени зрелости плодов на содержание в них основного антигенного белка гепатита В HBsAg.
