Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям является одной из важнейших проблем экологически безопасного растениеводства. Решению этой проблемы в значительной степени способствует познание механизмов взаимоотношений растений с организмами-фитофагами. Гидролитические ферменты насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов являются важным звеном при взаимодействии их с растениями, поскольку обеспечивают эффективное расщепление растительных полимеров, составляющих основу кормового субстрата. В тканях организмов-фитофагов выявлена активность различных типов гид-ролаз: катепсиноподобных и трипсиноподобных протеаз (Thie, Houseman, 1990; Michaud et al, 1993; Novillo et al, 1997), эндоглюкозидаз (Scrivener, Slaytor, 1994; Watanabe et al, 1997; Tokuda et al, 1997), целлобиогидролаз и бета-глюкозидаз (Chararas et al, 1983; Xue et al, 1999), альфа-амилаз (Khorram et al, 2010).
Соответственно, подавление активности гидролитических ферментов насекомых-вредителей представляет один из эффективных способов реализации механизмов защиты у растений. Известно, что в тканях различных видов растений обнаружены специфические молекулы (ингибиторы), способные нейтрализовать действие пищеварительных ферментов насекомых. Так, описано присутствие в растениях ингибиторов цистеиновых и сериновых протеаз (Конарев Ал., 2000; Валуева, Мосолов, 2002), ингибиторов целлюлаз различной природы (Sami, Shakoori, 2011), ингибиторов пектиназ (Bugbee et al, 1993; Wei et al, 2002; Akimitsu et al, 2004) и амилаз (Конарев Ал., 1991; Sivakumar et al, 2006). Более того, в ответ на контакт и поедание насекомыми происходит интенсивное накопление ингибиторов гидролаз как в пораженных, так и в интактных органах растений (Green, Ryan, 1972; Boulter, 1993; Zhao et al, 1996; Шпирная, 2006).
К настоящему времени накоплено значительное количество экспериментальных данных о структурно-функциональных особенностях ряда гидролаз, в первую очередь, ферментов млекопитающих, патогенных микроорганизмов (Thie, Houseman, 1990; Варфоломеев, Пожитков, 2000; Qin et al, 2007), получены сведения об участии ингибиторов этих ферментов в защитных реакциях растений (Gourinath et al, 2000; Lawrence, Koundal, 2002; Castro, Fontes, 2005; Bonfigetal,2010).
Однако молекулярный состав, физико-химические и биохимические свойства, физиологические функции гидролаз организмов - представителей класса насекомых пока малоизученны. Соответственно, и экспериментальные сведения о составе, свойствах, функциях ингибиторов этих ферментов из растительных тканей также весьма ограничены. Исследование гидролаз патогенов и специфичных им ингибиторов из растительных тканей представляет интерес как с точки зрения познания молекулярных механизмов взаимодействия важнейших компонентов наземных экосистем «растение-фитофаг», так и с позиции поиска эффективных и экологически безопасных методов защиты культурных растений от насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов.
Цель и задачи исследований
Цель работы заключалась в выявлении закономерностей функционирования комплекса «гидролитический фермент - ингибитор» как одного из важных физиологических звеньев взаимодействия растений с насекомыми-вредителями.
В задачи исследования входило:
выделение, очистка и характеристика гидролитических ферментов колорадского жука;
выделение из листьев картофеля специфичных к гидролазам насекомых белковых ингибиторов, характеристика их состава и свойств;
исследование активности и молекулярной гетерогенности гидролитических ферментов колорадского жука в различных условиях обитания насекомых;
исследование уровня активности ингибиторов экзогенных гидролаз в тканях картофеля различных сортов и при действии препаратов-биорегуляторов.
Необходимым условием выполнения поставленных задач являлась постановка доступного метода выделения и очистки гидролитических ферментов, для реализации которого был выбран аффинный сорбент на основе полиакри-ламидного геля со специфическими лигандами.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование специфических белковых молекул, обеспечивающих трофические связи фитофага и растительного организма. Впервые определен молекулярный состав и измерены физико-химические параметры молекул пектиназ, целлюлаз из личинок колорадского жука, выделены и охарактеризованы специфичные ферментам белковые ингибиторы из тканей картофеля. Впервые получены данные о полном подавлении действия амилаз, протеиназ, целлюлаз при питании личинок насекомых листьями томатов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые экспериментальные сведения, раскрывающие молекулярные механизмы взаимодействия важнейших компонентов наземных экосистем: насекомыхфитофа-гов и растений. Выделены и подробно охарактеризованы специфические молекулы ферментов, представляющие гидролитический комплекс колорадского жука - наиболее опасного насекомого-вредителя картофеля. Получены оригинальные данные о молекулярном составе и физико-химических свойствах ингибиторов из растительных тканей, подавляющих активность протеиназ, амилаз, пектиназ вредителя. Для очистки гидролитических ферментов и их белковых ингибиторов разработаны и использованы новые аффинные сорбенты на основе полиакриламидного геля. Получены новые оригинальные данные об изменении уровня активности гидролаз, их молекулярной гетерогенности в зависимости от условий обитания насекомых.
Результаты исследований вносят существенный вклад в представления о механизмах взаимодействия растений с организмами-фитофагами и могут быть использованы для разработки новых, экологически безопасных способов защиты сельскохозяйственных культур от насекомых-вредителей и патогенных микроорганизмов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в т.ч. 5 - в изданиях, включенных в список ВАК РФ. Материалы диссертации доложены на Международных и Всероссийских научных конференциях: «Устойчивость организмов к неблагоприятным условиям внешней среды» (Иркутск, 2009); «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010); «Растение и стресс» (Москва, 2010); «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2010); «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); «Био-мика - наука XXI века» (Уфа, 2011); «Экобиотех» - 2011 (Уфа, 2011).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), выводов и списка использованной литературы, включающего 190 наименований, в том числе 160 - в зарубежных изданиях. Работа изложена на 117 страницах и содержит 12 таблиц и 32 рисунка.
