Содержание к диссертации
Введение
1. Подавление активности чужеродных гидролитических ферментов - один из механизмов устойчивости растений 8
1.1. Протеолитические ферменты и амилазы патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей культурных растений
1.2. Растительные белки - ингибиторы протеиназ и амилаз: биохимическая характеристика, активность и физиологические функции
1.2.1. Свойства ингибиторов различных семейств 15
1.2.2. Физиологические функции ингибиторов протеиназ и а- амилазы из растений 27
1.3. Перспективы использования ингибиторов чужеродных гидролаз в селекции и растениеводстве 39
2. Материалы и методы 44
2.1. Объекты исследований 44
2.2. Материалы и реактивы 44
2.3. Методы исследований 45
2.3.1. Определение активности протеолитических ферментов 46
2.3.2. Определение активности ингибиторов гидролаз 47
2.3.3. Определение концентрации белка 47
2.3.4. Математическая обработка результатов 48
3. Результаты и обсуждение 49
3.1 Определение активности гидролитических ферментов и их ингибиторов по гидролизу субстратов в агарозном геле (разработка методов) 49
3.1.1. Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов 49
3.1.2. Определение активности амилаз и их ингибиторов 56
3.2. Функционирование системы «гидролазы насекомых - белковые ингибиторы растений» при различных физиологических состояниях растительного организма
3.2.1. Выделение, очистка, активность, субстратная специфичность протеолитических ферментов личинок колорадского жука
3.2.2. Подавление протеолитической и амилазной активности личинок колорадского жука белками-ингибиторами из растений
3.3. Влияние факторов различной природы на активность ингибиторов протеиназ, ингибиторов амилаз в тканях растений 77
Заключение 89
Литература 93
- Растительные белки - ингибиторы протеиназ и амилаз: биохимическая характеристика, активность и физиологические функции
- Перспективы использования ингибиторов чужеродных гидролаз в селекции и растениеводстве
- Определение активности протеолитических ферментов
- Функционирование системы «гидролазы насекомых - белковые ингибиторы растений» при различных физиологических состояниях растительного организма
Введение к работе
Способность приспосабливаться к конкретным условиям (адаптивность)
- одно из важнейших свойств растительного организма. На уровне генотипа первостепенную роль в адаптации играют гены - регуляторы, управляющие кластерами структурных генов, на уровне фенотипа - кодируемые ими белки.
Адаптивные изменения в структуре и функциях клетки заложены во множественности локусов и в аллельной структуре гена, что обеспечивает в поколениях адекватные условиям произрастания популяций варианты адаптивных белков, таких как, ферменты, шоковые белки и т.д. К этой функциональной группе белковых молекул относятся и белки-ингибиторы, способные подавлять активность гидролитических ферментов, в первую очередь, протеиназ и амилаз. Такие белки обнаружены в семенах и вегетативных органах культурных растений различных семейств: пасленовых (Ishikawa et al.,1994; Gruden et al., 1997; Heibges, Salamini., 2003), бобовых (Norioka et al.,1988; Hung et al.,1994), злаковых (Mundy, Svendsen 1983; Ohsubo, 1989) и др.
Широкое распространение ингибиторов гидролаз и их содержание в значительных количествах в тканях растений позволяют говорить о них как об одном из важных звеньев в регуляции различных физиологических процессов. Кроме выполнения защитных функций, они служат регуляторами активности эндогенных ферментов в онтогенезе. В последние годы их используют как генетические маркеры в решении проблем эволюции, систематики, сортовой идентификации и иммунитета, а также как перспективные препараты для медицины (Мосолов, 1983; Валуев, Сытов, 2001; Конарев, 2002). Белковые ингибиторы и их природные мишени
- протеиназы, амилазы, эндополигалактуроназы и другие гидролазы насекомых, микроорганизмов и млекопитающих являют собой яркий пример сопряженной эволюции растений и фитофагов на молекулярном уровне (Konarev, 1996).
Как известно, ключевую роль в усвоении и мобилизации питательных веществ растений животными, микроорганизмами играют гидролитические ферменты, в т. ч. амилазы и протеиназы (Конарев, Фомичева, 1992; Мосолов, Валуева, 2002).
Предполагается, что одним из универсальных механизмов противостояния растений вредным насекомым и микроорганизмам-патогенам, является функционирование в растительном организме генетически детерминированной системы ингибиторов гидролитических ферментов. В практическом плане, в связи с проблемой устойчивости растений к патогенным микроорганизмам и насекомым - вредителям, большой интерес представляют белки-ингибиторы, способные подавлять активность экзогенных гидролитических ферментов (Бенкен, Мосолов, Федуркина, 1976; Конарев Ал.В., 1986; Валуева, 2002; 2004).
Показано, что искусственное введение генов ингибиторов протеиназ в неустойчивые растения приводит к появлению у них устойчивости к патогену (Johnson, Narvaez, Ryan, 1989; Duan et al.,1996; Irie et al.,1996). Обнаружена корреляция между наличием отдельных групп ингибиторов и устойчивостью растений к ряду грибных заболеваний, в том числе к головне и корневым гнилям (Кладницкая и др., 1994; Ибрагимов, Яруллина, 1996; Ибрагимов 1997).
Интересно отметить, что активность ингибиторов в растениях значительно изменяется при действии на них различных биотических и абиотических факторов. С. Рианом и его сотрудниками (Green, Ryan, 1971;1972; Ryan, 1976; 1976; 1987; Walker-Simmons, Ryan, 1984) было обнаружено, что поранение тканей личинками колорадского жука приводит к повышению активности ингибиторов протеиназ в листьях томатов и картофеля. Повреждение одного листа вызывало активацию ингибиторов по всем органам растений. Обработка клубней картофеля защитными препаратами биологического происхождения также вызывало длительное повышение активности в них ингибиторов протеиназ, что способствовало увеличению устойчивости клубней к действию возбудителей болезней (Яхин и др., 1998). Однако возможности искусственного стимулирования антигидролитической активности в растениях пока малоизучены и работы по этой тематике единичны. Новые сведения в этом плане позволят предложить принципиально новые подходы к поиску препаратов для защиты растений, стимулирующих естественные механизмы устойчивости растений.
Для получения конкретных сведений о физиологической роли белков -ингибиторов гидролаз растений необходимы детальные исследования, как самих ингибиторов, так и гидролитических ферментов организмов-фитофагов, на которые направлено их действие. Удобной моделью для этого может служить естественная система «гидролазы колорадского жука -белковые ингибиторы картофеля».
Колорадский жук Leptinotarsa decemlineata является опасным вредителем картофеля. Пищеварительные ферменты колорадского жука представлены различными типами протеиназ, амилаз (Brunelle et al., 1999; Jongsma, Bolter, 1997; Конарев, 2000). В тканях картофеля содержится большое количество ингибиторов гидролаз. Так, в клубнях на их долю приходится до 15-20% всех водорастворимых белков (Ryan et al.,1976). Среди белков-ингибиторов картофеля, обнаружены ингибиторы протеолитических ферментов различных классов - сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ, а также металлсодержащих карбоксипептидаз (Bryant et al.,1976; Keilova, Tomasek, 1976; Pompe -Novak et al., 2002; Ревина, Сперанская, Кладницкая, 2004). Дальнейшее исследование функционирования системы «гидролазы колорадского жука - ингибиторы картофеля» позволило бы получить ценный экспериментальный материал о физиологических и биохимических механизмах взаимоотношений насекомого-вредителя и растения.
Цель нашей работы - выявление закономерностей взаимодействия экзогенных гидролаз и растительных ингибиторов в системе «колорадский жук - картофель».
В ходе исследования нами были сформулированы следующие задачи:
- разработка методов определения активности гидролаз и их ингибиторов;
- определение уровня активности гидролитических ферментов в тканях личинок колорадского жука;
- определение уровня содержания ингибиторов гидролаз в тканях картофеля у сортов с различной степенью устойчивости к колорадскому жуку;
- исследование ингибиторов гидролаз колорадского жука у растений различных таксонов;
- исследование колебаний активности ингибиторов в клубнях и листьях картофеля при действии стрессовых факторов и препаратов - биорегуляторов.
Растительные белки - ингибиторы протеиназ и амилаз: биохимическая характеристика, активность и физиологические функции
Высшие растения выработали ряд эффективных механизмов, обеспечивающих защиту от стрессовых воздействий (Paulot, Holtzer, 1991; Roby, Торрап,1987). Одним из механизмов защиты является синтез растением различных белов, обладающих протекторным действием, к ним относятся ингибиторы гидролитических ферментов, способные подавлять активность протеаз и амилаз фитопатогенных микроорганизмов, насекомых вредителей (Дунаевский, Цыбина и др.,2005).
Широкое распространение ингибиторов в живой природе свидетельствует о том, что подавление протеолитической активности этими молекулами является универсальным способом регуляции метаболизма у всех организмов (Мосолов, 1971; 1983; Richardson, 1977; Laskowski, Kato, 1980; Валуева, Мосолов, 1995).
Ингибиторы гидролаз в тканях организмов представлены обширной группой различных полипептидов, способных образовывать с ферментами стехиометрические комплексы, что приводит к конкурентному ингибированию каталитической активности (Мосолов, 1983, Валуева, 2005).
Ингибиторы сериновых протеиназ взаимодействуют с ферментами по стандартному субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на поверхности специфическую структуру-"петлю связывания", в которой располагается расщепляемая ферментом пептидная связь Pi-Pi , образующая, так называемый, реактивный центр ингибитора (Bode, Huber, 1992). По концепции Ласковски (Laskowski, Kato, 1980), аминокислотный остаток Pi играет основную роль в реализации специфичности действия ингибиторов. Строение этого аминокислотного остатка должно отвечать требованиям субстратной специфичности фермента-мишени. Так, ингибиторы трипсиноподобных протеиназ содержат в этом положении остатки Лиз или Apr, ингибиторы химотрипсиноподобных протеиназ - остатки аминокислот с боковыми цепями гидрофобного характера (Лей, Фен, Тир, Мет, Трп), ингибиторы эластазы - Ала или Мет. Кроме того, известны так называемые "двуглавые" ингибиторы, у которых в составе одной полипептидной цепи присутствуют два реактивных центра (Вirk, 1985). При этом с одной и той же или разной субстратной специфичностью могут быть связаны две молекулы фермента. Полагают, что мультидоменная структура белков-ингибиторов, содержащих несколько реактивных центров, образовалась в ходе дивергентной эволюции путем внутренней дупликации гена единого домена-предшественника (Wilson, 1980; Odani, Ikenaka, 1976). На основании особенностей первичной и пространственной структуры, числа и расположения дисульфидных связей и реактивных центров ингибиторы объединяют в семейства родственных белков (Мосолов, Валуева, 2005). Мосолов и Валуева выделяют девять семейств. Восемь из них составляют ингибиторы сериновых протеиназ и одно семейство - ингибиторы цистеиновых протеиназ (фитоцистатины).
Это первый ингибитор протеиназ из растений, который был получен в чистом виде и детально охарактеризован (Kunitz, 1947). Молекула ингибитора, содержит 181 аминокислотный остаток и имеет две дисульфидные связи (Koide et al.,1972). Реактивный центр ингибитора содержит в положении Р1-Р1 остатки Arg63-Ile64 и расположен внутри пептидной петли, ограниченной дисульфидной связью, образованной остатками Cys39 и Cys86 (Ozawa et al.,1966). SKTI является сильным ингибитором трипсина (7fr=0,01 нМ) и достаточно слабо действует на химотрипсин (к,- = 1 мкМ). При этом оба фермента взаимодействуют с одним и тем же реактивным центром.
Впоследствии большое число родственных ингибиторов было обнаружено у растений семейства бобовых, в основном, в подсемействах мимозовых и цезальпиниевых (Norioka et al.,1988). Большинство ингибиторов представлено белками с молекулярной массой около 20 кДа, молекулы которых состоят из 160-200 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь, и содержат две дисульфидные связи (Мосолов, 1993). Молекулы ряда ингибиторов состоят из двух полипептидных цепей, большой (а-цепь), состоящей из 140-150 аминокислотных остатков (около 15 кДа), и малой (0-цепь), содержащей 40-50 остатков (около 5 кДа). Обе цепи соединены дисульфидной связью (Richardson et al.,1986). Реактивный центр расположен в а- цепи. Наличие двух цепей является результатом протеолитического расщепления исходной молекулы, содержащей одну полипептидную цепь.
Большинство ингибиторов, относящихся к семейству SKTI, имеет один реактивный центр. Исключение составляет ингибитор WBCI из крылатых бобов, молекула которого способна одновременно связать две молекулы химотрипсина (Kortt, 1980).
В растениях обычно присутствуют несколько изоформ ингибиторов. Так, геном сои содержит, по крайней мере, десять генов SKTI, которые могут экспрессироваться в различных частях растения и на разных стадиях развития. Некоторые ингибиторы могут подавлять активность других сериновых протеиназ, известны ингибиторы, способные подавлять активность тканевого активатора плазминогена и протеиназ из плазмы крови (Batista et al.,1996).
Ингибиторы, принадлежащие к семейству SKTI, распространены не только у бобовых (Laskowski et al.,1980), но и у растений других семейств: злаков (Svendsen, Hejgaard, Mundy 1986), ивовых (Bradshaw, Hollick, Parsons, 1989), крестоцветных (Downing et al.,1992), ароидных (Argall, Bradbury, 1994), пасленовых (Ishikawa et al., 1994), кариковых (Odani,1986) и других семейств. Первый такой ингибитор был выделен из семян ячменя. Он действует одновременно как ингибитор сериновой протеиназы (субтилизина) и эндогенной а-амилазы 2 семян ("а-амилаза прорастания") (Mundy, Svendsen., 1983). Близкие по свойствам бифункциональные ингибиторы обнаружены в семенах пшеницы (ТгШсит aestivum L.), ржи и риса (Mundy, Svendsen., 1983; Mosolov,1986).
Гены, кодирующие белки, принадлежащие к семейству SKTI, были также обнаружены у картофеля. Кодируемые белки включают ингибиторы сериновых, аспартильных и цистеиновых протеиназ, а также белки, обладающие другими видами активности (Gruden et al., 1997; Heibges, Salamini., 2003). К числу ингибиторов сериновых протеиназ из картофеля относятся не только ингибиторы трипсина и химотрипсина, но и ингибиторы, действующие на другие протеиназы, например, ингибиторы субтилизина (Ревина, Сперанская, 2004) и ингибитор лейкоцитарной эластазы (Валуева и др., 1997). Известны ингибиторы из картофеля, которые содержат два реактивных центра. Молекула ингибитора PSPI-21, состоит из двух полипептидных цепей, большой (16.5 кДа) и малой (4,5 кДа), соединенных дисульфидной связью .(Gruden et al.,1997; Walsh, Twitchell, 1991; Valuevaetal., 2000).
Перспективы использования ингибиторов чужеродных гидролаз в селекции и растениеводстве
В последние десятилетия ингибиторы у бобовых, злаков, пасленовых и других растений находятся под пристальным вниманием исследователей. Однако даже при впечатляющих успехах по раскрытию молекулярной структуры и особенностей биосинтеза многих типов ингибиторов, клонированию и переносу их генов, роль, закономерности организации, функционирования и изменчивости основных систем ингибиторов, а также возможности их практического использования при создании новых форм растений остаются до конца не выясненными. Это объясняется чрезвычайной сложностью, многообразием и высокой изменчивостью ингибиторов у многих растений, недостаточной изученностью биохимии, физиологии, генетики и систематики самих растений, а также ограниченностью набора исследуемых форм, как правило, слабо охватывающего весь генофонд культуры, с которой ведется работа. Ощущается и нехватка простых и информационных методов анализа. Низкая пока эффективность использования ингибиторов при создании устойчивых форм растений во многом определяется недостатком сведений о физиологических последствиях, как для самого растения, так и для фитофага усиления присущего растению ингибитора (селекционными методами) или внедрение чужеродного ингибитора (путем трансгенеза). Здесь важно учитывать результаты взаимовлияния или наложения эффектов различных типов ингибиторов или ингибиторов и других белков, не упуская при этом из виду особенностей пищеварительной системы того или иного вредителя. Проявления таких взаимовлияний могут быть самыми неожиданными и разнообразными - от существенного усиления эффективности (синергизм) до стимуляции развития фитофага.
Много усилий направлено на создание форм пасленовых растений, устойчивых к вредителям и болезням, в т.ч. картофеля к колорадскому жуку, с привлечением белков-ингибиторов и токсичных для насекомых белков. Пасленовые хорошо подходят для этих целей. Ингибиторы у них весьма активны, гетерогенны и изменчивы. Они являются наглядным примером двух типов ингибиторных защитных барьеров (Вилкова, 1980) -конституционального и индуцированного. Особый интерес представляет более выраженная, чем у других растений, способность пасленовых к накоплению ингибиторов и иных защитных белков в вегетативных органах в ответ на разнообразные внешние воздействия, в том числе со стороны вредителей и патогенов. Биохимический механизм индуцированного системного (распространяющегося по всему растению) ответа у пасленовых даже в деталях сходен с тем, что выявлен у животных, и запускается гормоноподобным пептидом — системином. Подобие путей передачи сигнала при защитных реакциях указывает на общность происхождения этих древнейших механизмов у растений и млекопитающих (Bergey et al., 1999).
Многие из протеиназ фитофагов, в том числе колорадского жука, являются природными мишенями для ингибиторов из картофеля и других растений. Угнетающее действие различных ингибиторов на вредителей и патогены хорошо известно (Valueva, Shulgin, 1988; Chen et al., 1992). Однако насекомые обладают целым рядом механизмов ослабления защитных функций ингибиторов гидролаз растений. Особенно успешно они действуют у высокоорганизованных вредителей. Так, вредитель зерна -вредная черепашка адаптировалась к ингибиторам а-амилаз из эндосперма пшеницы за счет снижения чувствительности к ним (Konarev, 1996). Также известно, что не все трансгенные растения, получившие гены ингибиторов протеиназ, характеризуются повышенной устойчивостью к насекомым (Girard et al., 1998). Как видно, насекомые-фитофаги обладают механизмами, позволяющими противостоять неблагоприятному воздействию ингибиторов протеиназ из растений. В пищеварительном тракте вредителей злаковых и бобовых присутствуют протеиназамы, способными гидролизировать ингибиторы (Giri et al., 1998; Jongsma, 1997). При отсутствии ингибиторов в пище в кишечнике колорадского жука присутствуют цистеиновые протеиназы как минимум двух типов - катепсин В и катепсин Н (Thie and Houseman, 1990), чувствительные in vitro к ингибиторам цистеиновых протеиназ из пшеницы (Konarev and Fasulati, 1996) и картофеля (Jongsma, 1995). При наличии ингибитора в кишечнике этого вредителя секретируются цистеиновые протеиназы третьего типа, нечувствительные к подобным ингибиторам (Jongsma and Bolter, 1997). Это связано с наличием у насекомых семейств генов, кодирующих протеиназы, обладающие различной чувствительностью к ингибиторам. Например, у хлопковой совки присутствуют, по меньшей мере, 28 генов сериновых протеиназ (Bown et al..,1997). Ферменты, устойчивые к действию ингибиторов, отличаются от чувствительных, в первую очередь, строением тех участков молекул, которые вступают в непосредственный контакт с ингибитором (Bown et al..,1997). Адаптация пищеварительной системы насекомых может носить и более сложный характер. Подобное наблюдалось у зерновки (Collosobruchus maculatus) в присутствии соевого цистатина (Zhu-Salzman et al.,2003), а также у колорадского жука, питавшегося листьями картофеля с повышенным содержанием ингибиторов протеиназ (Gruden et al., 1997; 2003). У зерновки имело место одновременное усиление экспрессии протеиназ как чувствительных, так и устойчивых к действию ингибитора, а также ферментов, инициирующих протеолитическую деградацию ингибитора (Zhu-Salzman et al.,2003). Вредная черепашка питается зрелым зерном злаковых, когда содержание ингибиторов амилаз в них максимально, в связи с этим у вредной черепашки выработалась адаптация пищеварительных ферментов, нечувствительных к ингибиторам (Конарев, Фомичева 1992).
Определение активности протеолитических ферментов
Активность ингибиторов трипсина и проназы Е определяли по методике Гофмана-Вайсблая с некоторыми модификациями (Гофман, Вайсблай,1975). К 0,5 мл трис-НО-буфера добавляли 1,0 мл экстракта и 0,5 мл фермента. Затем приливали 1,0 мл раствора БАПА, после чего инкубировали на водяной бане 10 минут при 37 С, затем для прекращения реакции добавляли 0,5 мл 30% уксусной кислоты. В качестве контроля служил раствор, состоящий из 0,5 мл трис-НО-буфера, 1,0 мл дистилированной воды, 1,0 мл экстракта, 0,5 мл 30% уксусной кислоты и 0,5 мл раствора фермента. В параллельных опытах, в которых определяли активность трипсина или проназы, вместо испытуемого раствора добавляли воду. Растворы спектрофотометрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 405 нм. Активность фермента с ингибиторами и без них определяли по формуле: . (Етр.-Еоп.) х V А=-—- - , где 0,00955 xVlxt А - активность ферментов (мИЕ/мл), Етр. - экстинция трипсина / проназы/ протеиназы ЛКЖ, Еоп. - экстинция опытного раствора, V - объем инкубационной смеси, V, - объем ферментного раствора (мл), t - время протеолиза (мин.). Активность фермента выражали в ингибиторных единицах (ИЕ). В стандартных условиях за единицу ингибиторной активности принимали такое его количество, которое необходимо для подавления единицы активности трипсина на 100%. Определение концентрации белка.
Для определения концентрации белка в растворах использовали метод М. Бредфорд (M.Bradford, 1976). 100 мг красителя Кумасси голубого G-250 растворяли в 50 мл этанола, приливали 100 мл 85% фосфорной кислоты, 20 мл соляной кислоты; доводли дистилированной водой до 1,0 литра. К 1 мл раствора белка добавляли 1 мл реактива и определяли оптическую плотность при 590 нм. Контролем служил раствор, содержащий 1,0 мл дистилированной воды и 1,0 мл красителя.Калибровочную кривую для определения концентрации белка строили по а-химотрипсину. Гель-фильтрация
Колонку объемом 60 мл заполняли сефадексом G-75. Собирали фракции объёмом 5 мл; скорость элюции 1,0 мл/мин. В качестве элюирующего раствора использовали дистилированную воду. На колонку наносили по 5 мл раствора белка. Скорость элюции 1 мл/мин. Математическая обработка результатов Статистическая обработка результатов опытов проводилась с помощью компьютера в редакторе электронных таблиц Microsoft Excel. Средние значения величин рассчитывали по формуле: Хср.= Хср, где п Хср -сумма аргументов, п - количество аргументов. А также среднее квадратичное отклонение по формуле (Доспехов, 1985). S=Vy(x-X)2 rae п S- среднее квадратичное отклонение, х - среднее арифметическое, X - значение признака, п - число всех вариантов. Большинство используемых методов для количественного определения активности гидролитических ферментов основаны на спектрофотометрическом определении концентрации продуктов гидролиза субстратов. Недостатками этих методов являются высокая трудоемкость, ограниченные возможности, в частности, невозможность одновременного анализа большого числа образцов, невозможность работы с непрозрачными растворами.
Нашей задачей было изучение возможности измерения активности гидролаз с использованием агарозных гелей, содержащих различные субстраты ферментов, с целью дальнейшего использования этого метода для определения активности ферментов и их ингибиторов в исследуемых объектах.
Для приготовления гелевой пластины, содержащей белок желатин или казеин, порошок агарозы растворяли в горячем 1 % растворе белка. Смесь окрашивали бромфеноловым синим или Кумасси бриллиантовым синим R-250. Затем 20 мл геля остывшего до 45 С заливали в пластиковую кювету размером 12,5 8,5 см с бортиками высотой 0,5 см (крышка от иммунологического планшета) на строго горизонтальной поверхности. При использовании в качестве субстратов нативного яичного белка, гемоглобина, белок добавляли в раствор агарозы при температуре 45С, в целях предотвращения денатурации этих белков. Для формирования устойчивого геля, пластину с агарозным раствором выдерживали при температуре 4 С в течение 30 мин. Затем в гелевой пластине вырезали лунки диаметром 4 мм. Для осуществления реакции гидролиза иммобилизованного субстрата, ферментный раствор (20 мкл) заливали в лунки, гелевую пластину накрывали крышкой планшета и инкубировали в течение 14 час, при 37 С.
В течение этого времени, молекулы фермента из раствора диффундировали в гель и гидролизовали субстрат вокруг лунки. Соответственно, участки геля вокруг лунок осветлялись, за счет разрушения комплекса субстрат-краситель. Согласно закону диффузии (1 закон Фика), скорость диффузии молекул фермента в геле пропорциональна его исходной концентрации в растворе. Следовательно, размер площади гидролизованного участка зависит от концентрации молекул фермента в лунке и отражает его активность.
На рис. 1 представлены данные по измерению протеолитической активности растворов трипсина нескольких концентраций на агарозных гелевых пластинах с использованием в качестве субстратов желатина и казеина. Как видно, размер гидролизованного участка геля вокруг лунки зависит от начальной концентрации фермента в лунке. Так, если трипсин в концентрации 100 мкг/мл гидролизует 60 мм иммобилизованной желатины, то при концентрации 20 мкг/ мл - 33 мм . Как видно из рисунка, в интервале концентраций трипсина 50 -500 мкг/мл, активность фермента повышается пропорционально увеличению его начальной концентрации в инкубационной среде. Такая закономерность обнаруживается как при гидролизе желатины, так и при гидролизе казеина. Следовательно, при этих условиях эксперимента активность ферментов можно определять по размеру площади гидролизованного участка пластины.
Функционирование системы «гидролазы насекомых - белковые ингибиторы растений» при различных физиологических состояниях растительного организма
Как отмечалось выше, гидролитическим ферментам и их ингибиторам принадлежит ключевая роль во взаимоотношениях фитофагов и растений (пищевые связи, защитные функции). Уровень активности молекулярной гетерогенности гидролитических ферментов гетеротрофных организмов и их ингибиторов в тканях растений может рассматриваться как результат сопряженной эволюции растений и организмов-фитофагов (Harborne, 1979; Конарев, 1992). В процессе коэволюции с растениями, насекомые-фитофаги сформировали набор пищеварительных гидролаз, обеспечивающих усвоение питательных веществ из определенных видов растений и их отдельных органов, тканей (Дунаевский и др., 1995; Konarev et al., 1999). Можно предположить, что поддержание свойств, обеспечивающих устойчивость растений, происходило за счет усложнения или повышения активности комплекса ингибиторов, подавляющих активность гидролитических ферментов. Значительные генетически обусловленные различия в содержании ингибиторов ферментов указывают на целесообразность поиска связей этого показателя с устойчивостью растений к патогенным микроорганизмам и вредным насекомым.
Яркий пример такой специализации и адаптивности ферментативной системы к пищевым субстратам проявляется у колорадского жука. Как известно, растениями картофеля питаются и взрослые насекомые (имаго), и личинки, но наибольший вред картофельным посадкам наносят личинки. Установлено, что личинки колорадского жука за 2 недели уничтожают до 45 % листовой поверхности растений (Теняев , 2000).
В кишечнике колорадского жука и его личинок обнаружены сериновые (химотрипсиноподобные) и цистеиновые протеиназы (Ryan, 1990; Konarev and Fasulati, 1996). Ключевую роль в пищеварительном процессе этих насекомых выполняют ферменты, относящиеся к типу кислых (аспартильных) протеиназ, аналогичных катепсину D млекопитающих. Основная функция этих ферментов заключается в инициировании процесса гидролиза и подготовке белковых субстратов к дальнейшему расщеплению другими протеиназами (et al., 1999). Картофель относится к растениям, характеризующихся очень высоким содержанием в тканях ингибиторов гидролаз, в первую очередь, ингибиторов, протеолитических ферментов. Клубни и листья картофеля содержат ингибиторы, способные подавлять активность протеолитических ферментов разного типа (Bryant et al., 1976; Mares et al., 1989; Valueva et al., 2000). По некоторым данным, трипсинингибирующей активностью обладают около 20 % белков клубней. Наиболее подробно изучены картофельные белки, подавляющие активность трипсина и химотрипсина (Birk, 1985; Favel et al.,1989; Misao et al.,1990 и др.). На растениях картофеля впервые обнаружен факт повышения активности ингибиторов протеиназ при действии на растения различных факторов (механических, химических, в т ч. при повреждении листьев колорадским жуком). Важно, что повреждение одного листа вызывало длительную активацию ингибиторов и в других органах растений (Ryan, 1990). Эти факты явились весомым подтверждением защитных функций картофельных ингибиторов, заключающихся в подавлении активности чужеродных ферментов, в частности, протеиназ личинок колорадского жука, повреждающих картофель. Однако следует заметить, что в литературе имеется очень мало сведений о функционировании взаимоспецифичных гидролаз (ферментов насекомого) и ингибиторов (картофеля) в едином физиологическом комплексе. В большинстве экспериментальных работ по этой проблеме, гидролитические ферменты насекомых и растительные ингибиторы рассматриваются отдельно, независимо друг от друга.
В связи с вышесказанным, особый интерес и практическую ценность представляет исследование проявления активности гидролаз колорадского жука и их ингибиторов из растительных тканей. Для исследования ингибиторов нам необходимо было получить препараты протеиназ насекомых с высокой ферментативной активностью и определить оптимальные условия для длительного хранения ферментов.
Эксперименты показали, что наибольшая активность протеиназ личинок колорадского жука, гидролизующих субстрат БАПНА, выявлялась при использовании в качестве экстрагента дистиллированной воды. В этом случае активность протеолитических ферментов составила 0,12-0,15 Е/мл.
Для получения концентрированных растворов с высокой протеолитической активностью, использовали методы осаждения белков органическими растворителями и неорганическими солями. Для осаждения белков использовали ацетон, изопропанол, этанол. Протеолитическая активность сохранялась при осаждении белков ацетоном; при осаждении изопропанолом и этанолом активность протеиназ личинок колорадского жука не выявлялась. Полученный осадок отделяли центрифугированием при 8000 об/мин. в течение 10 мин. и растворяли в воде. В зависимости от применяемого осадителя активность фермента была различной. Из таблицы 3. видно, что наибольшая протеолитическая активность проявляется при осаждении белков ацетоном в объемном соотношении экстракт: ацетон - 1: 3. В этом случае удельная протеолитическая активность составила 29,5 Е/мг белка, в исходном водном экстракте этот показатель был равен 6,7 Е/мг белка. Как видно из таблицы 3, при осаждении белков сульфатом аммония активность протеиназ сохраняется на невысоком уровне.
