Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
1. Сохранение сортов и видов картофеля клубнями и семенами . II
2. Сохранение сортов и видов картофеля при использовании методов культуры тканей 15
3. Сохранение сортов и видов картофеля при сверхнизких температурах 21 З.а. Особенности сохранения биологических объектов при сверхнизких температурах 21
З.б. Глубокое замораживание объектов растительного происхождения 22
З.в. Влияние процесса замораживание - хранение-оттаивание на выживаемость апексов и сохранение генетической стабильности 34
4. Использование методов криоконсервации пыльцы картофеля в селекционной практике 39
Глава II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45
Глава III. ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ АПЕКСОВ И ИХ М0РШ0ШЗИОЛОГИЧЕСК0Г0 СОСТОЯНИЯ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПОСЛЕ ЦИКЛА ЗАМОРАЖИВАНИЕ-ОТТАИВАНИЕ 53
Глава ІV. ИЗУЧЕНИЕ МАТЕРИАЛА, ПОДВЕРГНУТОГО ОБРАБОТКЕ ХОЛОДОМ 70
I. Характер и интенсивность роста стеблевых апексов картофеля после цикла замораживание-оттаивание 70
2. Морфологическая оценка и биохимический анализ растений-регенерантов, полученных из апексов после глубокого замораживания 82
Глава V. ОСОБЕННОСТИ КРИОСОХРАНЕНИЯ ДРУГИХ СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ 94
Глава VІ. КРИОСОХРАНЕНИЕ ПЫЛЬЦЫ КАРТОФЕЛЯ И ПЕРСПЕК ТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КРИОБАНКА ПЫЛЬЦЫ В ВЫПОЛНЕНИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ ПРОГРАММ 105
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 115
ВЫВОДЫ 119
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121
ПРИЛОЖЕНИЕ 140
- Сохранение сортов и видов картофеля клубнями и семенами
- ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ АПЕКСОВ И ИХ М0РШ0ШЗИОЛОГИЧЕСК0Г0 СОСТОЯНИЯ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПОСЛЕ ЦИКЛА ЗАМОРАЖИВАНИЕ-ОТТАИВАНИЕ
- Характер и интенсивность роста стеблевых апексов картофеля после цикла замораживание-оттаивание
- ОСОБЕННОСТИ КРИОСОХРАНЕНИЯ ДРУГИХ СОРТОВ И ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ
- КРИОСОХРАНЕНИЕ ПЫЛЬЦЫ КАРТОФЕЛЯ И ПЕРСПЕК ТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КРИОБАНКА ПЫЛЬЦЫ В ВЫПОЛНЕНИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ ПРОГРАММ
Введение к работе
Проблема сохранения генофонда растительного мира является одной из первостепенных в связи с тем, что в настоящее время значительное количество ценных и редких видов растений находится на грани полного исчезновения. По последним данным число: этих видов составляет около 444 наименований (Красная книга, 1978). Если исходить из общегосударственного значения того или иного вида растений, то на территории СССР в охране нуждается около 4000 видов (Красная книга, 1975). Безотлагательное решение проблемы сохранения генофонда мировой флоры необходимо в первую очередь потому, что спасение отдельных видов растений уже невозможно без осуществления специальных мер сохранения (Fisher ). Заинтересованность в сохранении всего многообразия мировой флоры связана с рядом причин, однако, исходя из чисто практического использования, можно выделить две основные. Во-первых, еще мало изучены свойства подавляющего большинства видов растений. В хозяйственной деятельности человечество использует только ничтожную часть богатств растительной природы, поэтому потеря даже незначительного числа видов, которые могут обладать ценными, еще неизвестными нам свойствами, является недопустимой. Во-вторых, сохранение генофонда растительной флоры является важным для проведения селекционной работы с целью получения новых и улучшения существующих хозяйственно-ценных видов и сортов растений (Красная книга,1975).
Картофель не относится к числу редких видов растений, однако, учитывая его сельскохозяйственную и промышленную ценность, а также тревожные сигналы о том, что некоторые его виды находятся на грани исчезновения или уже перестали существовать (Huamas, 1980), можно с уверенностью говорить о том, что и для картофеля решение проблемы сохранения всего его сортового и видового раз- нообразия имеет немаловажное значение.
В практическом отношении сохранение генофонда картофеля имеет большое значение для успешного проведения селекционной работы, Для выведения новых перспективных сортов картофеля селекционеры имеют в своем распоряжении большое разнообразие исходного материала - лучшие отечественные и зарубежные сорта, гибридные формы, дикие и примитивные культурные виды. Уже сам факт существования коллекции ставит перед селекционерами задачу полного ее сохранения. Кроме того, повышенные требования, предъявляемые к новым сортам, которые должны превосходить по урожайности, крахмалистости и другим хозяйственно-биологическим признакам лучшие сорта-стандарты, районированные на значительных посадочных площадях, вынуждают селекционеров расширять генетическую базу, т.е. укрупнять коллекции исходного материала. Поддерживание больших коллекций, которые обычно размещают в поле, не только трудоемкий процесс, но и не очень надежный, так как не исключаются потери образцов коллекции вследствие неблагоприятных условий среды, болезней, вредителей, нарушения агротехники и других факторов. Такие потери не только обедняют коллекцию исходного материала, но и сводят на нет многолетний труд селекционеров, вложенный в каждый входящий в нее сорт или перспективный гибрид.
Введение картофеля в культуру (Р.Г.Бутенко, 1964, Morel,Mul-ler, I964,Murashige, l974,Mellor,Stace-Snith,l977) позволило частично решить проблему сохранения коллекций сортов и видов, по крайней мере исключить влияние тех неблагоприятных факторов, которые имеют место при выращивании картофеля в полевых условиях. Однако нельзя с уверенностью говорить о достаточной надежности этого способа сохранения коллекции не только потому, что при.его использовании не исключена возможность инфицирования материала во время пересадок, но и потому, что не исключается ве- роятность потери исходных образцов в результате непредвиденных изменений на генном, хромосомном и клеточном уровнях (мутации, хромосомные абберации, изменение плоидности). (Ф.Л.Калинин и др., 1980).
В последнее время исследователи ряда стран изучают возможность использования для сохранения генофонда различных видов растений принципиально нового способа, основанного на глубоком замораживании и последующем хранении при сверхнизких температурах клеточных культур и меристематических верхушек побегов. Наибольший интерес в этой области исследований представляет криосохранение апексов, как генетически стабильного объекта, из которого можно легко получить растения-регенеранты, тем более, что на примере ряда видов растений уже показана возможность глубокого замораживания и последующего возобновления роста апексов (А.С.Попов, 1982). К тому времени, когда были получены первые положительные результаты по криоконсервации растительных клеток и тканей, о преимуществах этого способа, в частности его надежности и обеспечении продолжительного хранения материала, уже было известно из экспериментальных данных по глубокому замораживанию и длительному хранению при сверхнизких температурах клеток животных и микроорганизмов (Meryman, I966,Mazur, 1970). Поэтому первостепенным вопросом, который предстояло изучить, был вопрос не о пригодности условий сверхнизких температур для хранения клеток и тканей растений в смысле надежности и длительности хранения, а о том, какие условия предварительной подготовки материала и проведения глубокого замораживания и оттаивания требуются для того, чтобы клетки и ткани были способны сохранять жизнеспособность и способность к морфогенезу, оставаясь при этом генетически стабильными. Такой подход к решению проблемы является наиболее правильным, особенно в отношении предварительной подготовки материала, причина необхо-
7 димости и продолжительности которой еще плохо изучена.
Изучение возможности сохранения генофонда картофеля путем криоконсервации апексов было начато сравнительно недавно, тем не менее, оно было довольно успешным. Исследуемые виды картофеля сохраняли способность к регенерации целого растения после криоконсервации апексов (Вазад, ,1977,Grout, Henshaw, 1978, Towill, 1979). Однако ни один из авторов не взял на себя смелости заявить о том, что разработанный им способ может быть универсальным и позволит сохранить по крайней мере сортовое разнообразие картофеля. Таким образом, для картофеля вопрос о возможности использования методов криоконсервации апексов остается открытым и для его решения необходимы дальнейшие исследования.
Наряду с криоконсервацией сортов и видов картофеля, криогенную технику используют и для других практических целей, в частности, для сохранения пыльцы картофеля. Целью последнего является расширение программы скрещиваний в направлении создания новых раннеспелых высокоурожайных сортов картофеля за счет вовлечения в скрещивание позднеспелых сортов-опылителей, которые обычно не включают в селекционную программу в качестве отцов из-за того, что в большинстве случаев фаза цветения протекает у них намного позднее, чем у раннеспелых и среднеспелых сортов. В настоящее время уже имеются данные о сохранении фер-тильности пыльцы картофеля после длительного хранения в жидком азоте, однако вопрос о том, может ли пыльца после длительного хранения в глубокозамороженном состоянии заменить свежесобранную пыльцу, т.е. насколько она сохранила свои функции, еще недостаточно изучен.
Целью нашей работы было:
I. Изучение влияния предварительной подготовки, морфо-физиологического состояния апексов,, условий предкультивирова- ния и рекультивирования на их выживаемость и сохранение способности к регенерации целого растения после цикла замораживание-хранение-оттаивание, для выявления общих закономерностей, которые позволят создать универсальный способ криоконсервации сортов и видов картофеля.
2. Определение пригодности использования в селекционной работе пыльцы картофеля после длительного (не менее года) хранения ее в жидком азоте.
В связи с тем, что проблема криоконсервации апексов картофеля уже изучалась некоторыми зарубежными исследователями, нашей основной целью было выявление позитивных и негативных сторон существующих методов криоконсервации апексов и разработка, с учетом этих наблюдений, способа криоконсервации с более широкими возможностями, т.е. пригодного для сохранения большинства видов и сортов, составляющих генофонд картофеля.
В задачи наших исследований входило: подбор оптимальной концентрации криопротекторов и определение допустимого времени инкубирования апексов в их присутствии; определение влияния размера, морфофизиологического состояния апексов и их местонахождения на материнском растении на последующую выживаемость апексов после цикла замораживание-хранение-оттаивание ; подбор оптимального режима замораживания апексов; определение влияния "затравки" кристаллизации раствора криопроектора, окружающего апексы, на выживаеость последних после медленного замораживания, хранения, оттаивания; выявление наличия или отсутствия изменений у апексов после глубокого замораживания по сравнению с исходным сортотипом; проведение наблюдений за изменением характера и интенсивности роста растений-регенерантов, полученных из обработанных холодом апексов в сравнении с апексами, находившимися в обычных условиях выращивания; определение степени пригодности разработанного способа криоконсервации для разных сортов и видов картофеля; определение надежности сохранения регенерационной способности апексами, находившимися в глубокозамороженном состоянии длительное время.
В случае криосохранения пыльцы наши задачи заключались в: определении жизнеспособности пыльцы картофеля после глубокого замораживания и разных сроков хранения в жидком азоте; определении уровня фертильности пыльцы по истечении одного года хранения в условиях сверхнизкой температуры по скрещиваниям с несколькими произвольно выбранными партнерами в сравнении со свежесобранной пыльцой.
Научная новизна. Изучено влияние различных вариантов предварительной подготовки апексов на их выживаемость после проведения цикла замораживание-оттаивание. Установлено, в каком мор-фофизиологическом состоянии апексы стойко сохраняют способность к регенерации целого растения. Выявлены некоторые закономерности в изменении характера роста апексов, находившихся в глубокозамороженном состоянии. Выявлены общие закономерности, связанные с морфофизиологическим состоянием апексов, обусловливающие их выживаемость в цикле замораживание-оттаивание. Определено влияние продолжительности нахождения апексов в жидком азоте на их выживаемость и сохранение морфогенетических потенций.
Практическая ценность и реализация. Впервые в СССР разработан универсальный и надежный способ криоконсервации апексов картофеля, позволяющий сохранять образцы в жидком азоте в неизменном состоянии длительное время, который может быть использован для создания банка генов коллекции исходного материала, включающей разнообразные сорта, гибридные формы и виды картофе- ля. Показана пригодность метода криоконсервации пыльцы картофеля, обусловливающего использование ее в программе скрещиваний по истечении 12 месяцев хранения в жидком азоте.
Внедрение в практику. На базе ИФР АН СССР создан банк пыльцы картофеля лучших сортов-опылителей, которая будет использоваться в программе скрещиваний в ближайшем году, а также и в последующие годы.
Основная часть работы выполнена в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФР АН СССР. Полевые опыты и биохимические анализы проведены в НИИ картофельного хозяйства МСХ РСФСР.
Сохранение сортов и видов картофеля клубнями и семенами
Основными требованиями, которые предъявляются к способам сохранения коллекций сортов и видов растений являются обеспечение надежности и достаточной длительности хранения всех образцов коллекции в неизменном состоянии. Это имеет особое значение для успешного проведения селекционной работы. К сожалению в настоящее время не существует способа, который бы в достаточной мере отвечал этим двум требованиям. Это относится главным образом к длительности хранения, потому что почти все известные способы хранения селекционного материала являются надежными с точки зрения стабильного сохранения наследственной информации исходных образцов.
В научно-исследовательских селекционных центрах картофеля наиболее распространенным способом сохранения коллекций сортов и видов картофеля является вегетативное размножение клубнями, которые стойко, из поколения в поколение передают все признаки, присущие исходным родительским формам. Принцип сохранения клубнями основан на наличии у них периода покоя, наступающего после созревания клубней. По данным Юнгеса и Хинзе (Junges,Hinze, 1979) период покоя клубней у сортов картофеля имеет различную продолжительность. У большинства из них он находится в пределах от 35 дней до 4,5 месяцев ( Emilsson, ,1949), после чего необходимы специальные меры для предотвращения прорастания клубней. Их обрабатывают ингибиторами роста, например, профа-мом или хлорпрофамом (Minister et.al., 1979), камптотецином ("Wang ,et.al., 1980), ретардантами - бургином, тикситом, луксаном (Simek ,1980) и другими коммерческими препаратами, гамма-лучами в дозе не менее 10 крад (Thomas et.al., 1979) перед закладкой на хранение и, наконец, создают необходимые условия в период хранения, то есть поддерживают температуру на уровне 3-4 гИ относительную влажность в пределах 85-90% (С.М.Букасов, А.Я.Камераз, 1972, С.А.Гусев, М.Н.Капустин, 1980). Однако, несмотря на эти меры, позволяющие искусственно продлить период покоя, срок хранения клубней без потери всхожести не превьшіает в среднем 10—II месяцев (Meioers,Veldhur isen, 1979, Mix, 1980), поэтому селекционеры вынуждены ежегодно высаживать всю имеющуюся в их распоряжении коллекцию сортов и видов картофеля в поле для обновления материала. Ежегодное выращивание коллекций исходного материала в поле является не только трудоемким и дорогостоящим процессом, включающим посадку клубней, уход за растениями и, наконец, уборку и сохранение клубневого потомства, но и не гарантирует полного сохранения всей коллекции, так как в полевых условиях возможны потери отдельных образцов от воздействия неблагоприятных условий среды, повреждений болезнями и вредителями в период вегетации и в процессе хранения.
Влияние предварительной подготовки апексов и их моршошзиологического состояния на выживаемость после цикла замораживание-оттаивание
В первой серии экспериментов мы проводили глубокое замораживание стеблевых апексов картофеля без специальной предварительной подготовки.
После вычленения апексы (из клубневых проростков и из зеленых растений) находились в жидкой питательной среде (модификация среды М.-С.) с 5 и 10% ДМСО (диметилсульфоксид) в течение 2-х часов, включая время постепенного добавления крио-протектора в среду в течение 30 минут. После такой обработки апексы замораживали тремя способами: I. - сверхбыстро на кончиках стерильных игл путем погружения их в жидкий азот; 2. - быстро, подвешивая ампулы с апексами над горловиной сосуда Дьюара; 3. - с медленным предзамораживанием (рис.1) со скоростью 0,5С/мин до -40С с последующим погружением апексов в жидкий азот. После оттаивания и рекультивирования у апексов не восстанавливались ростовые процессы. Повторные эксперименты также не дали положительных результатов. Увеличение времени экспозиции апексов в присутствии криопротектора (5-10% ДМСО) до 5-6 часов оказалось безуспешным. Таким образом для апексов картофеля только обработки криопротектором было недостаточно. Это еще раз подтверждало, что для успешного замораживания апексов требуется специальная предварительная подготовка, подобная той, которую применяли в своих работах Баджач ( Bajaj , 1977) и Тоуилл (Towill , 1981). Мы попытались использовать методику предварительной подготовки Тоуилла, которая заключалась в культивировании апексов на питательной среде в течение 2 суток с последующей экспозицией
Характер и интенсивность роста стеблевых апексов картофеля после цикла замораживание-оттаивание
На первых этапах изучения размороженного материала мы провели наблюдения за ростом и развитием апексов. После оттаивания и переноса на агаризованную среду апексы в течение 30-40 мин. оставались светлыми, т.е. внешний вид их был таким же как и до проведения замораживания. Затем апексы начинали постепенно темнеть. У погибших в процессе замораживания-оттаивания апексов как листовые примордии, так и меристематический купол приобретали темно-бурую окраску, в то время как у выживших апексов только листовые примордии становились темно-бурыми, а меристематический купол имел светло-коричневую окраску. На третьи сутки рекультивирования мы наблюдали первые признаки возобновления роста у оставшихся жизнеспособными апексов. В одной или нескольких точках ме-ристематического купола появлялись выпуклые светлые участки. В возобновлении роста принимали участие клетки, находящиеся внутри купола. Новообразующаяся из них ткань разрывала поверхностный слой погибших в процессе замораживания-оттаивания клеток и как бы "выпячивалась" наружу. В редких случаях начиналось возобновление целиком всего меристематического купола. Он увеличивался в размере и внешне выглядел как светлая полусфера, окаймленная слоем погибших переферических клеток купола, отторгнутых к его основанию нарастающей тканью. Наши наблюдения почти полностью соответствуют наблюдениям Гроу и Хеншоу (Grout, НешзЬаиг, 1980), которые провели микроскопические наблюдения за ростом и развитием апексов картофеля. Однако, в то же время необходимо отметить, что Тоуилл (Towill , 1981) наблюдал иную картину роста размороженных апексов картофеля. Автор указывает на то, что возобновление роста и дальнейшее развитие побегов происходит из выживших клеток базальной части примордиев сильно поврежденных холодом Роль клеток примордиев как инициаторов роста апексов наглядно показана и в работе Хаскинса и Карта ( Haskins, Kortha, 1980), изучавших последствие обработки холодом апексов гороха.
По истечению трех дней рекультивирования в наших экспериментах доля апексов, у которых начиналось возобновление роста, составляла 18,3 - 27,0$ (табл.7). На 5-7 сутки рекультивирования наблюдали возобновление роста у большей части апексов -35,0 - 46,7$ и, наконец, в течение последующих 13-15 дней рекультивирования восстановление ростовых процессов происходило у оставшейся части выживших апексов (табл.7). При обычном культивировании на питательной среде без обработки ДМСО и холодом у 52,5$ апексов возобновлялся рост на третьи сутки рекультивирования, а еще через 2-4 дня ростовые процессы возобновлялись у всех жизнеспособных апексов (табл.7). Причиной разновременности возобновления роста у размороженных апексов как оказалось является степень их повреждения холодом в процессе замораживания-оттаивания. Обычно на третьи сутки рекультивирования развивались апексы с неповрежденным меристематическим куполом или в том случае, когда купол имел незначительную степень повреждения, т.е. большая часть клеток купола оставалась жизнеспособной и могла нормально функционировать. В более позднее время возобновление роста происходило у апексов с сильно поврежденным куполом, т.е. когда жизнеспособными оставались только несколько групп клеток купола.
Особенности криосохранения других сортов и видов картофеля
Для изучения возможности использования разработанного нами способа криоконсервации апексов с целью сохранения сортового и видового разнообразия картофеля мы использовали три сорта культурного вида s.tubeгоsum - Маяк, Кварц, Раменский, две формы дикого вида S.chacoense ( К-2940 и K-28I9) и форму Д-307 дикого вида S. catarthrum . Все перечисленные образцы были введены в культуру меристем, что значительно облегчало нашу задачу по возобновлению апексов после глубокого замораживания. В качестве дополнительного контроля (основным контролем были апек-сы культивируемые на питательной середе без обработки холодом) мы использовали апексы сорта Домодедовский, которые замораживали одновременно с каждым из изучаемых образцов. Необходимо отметить, что все условия, включая процесс глубокого замораживания-оттаивания были аналогичными тем, которые имели место в предыдущих экспериментах по замораживанию апексов сорта Домодедовского. Во всех экспериментах мы использовали предварительную подготовку, которая заключалась в культивировании апексов на среде без криопротектора в течение 5 часов с последующим инкубированием их в присутствии Ъ% ДМСО еще 20 часов непосредственно перед замораживанием. В экспериментах по глубокому замораживанию апексов сортов Кварц и Раменский использовали как верхушечные так и пазушные апексы. Эти же условия были соблюдены и при вычленении апексов сорта Домодедовский (контроль). Что касается сорта Маяк, то для замораживания вычленяли только пазушные апексы. Точно также поступали и при вычленении апексов сорта Домодедовского (контроль.). Полученные результаты представлены в таблицах 14 и 15. По уровню жизнеспособности и способности к регенерации целого растения имелись некоторые различия между сортами Раменский и Кварц и сортом Домодедовский (табл.14). Однако нельзя не учитывать то, что во-первых между сортами в пределах одного вида Solamim tuberosum изначально существуют различия биологического характера ввиду присущих каждому сорту биологических особенностей и во-вторых как было показано в главе I (табл.4) даже в пределах одного сорта между образцами наблюдаются различия по жизнеспособности и способности к регенерации целого растения от эксперимента к эксперименту. Рассматривая наши результаты с этой позиции, можно сказать, что для обоих видов картофеля - Кварц и Раменский (табл.14) вполне подходит разработанный нами способ криоконсервации, тем более, что число растений-регенерантов, полученное из апексов после цикла замораживание-оттаивание находилось в пределах от 6,67 до 13,7$, т.е. почти соответствовало уровню регенерационной способности апексов сорта Домодедовский (13,3$),
Криосохранение пыльцы картофеля и перспек тивы использования криобанка пыльцы в выполнении селекционных программ
Для изучения возможности создания банка пыльцы картофеля путем ее глубокого замораживания и последующего длительного хранения в жидком азоте мы использовали в качестве объекта исследований пыльцу сортов Гидра и Невский. Были получены следующие результаты. Как видно из таблицы 18, пыльца изучаемых сортов хорошо сохраняла жизнеспособность после быстрого глубокого замораживания. По результатам окрашивания ацетокармином жизнеспособность размороженной пыльцы была на уровне со свежесобранной у сорта Гидра и незначительно ниже у сорта Невский.
Такая же закономерность прослеживалась и в отношении проращивания на питательной среде размороженных пыльцевых зерен (табл.І8). В процессе исследований было установлено, что для успешного замораживания пыльцы требуется специальная ее подготовка, которая заключается в подсушивании пыльцы перед погружением в жидкий азот. В наших экспериментах после подсушивания пыльцы в течение суток содержание воды в ней непосредственно перед замораживанием составляло 6,35 и 8,34% для сортов Гидра и Невский, соответственно (табл.18). Это способствовало сохранению жизнеспособности и оплодотворяющей способности пыльцевых зерен на достаточно высоком уровне. Такой вывод был сделан после неудачной попытки провести криоконсервацию свежесобранной пыльцы гибрида 560-9, в которой содержание воды было на уровне 36,74%. Только суточное подсушивание, в результате которого содержание воды в пыльце снизилось до 5,2%, позволило сохранить ее жизнеспособность после погружения в жидкий азот на уровне 19,24% проросших на питательной среде пыльцевых зерен, что почти соответствовало контролю (23,48%).
