Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Филянина Елена Михайловна

Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР
<
Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Филянина Елена Михайловна. Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.12, 03.00.02.- Казань, 2005.- 116 с.: ил. РГБ ОД, 61 06-3/259

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Современные представления о плазмодесмах и аквапоринах как структурных элементах растительной ткани, обеспечивающих регуляцию трансклеточного водообмена 7

1.1. Структура, функции и биогенез плазмодесм 7

1.1.1. Плазмодесмы - межклеточные «мостики» 7

1.1.2. Биогенез плазмодесм 9

1.1.3. Регуляция пропускающего размера (SEL) плазмодесм 13

1.1.4. Регуляция симпластной проницаемости ионами II группы 16

1.1.5. Внутренний сфинктер плазмодесм 18

1.1.6. Внешний сфинктер плазмодесм 28

1.1.7. Роль плазмодесм в межклеточном транспорте воды 30

1.2. Строение, систематика и особенности регуляции аквапоринов 30

1.2.1. Общие представления об аквапоринах 30

1.2.2. Строение аквапоринов * 33

1.2.3. Многообразие аквапоринов 37

1.2.4. Регуляция работы аквапоринов 39

Постановка цели и задач диссертации 42

Глава 2. Физические аспекты самодиффузии молекул в пористых средах ...45

2.1. Метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля в исследовании самодиффузии 45

2.2. Простейшие примеры ограниченной диффузии 46

2.3. Зависимость эффективного коэффициента самодиффузии в пористых системах от времени диффузии 48

2.3.1. Режим малых времен диффузии 49

2.3.2. Режим промежуточных времен диффузии 50

2.3.3. Длинновременной режим диффузии 50

Глава 3. Новые аргументы в пользу существования вакуолярного симпласта 52

Глава 4. Регуляция водопроницаемости вакуолярного симпласта 67

Глава 5. Изменение уровня гидратации акто-миозиновых белков, локализованных в цитоплазматическом канале плазмодесм, как возможный механизм регуляции водопроницаемости этого канала 78

Выводы 90

Список использованной литературы 92

Введение к работе

Актуальность проблемы. На современном этапе исследований [13, 14, 15] возникли новые представления о структурно-функциональной организации транспортной системы высших растений. В частности, предполагается существование в растительной ткани не только цитоплазматического симпласта, но и другого надклеточного континуума, образованного эндоплазматическими пространствами (вакуолями) соседних клеток с помощью десмотрубочек (второго транспортного канала в плазмодесмах). В настоящей работе такой надклеточный континуум будем называть вакуолярным симпластом.

Предполагается, что водопроницаемость вакуолярного симпласта контролируется как водопроницаемостью десмотрубочек, способных изменять свой просвет или совершать переходы из открытого в закрытое состояние и обратно за счет локализованного в плазмодесмах акто-миозинового сфинктера [13], так и водопроницаемостью вакуолярной мембраны (тонопласта), которая также способна к регуляции, поскольку связана со специфическими белками аквапоринами [232].

Поток воды по тканям растения может идти двумя путями: внеклеточному (апопластному) и трансклеточному. Оказалось, что эти два пути взаимодействуют между собой: при уменьшении водного потока по апопластному пути может увеличиваться водопроницаемость трансклеточного. В механизме соответствующих переключений существенная роль может принадлежать'фитогормону стресса - абсцизовой кислоте (АБК) [176]. Роль плазмодесм и тонопласта в регуляции трансклеточного водообмена, при этом, остается не раскрытой. Это обстоятельство и определило цель и задачи данной работы.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении механизмов регуляции водопроницаемости тонопласта и транспортных

5 каналов плазмодесм с позиции существования вакуолярного симпласта. Исходя из указанной цели, были поставлены следующие задачи:

Получить дополнительные экспериментальные доказательства, подтверждающие идею о вакуолярном симпласте, как регулируемом русле водообмена у растений, и разработать ЯМР-подход для контроля водопроницаемости этого симпласта.

Изучить влияние экзогенной АБК и ингибитора энергетического метаболизма - азида натрия - на водопроницаемость десмотрубочек и тонопласта как структурных элементов вакуолярного симпласта, предположительно обеспечивающих регуляторные возможности этой транспортной системы.

Выяснить влияние некоторых ингибиторов акто-миозиновых белков цитоскелета на параметры диффузионного затухания спинового эха от протонов клеточной воды и обсудить роль предполагаемых изменений уровня гидратации подобных белков, локализованных внутри цитоплазматического канала плазмодесм, в регуляции водопроницаемости этого канала.

Научная новизна работы. При изучении особенностей ограниченной диффузии молекул воды в тканях корня, были получены новые аргументы в пользу существования вакуолярного симпласта. Разработан методический подход к изучению водопроницаемости этого симпласта методом спинового эха ЯМР (на протонах) с импульсным градиентом магнитного поля (метод ЯМР ИГМП). Установлено, что АБК оказывает влияние на водопроницаемость вакуолярного симпласта только путем временного увеличения водопроницаемости его мембраны — тонопласта - и не затрагивает водопроницаемость десмотрубочек. Показано, что водопроницаемость десмотрубочек вакуолярного симпласта АТФ-зависима. Выдвинута гипотеза о том, что акто-миозиновые белки локализованные внутри цитоплазматического канала плазмодесм, могут регулировать его водопроницаемость за счет изменения уровня собственной гидратации.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты подтверждают гипотезу о существовании в растительной ткани не только цитоплазматического, но и вакуолярного симпласта, водопроницаемость которого контролируется как водопроницаемостью десмотрубочек, так и водопроницаемостью тонопласта. Разработан новый методический подход к изучению механизмов регуляции трансклеточного пути водообмена в растениях методом ЯМР ИГМП. Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии растений и биофизике транспортных процессов в растениях.

Работа выполнена в лаборатории биофизики транспортных процессов Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.

Плазмодесмы - межклеточные «мостики»

Плазмодесмы представляют собой сквозные межклеточные каналы, выстланные плазматической мембраной, непрерывно переходящей из клетки в клетку. Средний диаметр канала 40-60 нм при длине порядка 0,5-1мкм. На концах канала имеются шейные сужения. В растительных тканях плазмодесмы несут особую нагрузку, так как наличие клеточной стенки вокруг каждой клетки создает условия изоляции протопластов. Располагаются плазмодесмы, как правило, в поровых полях — участках поверхности клеток, где отсутствует вторичная клеточная стенка, и особенно много их в клетках-спутницах [187]. Во время роста клеток растяжение стенок происходит неравномерно, в результате чего клетки вытягиваются, и меняется плотность распределения плазмодесм. Предполагается, что диффузия - основной механизм передвижения веществ по плазмодесмам [233]. Регуляция пропускной способности симпластного пути транспорта может реализовываться, скорее всего, через изменения площади шейных сужений плазмодесм, а также вариаций плотности плазмодесм на поверхность клеток.

Плазмодесмы, образованные плазматической мембраной, содержат и центральный элемент, образованный специфической формой кортикального эндоплазматического ретикулума, обеспечивающего мембранную эндоплазматическую континуальность в пределах растительной ткани (рис.1) [43]. Поскольку элементы эндоплазматического ретикулума часто локализуются вблизи ядерных оболочек, взаимодействуют с ними, пространственно все ядра оказываются объединенными этой разветвленной системой цистерн и трубочек эндоплазматического ретикулума [48]. В последние годы споры о стержневом или трубчатом строении эндоплазматической сети внутри плазмодесм сменились, наконец, осознанием возможности обратимых переходов из одного структурного состояния в другое [13]. При этом по наружному кольцу сечения плазмодесм осуществляется диффузионный контакт цитоплазматических компартментов, по внутреннему - эндоплазматических, включающих и вакуоль [106]. десмотрубочка

Клетки, соединенные между собой плазмодесмами, образуют сеть объединенных протопластов, названную симпластом. Существуют доказательства межклеточной коммуникации через апопласт [103, 218]. Однако роль симпласта в растительном транспорте до конца непонятна. Симпласт важен в транспорте ионов и метаболитов, особенно, где присутствуют апопластные барьеры, как во многих клетках желез и в кортексе корней [69], так и в суберинизированных стенках между клетками мезофилла и оболочками пучков клеток С4-раетений [184]. Плазмодесмы также обеспечивают потенциальные пути для раздражителей, которые могут служить в качестве регуляторов и активаторов клетки [58].

Плазмодесмы с двумя транспортными каналами (цитоплазматическим и вакуолярным/эндопластным) представляют в высших растениях основные транспортные русла для обмена факторами транскрипции, гормонами, ионами, растворами солей и рибонуклеиновыми комплексами [83]. Детальное ультраструктурное изучение плазмодесм Overall с сотр. [194] привело к предположению, что плазмодесмы высших растений являются аналогами щелевидных контактов животных. Следует признать возможным существование нескольких типов плазмодесм даже у одного организма [51], что, возможно, связано с различиями в их функциях. Молекулярная природа плазмодесменных белков остается не выясненной даже после многих лет изучения. Но недавние развитие иммуно флуоресцентных методик позволило идентифицировать белки, которыми могут быть обогащены плазмодесмы. Эти белки включают актин, миозин, калретикулин, центрин и кальций-зависимую протеинкиназу [37, 39, 193,247]. Новые взгляды на дополнительные функции плазмодесм позволяют говорить о том, что высшие растения функционируют как надклеточный организм Г158. 160, 172].

Простейшие примеры ограниченной диффузии

В случае объемной диффузии молекулы не встречают на своем пути какого-либо препятствия, и диффузионное движение можно изобразить с помощью вероятности P(r0lr,t), где молекулы из положения го будут перемещаться к положения г за временной интервал t. Распределение их пространственных смещений описывается уравнением Гаусса: P(r0lr,tM4xDt)-3/2exp[-(r-ro)2/4Dt], (2) где D — коэффициент диффузии. Подставив это уравнение в уравнение (1) получим: R=expf-y2g2d2tDJ (3) В случае ограниченной диффузии молекулы при передвижении встречают на своем пути препятствия. Выражения для диффундирующих молекул в ограниченных геометриях с правильной структурой пор (прямоугольные, сферические, цилиндрические поры [І1, 54, 226]) были получены на основе решений уравнения диффузии при начальном условии Р(г 1гь0)=8(г-гд (4) и граничном условии DaP(rlrQ,t)/ai+HP(rIr0,t)=0 (5) на поверхности пор, где Н - релаксационная мощность, или коэффициент скорости абсорбции молекул на поверхности поры, &дп — производная по внешней нормали к поверхности поры. В случае полностью отражающих стенок Н=0; для полностью адсорбирующих стенок #=о и граничное условие требует Р=0.

Диффузия в ламинарной системе является примером ограниченной диффузии, когда жидкость помещена между двумя бесконечными параллельными барьерами, удаленными на какое-либо расстояние а друг от друга. В направлении параллельном барьерам диффузия неограниченная, но движение в перпендикулярном направлении модифицировано за счет присутствия ограничивающих барьеров, для этой ситуации применяют Р(го/г,0[226]ввиде: P(r0lr,t)=(4mDty!exp[-(r-r0)2lll4Dt] [l+2Zexp( 48 n WDt/a2)cos(nm-j/a) cos(n7WoJa)]; (6) Подставив этот пропагатор в уравнение (1), можно получить выражение для фактора R при больших временах: Ra limR=2[l-cos(ygda)]/(yg5a)2 (7)

Подстрочные индексы ] и j. используются для обозначения векторных компонентов параллельных и перпендикулярных к барьерам. Другой простой пример ограниченной диффузии может быть обнаружен для однородной жидкости, содержащейся в сферической полости радиусом р. Rco =9[ySgp cos(ySgp)-sin(y8gp)]2/(ySgpf (8) из этого следует lnR l/5(y5gp)\ (9) Диффузионное затухание, нормированное на релаксационный вклад, можно представить в виде фазового сдвига, усредненного по ансамблю спинов [54, 162]. Например, для проекции самодиффузии на ось z оно записывается как Щ А(Ч, =(ехр[і2щ2]). (10) Раскладывая (10) в области малых q в ряд Тейлора A(q,tJ l-l/2(27rq)2 Z2J ..., где (Z2)=([z(t )-z(0)]2) - среднеквадратичное смещение спинов за время диффузии вдоль направления градиента магнитного поля, легко показать, что начальный участок диффузионного затухания (при q— 0) содержит информацию о величине (Z2) независимо от вида диффузионного пропагатора. Эффективный коэффициент самодиффузии определяется как тангенс угла наклона касательной к начальному участку диффузионного затухания [21] 0 ( =-1/4?? liman[A(q,Q]/ \ (11) в рассматриваемом одномерном случае D (td)=(Z2y2td. В системах, где D не зависит от времени диффузии, его называют средним коэффициентом самодиффузии. Измерение эффективного КСД, не требуя большого диапазона затухания сигнала, не требует больших градиентов магнитного поля.

Анализ временной зависимости эффективного КСД является самым простым и важным этапом исследования самодиффузии в сложных системах (полимерах высоких молекулярных масс [55] и системах с ограничениями [54]), обеспечивая полезный ориентир по взаимозависимости пространственных и временных масштабов эксперимента [3]. Для самодиффузии в системах с ограничениями различают три режима зависимости эффективного КСД от времени диффузии. Перед рассмотрением этих режимов введем термин «диффузионной длины». Диффузионная длина L - это расстояние, которое проходит молекула диффузанта в объеме за время диффузии, L& «f Dtd, где D — коэффициент самодиффузии молекул в объеме.

В режиме малых времен диффузии среднеквадратичные смещения молекул много меньше линейного размера поры а, Ь«а. Практически для всех молекул D -D, и только та часть молекул, которая находилась в непосредственной близости от ограничивающей поверхности поры в момент начала измерения, будет иметь ненулевую вероятность столкнуться со стенкой поры. Для молекул, испытавших столкновение с поверхностью поры, диффузионный пропагатор уже не будет функцией Гаусса.

Режимом промежуточных времен диффузии называют условия проведения эксперимента, при которых Ltza, или td&c?/D. Здесь, в отличие от коротковременного режима, большее количество молекул диффузанта имеет возможность столкнутся со стенкой поры. Эффективный коэффициент самодиффузии в этом режиме «чувствует» наличие препятствий и становится убывающей функцией времени.

В длинновременном режиме диффузионная длина больше линейного размера поры, td»a2/D. Молекулы диффузанта в равной степени «чувствуют» влияние ограничивающих поверхностей, движение молекул усредняется по всему пространству пор.

Если самодиффузия наблюдается в полностью изолированной поре, то регестрируемые среднеквадратичные смещения молекул, естественно, будут ограничиваться величиной поры. Поэтому с ростом времени диффузии наблюдается уменьшение эффективного КСД. В пределе td- co эффективный КСД стремится к нулю. Характерный признак длинновремешюго режима для изолированных пор - выполнение зависимости D octjlt которая характеризует полностью ограниченную диффузию. Из данных для D в длинноволновом режиме оценивают линейные размеры пор.

Для системы идентичных изолированных пор в этом режиме диффузионное затухание характеризуется наличием «биений» («эффект диффузионной дифракции» в замкнутых порах [31, 76]), амплитуда которых уменьшается при введении распределения пор по размерам.

Для системы связанных пор в длинновременном режиме эффективный КСД не зависит от времени диффузии, а его значение меньше объемного. В этом случае эффективный КСД называют коэффициентом связности (проницаемости) пространства пор.

Новые аргументы в пользу существования вакуолярного симпласта

До настоящего времени многие проблемы физиологии растений решались, исходя из того, что центральная вакуоль — замкнутый внутриклеточный компартмент, а плазмодесмы, образуя симпласт, обеспечивают диффузионную связь лишь цитогатазматических компартментов клеток. Большинство теоретических построений о транспорте воды и элементов минерального питания в надземные органы основаны на моделе корня, где вакуоль — замкнутый внутри клеток компартмент [4]. Параллельно с этим, с помощью электронной микроскопии в плазмодесмах было выявлено наличие двух транспортных каналов -структура в центре плазмодесм оказалось трубочкой, а не стержнем, как считалось ранее [204, 207]. В дальнейшем такие данные были подтверждены методом конфокальной микроскопии [152]. На повестку дня встал вопрос о том, какие компартменты клеток соединяет центральная десм отруб очка? Отвечая на этот вопрос, Гамалей представил данные, позволяющие говорить, что вакулярная мембрана - тонопласт - элемент энд о плазматической мембранной сети, и десмотрубочка плазмодесм соединяет эндоплазматические пространства, а значит и вакуоли соседних клеток в единый надклеточный континуум. По наружному кольцевому сечению плазмодесм осуществляется контакт цитоплазматических компартментов. В результате исследований Гамалея возникла гипотеза о существовании в растительной ткани не только цитоплазматического, но и вакуолярного симпласта. Если эта гипотеза верна, то появляется необходимость пересмотра классических представлений, касающихся многих аспектов межклеточного обмена веществ в растениях, поскольку ни одна из соответствующих проблем, по существу, не рассматривалась исходя из существования в плазмодесмах двух регулируемых транспортных каналов, -с позиции существования вакуолярного симпласта. Первые исследования по этому вопросу проведены IO.B. Гамалеем [15]. Полученные в нашей лаборатории методом ЯМР экспериментальные данные о межклеточном водообмене в корне пшеницы также адекватно интерпретируются с этой позиции [8].

Однако идея о вакуолярном симпласте воспринимается далеко не всеми исследователями, особенно зарубежными. Многие рассматривают плазмодесмы как русла для объединения только цитоплазматических компартментов [120].

Цель настоящей главы - представить полученные нами экспериментальные свидетельства, подтверждающие идею о вакуолярном симпласте, как регулируемом русле для водообмена у растений.

Объектом исследования служили корни 4-дневных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L.). Семена вымачивали в течение 8 ч под проточной водой, затем помещали в увлажненную, свернутую рулоном фильтровальную бумагу и выращивали в термостате при 25 С. Корни слегка обсушивали фильтровальной бумагой и нарезали на сегменты длиной 7 мм (из зоны растяжения, лежащей далее 8 мм от кончика корня). Предварительно отсеченные сегменты выдерживали два часа в дистиллированной воде и аэрируемых условиях (на качалке) для устранения стрессовой реакции транспортной системы корня на отсечение.

Для исследования самодиффузии молекул воды использовали метод спинового эха ЯМР (на протонах) с импульсным градиентом магнитного поля (метод ЯМР ИГМП). Сегменты помещали в датчик ЯМР-диффузометра так, что градиент магнитного поля был направлен параллельно радиальному сечению корня, что позволяло регистрировать самодиффузию воды в этом направлении. Рассмотрим подробнее основы метода.

Если на образец, находящийся в магнитном поле, подать радиочастотный импульс определенной длительности на частоте резонанса интересующих нас ядер (протонов в нашем случае), то в охватывающей образец катушке возникает сигнал ядерной индукции, который можно детектировать. Через некоторый отрезок времени индукция исчезает (наблюдается спад поперечной намагниченности). Если после этого снова подать радиочастотный импульс, то через отрезок времени, равный времени между двумя радиочастотными импульсами, в приемном тракте появится сигнал спинового эха (нарастание с последующим спадом поперечной намагниченности), амплитуда которого будет тем меньше, чем больше интервал времени между подаваемыми радиочастотными импульсами. Это затухание спинового эха в импульсном методе ЯМР происходит по двум причинам, различающимся по своей природе — 1) за счет процессов взаимодействия спинов между собой и со спиновым окружением - решеткой (т.н. "релаксационное затухание"), и - 2) за счет наличия диффузионного перемещения резонирующих ядер по образцу (т.н. "диффузионное затухание"). Диффузионное затухание проявляется только в неоднородном магнитном поле (при наличии градиента магнитного поля), поэтому вычленение диффузионного затухания из общего затухания эха на практике производят путем регистрации затухания относительной амплитуды эха (отношения амплитуды эха без градиента магнитного поля к амплитуде эха в присутствии градиента магнитного поля). Информацию о коэффициенте самодиффузии (КСД) молекул в использованном методе получают из анализа зависимости диффузионного затухания (ДЗ), т.е. зависимости относительной амплитуды сигнала спинового эха А/А0 (см. ниже формулу (12)), от параметров импульсного градиента магнитного поля - амплитуды (g) и длительности (8), а также от времени наблюдения диффузии - td (временного интервала между импульсами градиента магнитного поля). А0 - начальная амплитуда сигнала эха без градиента магнитного поля, А - амплитуда сигнала эха в присутствии градиента магнитного поля, a D — коэффициент самодиффузии. Детали методики подробно изложены в работе [226]. В цитируемой классической работе отношение А/А0 обозначали буквой R.

Регуляция водопроницаемости вакуолярного симпласта

К настоящему времени можно считать установленным, что расположенная в центре поперечного сечения плазмодесм мембранная структура является полой десмотрубочкой, соединяющей в единый надклеточный континуум эндоплазматические пространства соседних клеток. Также представлены аргументы в пользу того, что центральная вакуоль является составным элементом эндоплазматического пространства клетки, а значит, и вакуоли соседних клеток посредством десмотрубочек объединены в надклеточный континуум [13, 14]. Стало возможным говорить не только о классическом (цитоплазматическом) симпласте, но и об эндо плазматическом (или вакуолярном) симпласте. Терминология пока не устоялась. В настоящей работе мы используем термин "вакуолярный симпласт", как более соответствующий проблемам водообмена в растениях. Значимость вакуолярного симпласта как транспортного русла подтверждается способностью десмотрубочек к регуляции водопроницаемости. Установлено, что десмотрубочка способна переходить из открытого состояния в закрытое и обратно под действием ряда факторов, как экзогенной, так и эндогенной природы [13, 14]. Предполагается, что в механизме таких переходов и в регуляции водопроницаемости десмотрубочек вакуолярного симпласта задействован АТФ-зависимый сфинктер [6, 13].

Чтобы попасть в вакуолярный симпласт, молекулы воды должны пройти через вакуолярную мембрану - тонопласт. В итоге, водопроницаемость этого симпласта, по-видимому, контролируется как водопроницаемостью десмотрубочек, так и водопроницаемостью тонопласта, которая тоже способна к регуляции, поскольку связана со специфическими белками аквапоринами [232]. Поток воды по тканям растения может идти двумя путями: внеклеточному (апопластному) и трансклеточному. Эти два пути взаимодействуют между собой: при уменьшении потока по апопластному пути может увеличиваться водопроницаемость трансклеточного. В механизме соответствующих переключений важная роль может принадлежать фитогормону стресса - абсцизовой кислоте (АБК) [176]. Хотя АБК присутствует практически во всех тканях растения и обладает ярко выраженной полифункциональностыо, некоторые авторы указывали на непосредственные эффекты этого гормона на гидравлическую проводимость корня [121, 130]. Было показано, что в корнях кукурузы АБК, применяемая в концентрациях 0,1-1 мкМ, увеличивала гидравлическую проводимость как на уровне всего органа, так и на уровне плазмалеммы его кортикальных клеток [121]. При этом остается не раскрытой роль вакуолярного симпласта в регуляции водопроницаемости корня.

В этой главе, с целью демонстрации регуляторных возможностей вакуолярного симпласта, предпринято исследование влияния экзогенной АБК и ингибитора энергетического метаболизма азида натрия на водопроницаемость десмотрубочек и тонопласта, как структурных элементов вакуолярного симпласта, обеспечивающих, водопроницаемость этой транспортной системы.

Объект исследования и методика контроля водопроницаемости десмотрубочек по изменениям величины эффективного КСД, вычисляемого по наклону начального участка ДЗ, при времени наблюдения диффузии равном 700 мс, подробно описаны в предыдущей главе.

Контроль изменений водопроницаемости вакуолярной мембраны — тонопласта основан на другом постулате. Мы уже отметили, что ДЗ в растительной ткани не является экспоненциальным (логарифм ДЗ не является прямой линией). Не является экспонентой и ДЗ от воды вакуолярного симпласта (см. ниже любой из рис. 11, 12 или 13). В работах [55, 123] было показано, что весь ансамбль молекул диффузанта в пористой среде можно разделить на две подсистемы с различающимися КСД: первая -это молекулы, свободно диффундирующие по системе порового пространства, а вторая — это молекулы, испытавшие столкновение со стенками (в рассматриваемом нами случае — столкновение с вакуолярной мембраной). При этом конечный участок соответствующего неэкспоненциального ДЗ связывается с той частью (подсистемой) молекул, которая испытала столкновения со стенкой, поскольку именно эта часть молекул не подчиняется гауссову распределению и вызывает неэкспоненциальность ДЗ [55, 123]. Естественно было предположить, что КСД, соответствующий этой подсистеме, (определяемый по наклону конечного участка ДЗ) будет зависеть от проницаемости стенки для диффундирующих молекул (от водопроницаемости мембраны). Это предположение было экспериментально подтверждено на растительных тканях [1].

Такой же методический подход был использован и в настоящей работе: об изменениях водопроницаемости тонопласта судили по изменениям наклона (т.е. КСД) фракции молекул вакуолярной воды, которая давала вклад в ДЗ на его конечном экспоненциальном участке (на конечном прямолинейном участке в полулогарифмической системе координат, см. ниже рис. 12).

Использованы реактивы: абсцизовая кислота — abscisin II и азид натрия ("Serva", ФРГ). Экспозиции сегментов корней в растворах АБК и азида натрия осуществлялись в аэрируемых условиях (на качалке). Во всех вариантах опытов и в соответствующих контролях наружный раствор доводился до рН = 4,5 с помощью НС1.

Напомним ещё раз определяющие моменты использованного нами методического подхода, а именно: 1). что изменения (по сравнению с контролем) эффективного коэффициента самодиффузии (D ), вычисленного по начальному наклону получаемых в эксперименте ДЗ, обусловлены изменениями водопроницаемости десмотрубочек вакуолярного симпласта; 2) а изменения коэффициента самодиффузии (D), вычисленного по наклону конечного участка ДЗ, обусловлены изменениями водопроницаемости вакуолярной мембраны - тонопласта. Конечно, позиции 1) и 2) справедливы лишь при временах наблюдения диффузии, когда сигнал формирует только вода вакуолярного симпласта.

Похожие диссертации на Изучение механизмов регуляции водопроницаемости плазмодесм и тонопласта импульсным методом ЯМР