Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Вакуоль - гомеостатическии компартмент растительной клетки .8
Глава 2. Функции вакуоли 16
2.1. Лизосомальная функция вакуолей 16
2.2. Запасающая функция вакуолей 22
2.3. Защитная функция вакуолей 27
2.4. Роль вакуоли в трансдукции сигналов в растительных клетках 32
2.5. Гомеостатическая регуляция ионного состава цитозоля растительных клеток 35
2.6. Осмотическая функция вакуолей 43
Глава 3. Методы выделения вакуолей 46
Глава 4. Материалы и методы 52
4.1. Растительный материал 52
4.1.1. Красная столовая свекла, Beta vulgaris L 52
4.1.2. Культура ткани пшеницы Triticum aestivum L. сорта Скала 53
4.2. Изучение динамики роста культуры клеток пшеницы 54
4.3. Экстракция клеточного сока из тканей корнеплодов красной столовой свеклы 54
4.4. Измерение осмотического потенциала и гипотонический стресс 55
4.5. Определение водорастворимых Сахаров 56
4.6. Определение неорганических ионов .56
4.7. Расчет концентрации метаболитов и ионов в клеточном соке 57
4. 8. Статистическая обработка данных и построение "фазовых портретов" .58
Глава 5. Химический состав клеточного сока из гетерогенных тканей корнеплода 60
Глава 6. Осмотически активные компоненты в тканях корнеплода красной столовой свеклы 69
Глава 7. Распределение Сахаров и ионов на фазовой плоскости 74
7.1. Соотношение сахара/ калий в ткани корнеплода после гипотонического стресса 76
7.2. Соотношение сахара/ калий и сахара/ натрий в растущих корнеплодах .78
Глава 8. Осмотически активные компоненты в каллусах пшеницы 87
Выводы 98
Список приводимых сокращений 101
Литература 102
Приложение 124
- Гомеостатическая регуляция ионного состава цитозоля растительных клеток
- Культура ткани пшеницы Triticum aestivum L. сорта Скала
- Осмотически активные компоненты в тканях корнеплода красной столовой свеклы
- Соотношение сахара/ калий и сахара/ натрий в растущих корнеплодах
Введение к работе
Известно, что центральные вакуоли, состоящие из вакуолярного сока и вакуолярной мембраны (тоиопласта) определяют специфику растительных їсиеток и не встречаются у организмов не относящихся к растениям. Занимая до 90 и более процентов от объема клетки, большие центральные вакуоли играют особую роль в структурной и функциональной организации растительного организма. Они активно участвуют во внутриклеточном накоплении и распределении веществ, что находит отражение во многих их функциях (Саляев, 1969; МаШе, 1975; Андреев, 2001).
Одной из таких функций является участие в поддержании осмотического давления клетки. Об этой функции центральной вакуоли известно достаточно давно. В то время как эта органелла была еще недостаточно изучена, уже было известно, что в регуляции внутриклеточного осмотического давления участвует центральная вакуоль. Позднее было выяснено, что осмотическая функция определяет не только создание упругости клеток, но и поддержание постоянства внутриклеточной среды (равновесия между вакуолярным и цитоплазматическим компартментами) в режиме оптимального метаболического функционирования всей клетки, т. е. участвует в поддержании гомеостаза. Осмотическая регуляция в растительной клетке осуществляется накоплением не только воды, но и осмотически активных компонентов в вакуолях. Эти компоненты могут определять специфику растительных клеток, играя особую роль в их структурной и функциональной организации. Общая стратегия, свойственная осморегуляции растительных клеток с участием вакуоли, состоит в том, что всегда соблюдается строгая сопряженность поступления в вакуоль и выхода из нее тех ионов и метаболитов, которые участвуют в регуляции клеточного тургора. Хорошо известно, что в ряде случаев такой осмотический баланс может достигаться благодаря аккумуляции внутри вакуолярного и цитозольного компартментов осмолитов различной природы.
Изучение закономерностей распределения осмотикообразующих компонентов в клетке, лежащих в основе формирования осмотического потенциала в растительных тканях представляют несомненный интерес для изучения механизмов поддержания гомеостатического равновесия в растениях. Кроме того, эти закономерности тесно связаны с толерантностью растений к различного рода стрессам. Ведь известно, что осмотический потенциал клетки - это форпост, который принимает первый удар неблагоприятных условий, при этом по его изменению можно судить о том, насколько клетка смогла этим условиям противостоять (Андреев, 2001). В настоящее временя динамику распределения и накопления осмотически активных компонентов изучают в связи с различными физиологическими состояниями растений, например с устойчивостью к различным стрессам (Keller, Ludlow, 1993; Yuncai Ни, Schmidhalter, 1998), с осмотической функцией замыкающих клеток устьиц [Poffenroth, 1992; Talbott, 1996; Talbott,
1998), водным режимом, минеральным питанием (Leigh, 1993) и целым рядом других физиологических процессов.
В представляемой работе мы попытались по новому взглянуть на закономерности перераспределения осмотически активных компонентов в тканях растений в процессе формирования гомеостаза и представить полученные данные в виде графических 2-х и 3- мерных изображений, названных нами "фазовыми портретами". А также провести параллель между балансом осмотически активных компонентов в тканях и процессами роста и морфогенеза.
Работа была выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, в лаборатории физиологии растительной клетки.
Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю чл.- корр. РАН Р. К. Саляеву за постоянное внимание и всестороннюю поддержку.
Автор благодарит также за плодотворную совместную работу Л. В. Дудареву и В. М. Сумцову, С. В. Осипову, а также коллектив лаборатории и Н.В.
Озолину.
Гомеостатическая регуляция ионного состава цитозоля растительных клеток
Хорошо известной функциональной особенностью всех эукариотических клеток, в том числе и растительных, является поддержание в их цитозоле определенных концентраций неорганических ионов, прежде всего ЇҐ, К+, Na+, Са2+, Mg2+, иначе говоря, определенного ионного окружения функционирующих здесь биополимеров. Этот процесс, называемый поддержанием ионного гомеостаза, состоит в регуляции концентрации неорганических ионов в цитоплазме. В растительных клетках такая регуляция основана на контролируемых процессах поглощения и секреции ионов, транспортируемых через плазмалемму или мембраны внутриклеточных органелл, а также аккумуляции ионов внутри этих органелл. К настоящему времени доказано, что среди них ключевую роль в рассматриваемой ионной регуляции играет вакуоль. Ее потенциальная способность к выполнению этой важной функции в клетке обусловлена не только большим размером, но и тем, что она может наїсапливать внутри себя значительные концентрации как основных физиологически важных ионов, таких как Н+, К+, Na+, Са2+, Mg2+, СГ, N03", НР042", так и обладающих токсическим действием на растительные клетки (Cd + и Zn2+) и некоторые другие.
Примером участия вакуоли в ионном гомеостазе растительных клеток, является регуляция их цитозольного рН, наблюдаемая после инкубации растительных клеток или тканей в буферных средах с различным значением рН (Roberts, Wemmer, Ray, Jardetzky, 1982; Torimitsu, Yazaki, Nagasuka, Ohta, Sakata, 1984; Way, Schiel, Berlin, Witte, 1985). Так с помощью метода 31 Р-ЯМР установлено, что в клетках суспензионной культуры табака и корней маша цитозольный рН остается неизменным при снижении внеклеточного рН, тогда как рН вакуолярного компартмента также снижается [Roberts, Wemmer, Ray, Jardetzky, 1982; Torimitsu, Yazaki, Nagasuka, Ohta, Sakata, 1984). Этот результат свидетельствует о том, что при низком наружном рН импорт протонов в цитозоль компенсируется соответствующим транспортом их внутрь вакуоли. Снижение вакуолярного рН в клетках суспензионной культуры табака, связанное с регуляцией цитозольного рН, наблюдалось и в случае избыточной продукции протонов в цитозоле в анаэробных условиях (Torimitsu et al., 1984). Регуляция внутриклеточного рН с участием вакуоли во многом реализуется благодаря действию в вакуолярной мембране двух протонных насосов, КҐ- АТФазы и ЕҐ" пирофосфатазы, катализирующих транспорт протонов через тонопласт из цитозоля в вакуоль (Rea, Sanders, 1987). Установлено, что снижение активности этих двух генераторов Дц.н+ на тонопласте в тех или условиях отражается в закислении цитозоля растительных клеток (Brauer, Ukuales, Triana, Shacher-НШ, Ти, 1995). Однако вклад вакуоли как существенного компонента биофизического рН- стата в регуляцию цитозольного рН в сильной степени зависит от типа растительных клеток (Kurkadjian, Guern, 1989). Очевидно, что в таких клетках активная аккумуляция протонов внутри вакуоли имеет иное функциональное назначение, и, как правило, оказывается необходимой для гомеостатической регуляции содержания других неорганических ионов в цитозоле.
К числу последних относятся ионы К+, Na+ которые в вакуолизированньгх растительных клетках в основном распределены между вакуолярным и цитозольным пулами.
Вакуолярный пул К+ самый большой по своему размеру, и К+ в этом компартменте главным образом выполняет функцию, связанную с увеличением осмотического потенциала внутри вакуолярной среды и, соответственно, генерацией внутриклеточного гидростатического давления или тургора. Напротив К+ в цитозоле участвует не только в регуляции осмотического давления внутри этого компартмента, но также активно включается в биохимическую регуляцию активности целого ряда функционирующих здесь ферментов (Evans, Sorger, 1966; Leigh, Wyn, 1984). Поэтому уже давно предполагалось, что, когда уровень калия во внеклеточной среде значительно изменяется, его концентрация в цитозоле сохраняется на постоянном уровне за счет буферной роли вакуоли (Jeschke, Stelter, 1976). Результаты исследований, проведенных ранее с использованием косвенных и полуколичественных экспериментальных подходов (Jeschke, Stelter, 1976; Huang, Van Steveninck, 1989), подтвердили справедливость этого предположения. Однако до недавнего времени не было проведено строго количественных измерений активности ионов К+ в вакуоли и цитозоле растительных клеток in situ в условиях различной обеспеченности их этим катионом в наружной среде. Такие измерения были выполнены с помощью микроэлектродов особого типа только в последние годы при использовании для этой цели клеток корней ячменя (Walker, Leigh, Miller, 1996). Авторами цитируемой работы были получены наиболее убедительные доказательства сохранения на постоянном уровне активности К в цитозоле за счет изменения его активности в вакуоли при вариации уровня внеклеточного калия. Иначе говоря, продемонстрирована гомеостатическая регуляция уровня К"1" в цитозоле растительных клеток за счет его вакуолярной компартментации.
Культура ткани пшеницы Triticum aestivum L. сорта Скала
В исследованиях биологических объектов успех работы во многом зависит от методики выделения необходимого количества достаточно чистой фракции этих объектов. Не являются исключением и вакуоли растительных клеток. После первых попыток изолировать отдельные вакуоли микрохирургическим путем, предпринятых в конце 19-го - начале 20-го столетий, наблюдался длительный перерыв в разработке новых методов выделения интактных вакуолей (de Vries, 1885; Plowe et al., 1931 цит. по Саляев, 1969). Перед исследователями стояли две задачи: выделение и очистка фракции крупных центральных вакуолей; и выделение и очистка фракции мембран вакуолей (тонопласта). Возможность выделения вакуолей иным способом появилась в 60-е годы, после разработки метода получения изолированных протопластов путем ферментативного лизиса клеточной стенки. Протопласты переносили в гипотонический раствор сахарозы, и это приводило к их осмотическому набуханию и высвобождению интактных вакуолей (Cocking, 1960). Позднее были предложены ряд прогрессивных модификаций этого метода, направленных на получение больших количеств вакуолей (Gregory, Cocking, 1966). Однако фракции изолированных вакуолей не смогли очистить от примесей.
В получении препаративных количеств изолированных вакуолей наибольшие успехи были достигнуты для дрожжевых клеток (Wiemken, 1975). Приемы выделения и экспериментирования с изолированными вакуолями дрожжевых клеток значительно облегчили дальнейшую разработку методических подходов к изоляции центральных вакуолей из зрелых растительных клеток, поэтому с середины 70-х наблюдалось появление различных модификаций методов получения препаративных количеств вакуолей растений. Особенный прогресс в изоляции вакуолей был достигнут после того, как обнаружили, что у изолированных протопластов в гипотоническом фосфатном буфере при рН 8, происходит мягкое осмотическое разрушение плазмалеммы, при котором высвобождаются интактные центральные вакуоли и другие органеллы (Wagner, Siegelman, 1975). Метод мягкого лизиса плазмалеммы в различных модификациях (осмотического, химического, механического) нашел широкое применение для выделения вакуолей из целого ряда различных растений. Сконструировав специальный нарезающий аппарат, позволяющий производить множественное нарезание растительной клетки, Ли и Брэнтон (Leigh, Branton, 1976) показали, что известный способ выделения вакуолей путем механического перерезания клеток может быть с успехом применен для получения препаративных количеств вакуолей из запасающих органов растений. С различными усовершенствованиями, этот механический способ позволял выделять до 10б- 107 вакуолей за один цикл выделения, путем разовой переработки больших количеств растительной ткани (Leigh, Branton, 1976; Leigh et al., 1979, 1980; Marty et al, 1980). Таким образом, с помощью методических подходов удалось разработать способы извлечения вакуолей, как из целой растительной ткани, так и из изолированных протопластов. Но в литературе на тот период отсутствовали четко сформулированные общие принципы выделения и очистки вакуолей для большинства растений. Поэтому выделение и фракционирование вакуолей в каждом конкретном случае - это был процесс перебора различных имеющихся приемов работы, а не целенаправленное прогнозирование свойств вакуолей и уже на этой основе составление подходящих методических прописей. В 1980 году в Сибирском институте физиологии и биохимии растений была предложена модификация метода Ли и Брэнтона (препаративного выделения вакуолей). Разработанная схема и оборудование для выделения позволили за один цикл получать из корнеплодов красной столовой свеклы до 109 вакуолей (чистота не менее 95-98% по объему) и в течение месяца накапливать фракции очищенного тонопласта до 200-300 мг. Кроме того, были разработаны принципы выделения вакуолей из клеток, а также общий подход к их фракционированию (Саляев и др., 1981). Они заключались в использовании высоких концентраций КСГ, в качестве главного осмотического компонента, в использовании методов дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности. Был обоснован принцип расчета плавучей плотности изолированных вакуолей по удельной плотности и осмотическому давлению сока выжатого из клеток, который позволил без длительного и трудоемкого подбора вариантов составлять прописи ступенчатых градиентов плотности, обеспечивающие фракционирование препаративных количеств очищенных вакуолей из разных запасающих органов растений. Одним из наиболее удачных объектов являлись корнеплоды красной столовой свеклы, имеющие окрашенные вакуоли, что позволяло легко контролировать выход вакуолей на разных стадиях выделения. Разработка такого метода позволила получать не только значительные количества тонопласта, но и вакуолярный сок в больших объемах и обнаружить в нем ряд метаболитов и ионов, подтверждающих мультифункциональную роль вакуоли в растительной клетке. Вакуоли, выделенные из корнеплодов красной столовой свеклы, по описанному выше модифицированному методу, имели размеры от 10 до 80 мкм в диаметре. Плавучая плотность этих органелл колебалась от 1,050 до 1,150 г/см (Саляев и др., 1982). Вакуоли в градиенте плотности разделялись на "легкие" и "тяжелые". Тогда, впервые, возник вопрос, о том, с чем может быть связана обнаруженная гетерогенность популяции вакуолей и в чем она выражается на биохимическом уровне.
Осмотически активные компоненты в тканях корнеплода красной столовой свеклы
Расчеты показали, что степень соотношения содержания Сахаров и бетацианинов в клеточном соке имеет высокий положительный коэффициент корреляции (г = 0. 9), и высокий отрицательный между содержанием Сахаров и калия (г = - 0. 86). Также было установлено, что изменение осмотической концентрации связано с изменением концентрации Сахаров - чем выше Роем, тем выше была концентрация Сахаров. Что касается ионов калия, то связь между приростом [К+] и увеличением осмотической концентрации была значительно ниже, чем в случае с сахарами. Связь между концентрацией ионов натрия и хлора и осмотической концентрацией незначительна.
Таким образом, было выявлено, что клетки корнеплода красной столовой свеклы, находясь на разных стадиях дифференциации, отличаются не только размерами, но и концентрациями метаболитов и ионов, находящихся в клеточном соке. Клетки, прилегающие к проводящим элементам ("темные" зоны), являются активно делящимися, с высокой аттрагирующей способностью. Можно предполагать, что значительные концентрации сахарозы в них обеспечивают протекание высокоэнергетических процессов, характерных для таких клеток (Миляева, 1996). Помимо этого, сахароза также играет роль и "запасного" метаболита в корнеплоде, что связано с особенностями онтогенеза красной столовой свеклы. В литературе последних лет (Smeekens, 2000) также отмечается важная роль сахарозы в процессах связанных с экспрессией генов. Показано участие сахарозы и таких гексоз как глюкоза и фруктоза в регуляции передачи сигнала в каскадах сигнальной транедукции в клетке. Помимо всего вышесказанного обнаруженные высокие концентрации сахарозы в вакуолях также свидетельствуют и о том, что этот дисахарид принимает участие в поддержании осмотического потенциала клетки. Его высокие концентрации (клеточный еок являлся фактически 10 % раствором сахарозы) (Саляев и др., 1997) , значительно превышающие концентрацию калия, указывают на то, что сахара могут быть в клетках "темных" зон основным осмотически активным компонентом. Интересна также обнаруженная закономерность в распределении бетацианинов в клеточном соке "темных11 и "светлых" зон, заключающаяся в высокой положительной корреляции с концентрацией Сахаров (рис. 2). Беталаины, к которым относятся бетацианин и бетаксантин - класс водорастворимых пигментов, исследуемый достаточно давно. Однако функциональное значение их недостаточно изучено по сравнению с другими классами растительных пигментов, такими как хлорофиллы, флавоноиды и каротиноиды. В отличие от многих других пигментов бетаксантин и бетацианин аккумулируются не в пластидах, а в вакуолях, придавая им яркую окраску. И, как нередко бывает, о функциях этих пигментов в растениях известно намного меньше, чем об их метаболизме в животных организмах. Известно, что они обладают антиоксидантными свойствами. Например, перекисное окисление линолевои кислоты с помощью цитохрома с ингибируется бетанином (а также бетанидином, катехином и а токоферолом). В медицинской литературе имеются сведения о том, что бетацианины обладают антиканцерогенными действием (Wettasinghe, 2002). Почему в "темных" зонах выше концентрации бетацианина, а в "светлых" бетаксантина? Чем объясняется высокий положительный коэффициент корреляции между сахарами и пигментами в вакуолях красной столовой свеклы? На наш взгляд, это интересные вопросы, требующие отдельного исследования. Исходя из имеющихся в литературе данных, мы можем предположить, что в быстрорастущих клетках антиоксидантная система должна быть более эффективной, чем в дифференцированных (Мерзляк, 1989). С этим фактом может быть связана относительно более высокая концентрация бетацианина. Возможно, также, что антиоксидантными свойствами в большей степени обладает бетацианин, а не бетаксантин. Таким образом, при анализе полученных результатов нами было обнаружено существенное отличие" как в химическом составе клеточного сока из различных зон корнеплода, так и в размерах клеток из МП и ПП зон. Полученные данные позволили говорить о "сахарных" и "солевых" типах клеток, вакуолей и, вообще, о "сахарном" и "солевом" статусе клеток проводящих пучков и межпучковой паренхимы.
Соотношение сахара/ калий и сахара/ натрий в растущих корнеплодах
Полученные результаты для удобства обсуждения можно разделить на три части: а) биохимическую, в которой был изучен состав и соотношение осмотикообразующих компонентов в растительной ткани, б) методологическую, в которой был предложен и апробирован вероятностный метод построения "фазовых портретов" для более глубокого изучения закономерностей формирования осмотического потенциала и, наконец, в) анализ связей выявленных закономерностей с процессами роста и морфогенеза.
В первой части было показано, что клетки различных тканей корнеплодов красной столовой свеклы отличаются по химическому составу клеточного сока. Обнаруженные высокие концентрации сахарозы и калия, сопоставимые с показателями осмотической концентрации, дали основание предположить, что эти компоненты могут участвовать в поддержании осмотического потенциала клеток. Участие неорганических ионов, в частности калия, в регуляции осмотических процессов в растениях считается установленным фактом, современные представления отводят им роль основных осмотикообразующих компонентов. В литературе имеются единичные упоминания (Zeigert et al., 1983; Leigh et al, 1993; Talbott et al, 1998) феномена, когда поглощение калия в клетках сопровождалось выходом из них сахарозы. Есть также данные по солеустойчивым видам растений, когда при аккумуляции высоких концентраций натрия в вакуолях, наблюдали снижение в них концентрации Сахаров (Ни Yimcai, 1998). Наиболее детально, этот вопрос рассматривался в цикле работ, посвященных процессам сахаронакопления в корнеплодах сахарной свеклы (Эллиот, 1996). В некоторых статьях посвященных этим вопросам указывалось, что сахароза и калий участвуют в регуляции осмотического давления (Perry, 1986, 1987). К сожалению, рассматривались относительные величины, а не абсолютные концентрации этих компонентов и приводилось средние значения для ткани корнеплода, т. е. отсутствовали данные по отдельным тканям и зонам. Полученные нами результаты позволили детализировать картину и объяснить, почему в некоторых случаях наблюдалось сопряжение выхода калия из вакуоли и накопления Сахаров, а в некоторых нет. Удалось показать, что увеличение значений осмотического потенциала было достоверно связано с увеличением концентрации сахарозы. Кроме того, нам удалось рассчитать процентный вклад каждого из осмотикообразующих компонентов в клетках на разных стадиях дифференцировки этих клеток и оценить каков их вклад в пересчете на одну клетку.
При анализе распределения Сахаров и ионов в запасающей паренхиме корнеплода нами была отмечена его полимодальность. Распределение вышеназванных компонентов не подчинялось нормальному закону, поэтому стало очевидным, что применение стандартных методов статистики для дальнейшей оценки будет недостаточно информативным. Так например, проведенный регрессионный анализ (Рис. 10, 11) мало что говорил об искомых нами закономерностях распределения и взаимодействии осмотически активных компонентов. По этой причине мы попытались найти иной подход к анализу неравномерного распределения Сахаров и ионов в тканях корнеплода. Этому вопросу посвящена вторая часть наших исследований. Известно, что различные биофизические методы уже давно и с успехом применяются для анализа многих биологических процессов (Карманенко, 1997; Кравацкий, 1998) Для поиска закономерностей в регуляции осмотического потенциала клеток нами было предложено рассмотреть массивы полученных концентраций как изменяющуюся, динамическую систему. Используя терминологию теории динамических систем, такой способ отображения процесса назвали "фазовым портретом". А сами системы триггерными, т. е. обладающими двумя или несколькими устойчивыми стационарными состояниями, к которым стремится система. Между этими состояниями возможны переходы. Способность триггерной системы к переключению явилась основной предпосылкой ее использования как модели процессов, ведущих к дифференцировке клеток в ткани (Малкина, 1988; Веселова, 1990). С этой точки зрения каждая клетка обладает определенным набором возможных устойчивых стационарных состояний (в нашем случае на примере осмотически активных веществ), но фактически, в данный момент, времени функционирует лишь в одном из них. В процессе дифференциации при росте и развитии происходит "переключение" клетки из одного стационарного режима функционирования в другой путем дискретного перехода. В данной работе при использовании такого подхода проявились закономерности, в соответствии с которыми происходит изменение соотношений сахара/калий в осмотическом балансе клеток.
Помимо исследования на отдельно взятом, зрелом корнеплоде был проведен анализ осмотической регуляции в тканях растущих корнеплодов. В результате мы получили картину формирования осмотического потенциала на разных фазах онтогенеза. Примечательно то, что динамика "фазового портрета" на фазовой плоскости имеет колебательный характер (Рис. 13), т. е. наблюдается переход из сахарной области в солевую, затем опять в сахарную, но уже с более высокими концентрациями Сахаров. Такая динамика может служить определенным отражением роста и дифференцировки клеток, т.е. указывать на какой стадии находятся клетки паренхимы корнеплода на данной фазе онтогенеза (Батыгин, 1986). Полученные результаты дали основание предположить, что найденные закономерности, являются фундаментальными для понимания взаимосвязи осмотической регуляции и дифференциации клеток в тканях различных видов растений.
![Психофизиологические особенности клинически здоровых лиц мужского пола и больных артериальной гипертензией в зависимости от индекса массы тела и типа распределения жировой ткани [Электронный ресурс]](/i/i/4429/176970.png "Психофизиологические особенности клинически здоровых лиц мужского пола и больных артериальной гипертензией в зависимости от индекса массы тела и типа распределения жировой ткани [Электронный ресурс] Мартынова Анна Геннадьевна")
