Введение к работе
з ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Усвоение атмосферного азота клубеньковыми микроорганизмами рода Rhizobium в симбиозе с бобовыми растениями во всем мире является объектом пристального внимания ученых разных специальностей Изучение механизма образования подобного симбиоза, факторов специфичности, определяющих возможность формирования азотфиксирующих клубеньков штаммом ризобий на конкретном растении, имеет вместе с теоретическим также и огромный практический интерес. Одним из критических моментов становления бобово-ризобиального симбиоза является стадия взаимного "узнавания" микроорганизма и растения-хозяина. Этот процесс характеризуется сложным обменом сигналами между макро- и микросимбионтом в ризосфере растения-хозяина еще до инвазии клубеньковых бактерий Несомненно, что в данный процесс вовлечены лектины бобовых, которые, как показано, могут обеспечивать избирательные взаимодействия растений с ризобиями благодаря своим углеводсвязывающим свойствам (Brill et al, 2004) В литературе содержатся сведения о расшифрованных последовательностях аминокислот лектинов бобовых, представленных преимущественно видами из различных родов тропических растений, произрастающих в разных географических регионах и обычно имеющих довольно широкий круг способных их инфицировать бактериальных микросимбионтов. Значительно больший интерес для изучения формирования специфичности азотфиксирующих симбиозов представляет выяснение строения лектинов бобовых растений умеренного климата, характеризующихся строгой специфичностью по отношению к своим ризобиальным партнерам.
Знания о ключевых аминокислотах углеводсвязывающего участка, закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, могут быть использованы в моделировании белков с новыми и заданными углеводсвязывающими свойствами Заменяя функционально значимые аминокислоты или области углеводсвязывающих участков можно создавать лектины с заданной специфичностью к сахаридам (а, следовательно, и физиологическими функциями), которые можно применять для решения целого ряда задач в том числе в области биотехнологии, таких как получение высокоочишенных углеводов, создание биочипов и т д Кроме этого, возможно,
что создание модифицированных или гибридных лектинов заметно облегчит исследование их роли в становлении бобово-ризобиального симбиоза
Интродукция чужеродных лектинов в другие бобовые растения может способствовать расширению группы клубеньковых бактерий, из которых макросимбионт в данных почвенно-климатических условиях сможет выбрать наилучшего партнера для симбиоза Это, в конечном счете, должно привести к более высокому уровню азотфиксации и, соответственно, к увеличению урожайности сельскохозяйственных культур
Эксперименты с трансгенными растениями, несущими различные гены лектинов, позволяют оценивать роль этих белков, однако такого рода исследования довольно сложны и, кроме того, процедура трансформации бобовых растений представляет собой достаточно трудоемкий процесс Один из вариантов решения данной проблемы заключается в изучении симбиотической роли лектинов при экзогенной обработке ими растений и микроорганизмов Так, удобным инструментом для подобных исследований являются лектины бобовых, полученные с применением прокариотических экспрессионных систем Такие системы позволяют нарабатывать сконструированные гибридные лектины с заданными свойствами для исследования функционально значимых углеводсвязывающих областей, определяющих возможность формирования бобово-ризобиальных отношений
Цель работы заключалась в выявлении закономерностей строения углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений умеренного климата, создании на их основе гибридных лектинов и исследовании роли гибридных лектинов в становлении бобово-ризобиального симбиоза.
Задачи исследования 1 Амплификация, клонирование и секвенирование фрагментов генов лектинов
бобовых растений умеренного климата; 2. Анализ нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных
последовательностей секвенированных фрагментов генов лектинов,
включающих углеводсвязывающий участок исследуемых видов бобовых
растений, 3 Исследование взаимосвязи между строением углеводсвязывающего участка
лектинов, их специфичностью к простым сахарам и таксономическим
составом ризобий, вступающих в симбиоз с бобовым растением, несущим
данный белок,
Конструирование гибридных лектинов с измененной специфичностью к углеводам на основе полноразмерного гена лектина гороха, путем замещения углеводсвязывающего участка этого белка гомологичными участками генов лектинов других бобовых растений,
Подбор условий для экспрессии гибридных генов лектинов в клетках Е coh, синтез и выделение функционально активных белков;
Исследование углеводсвязывающих свойств гибридных лектинов,
Исследование филогении и генетического разнообразия клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз со взятыми в исследование видами бобовых растений,
Разработка методов идентификации и паспортизации штаммов клубеньковых бактерий,
9. Оценка влияния природных и гибридных лектинов на становление симбиоза бобовых растений с различными ризобиями
Научная новизна. Клонированы и секвенированы участки генов лектинов, кодирующие углеводсвязывающие последовательности (УСП) данного белка у 22 видов бобовых растений, относящихся к 17 родам На основании сравнительного анализа секвенированных нуклеотидных и выведенных из них аминокислотных последовательностей лектинов построены древа сходства данных белков Выведена консенсусная последовательность Asp-Tre-Phe-Xxx-Asx-Xxx-Xxx-Trp-Asp-Pro-Xxx-Xxx-/n5'/)e/-Arg-His УСП лектинов бобовых растений умеренного климата У представителей рода Caragana обнаружено три класса различных генов лектина, причем внутри каждого из классов выявлен ряд генов, кодирующих более близкие лектины Существенно отличающиеся друг от друга гены лектинов секвенированы и у солодки голой. Показано, что гены одного класса лектинов разных растений могут быть филогенетически ближе, чем гены лектина разных классов у одного и того же вида растений. У клеверов Tnfohum repens, Т pratense и Т tnchocephalum, входящих в одну группу перекрестной инокуляции, секвенированы фрагменты генов лектинов, имеющие разные по аминокислотной последовательности УСП
Показано, что УСП лектинов, специфичных к одному и тому же моносахариду, могут существенно отличаться по последовательности и составу включенных в процесс связывания сахара аминокислот Обнаружено, что растения, вступающие в симбиоз с одними и теми же ризобиями, содержат
6 лектины со схожим строением УСП и сходной специфичностью к простым сахаридам. В УСП лектинов растений, входящих в одну группу инокуляции, показано наличие консервативных аминокислот, характерных только для данной группы лектинов бобовых
Установлено, что лектины близких видов растений козлятников восточного и лекарственного, вступающих, тем не менее, в симбиоз с разными биоварами клубеньковых бактерий Rhizobium galegae (bv onentahs и bv officinalis, соответственно), значительно различаются при высокой гомологии Nod-факторов их ризобий Данный факт можно рассматривать как свидетельство в пользу независимого влияния этих двух факторов специфичности на формирование бобово-ризобиального симбиоза Показана генетическая удаленность штаммов R. galegae, нодулирующих козлятник восточный, от штаммов, вступающих в симбиоз с козлятником лекарственным
С помощью специально разработанной оригинальной методики сайт-направленного мутагенеза созданы уникальные химерные конструкции, кодирующие полноразмерный лектин гороха Pisum sativum (PSL) с углеводсвязывающим участком, замещенным на таковые лектинов растений клевера лугового Tnfohum pratense (psl/tpl), эспарцета песчаного Onobrychis arenana (psl/oal), донника белого Melilotus albus (psl/mal) и астрагала солодколистого Astragalus glycyphyllos (psl/agl). Показано, что синтезируемые в клетках Е coh гибридные лектины способны связывать сахариды и вызывать агглютинацию эритроцитов, что указывает на корректность их пространственной укладки и ассоциации субъединиц Замещение УСП лектина гороха на УСП лектинов М albus и A glycyphyllos привело к изменению специфичности к моно- и дисахаридам, что свидетельствует о формировании углеводсвязывающим пептидом лектинов аффинности к простым сахаридам Анализ углеводсвязывающих свойств гибридов показал, что специфичный к Man/Glc лектин PSL с участком лектина М albus приобрел слабую аффинность к Gal/GalNAc, а при замещении на таковой A glycyphyllos - к Gal, заметно ослабив аффинность к Man Таким образом, у гибридного белка PSL/AGL обнаружена совмещенная специфичность к Gal и Glc, что нехарактерно для лектинов бобовых растений
Впервые в клубеньках астрагала нутового Astragalus cicer обнаружены бактерии, филогенетически близкие по последовательностям генов 16S рРНК к Agrobactenum tumefaciens strain LAM 14 (GenBank Ac No D13294), а в
клубеньках эспарцета песчаного - к Phyllobactenum tnfohi (GenBank Ac. No. AY786080).
Впервые показано, что лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, вызывающие специфические реакции симбиоза При обработке гибридным лектином PSL/AGL бактерий из клубеньков Astragalus cicer (филогенетически близких по генам 16S рРНК к Agrobactenum tumefaciens) в ризосфере люцерны, впервые наблюдали нетипичные симбиотические отношения с образованием инфицированных клубеньков Это свидетельствует о том, что лектин относится к критическим факторам в данной симбиотической системе
Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о строении молекул лектинов бобовых растений и демонстрируют неоднородность их углеводсвязывающих пептидов, а также способствуют более полному пониманию формирования специфичности данных белков к углеводам и принципов образования групп перекрестной инокуляции бобовых растений. Разработан и запатентован метод цифровой паспортизации микроорганизмов и создания по ним электронных баз данных. Исследована конкурентоспособность используемых в изготовлении промышленных препаратов ризоторфина штаммов ризобий козлятника восточного в почвенно-климатических условиях Башкортостана
Полученные новые сведения о закономерностях формирования углеводной специфичности лектинов, обусловленной их структурными особенностями, могут быть использованы в моделировании белков с заданными углеводсвязывающими свойствами. Разработанная нами стратегия изменения углевосвязывающих свойств лектинов позволяет моделировать лектины с разнообразной специфичностью, что может найти применение в различных областях биотехнологии Гибридные лектины, полученные нами путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны вызывать симбиотические реакции у бобовых растений. Более того, они расширяют (например, PSL/AGL) специфичность растений к ризобиям, возможно за счет расширения у гибридов специфичности к углеводам. Исследования роли лектинов в бобово-ризобиальном симбиозе, благодаря созданию и использованию в них гибридных лектинов из разных растений с разными углеводсвязывающими свойствами, могут значительно упроститься и стать гораздо информативнее. Кроме того, гены таких гибридных лектинов как
g PSL/AGL, можно интродуцировать в бобовые растения с целью увеличения группы клубеньковых бактерий, из которых растения в данных почвенно-климатических условиях могут выбрать наилучшего партнера для симбиоза, что, в конечном счете, может привести к более высокому уровню азотфиксации и, соответственно, к росту биологической урожайности сельскохозяйственных культур. Основные положения, выносимые на защиту.
Углеводсвязывающие последовательности лектинов бобовых растений умеренного климата имеют консенсусную последовательность Asp-Tre-Phe-Xxx-Asx-Xxx-Xxx-Trp-Asp-Pro-Xxx-Xxx-/ns/Z?e/-Arg-His.
Бобовые растения, вступающие в симбиоз с одними и теми же ризобиями, характеризуются близким строением углеводсвязывающих участков лектинов со сходной специфичностью к простым сахаридам
З В углеводсвязывающих последовательностях лектинов растений, инокулирующихся одними и теми же ризобиями, имеются консервативные, характерные только для данной группы лектинов, аминокислоты
Заменяя функционально значимые аминокислоты или области углеводсвязывающих участков, можно создавать лектины с измененной специфичностью к сахаридам
Лектины бобовых растений, синтезированные в бактериях, сохраняют свойства, обеспечивающие специфические реакции симбиоза
6 Гибридные лектины, полученные путем модификации их углеводсвязывающих сайтов, способны расширять круг перекрестной инокуляции бобовых растений Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ (№ 04-04-48884), РФФИ-Агидель (№ 02-04-97903) и грантами Программы поддержки ведущих научных школ РФ (96-15-98061, 00-15-97810, НШ-2217.2003 4; НШ-1003 2006 4)
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на X Международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на 3-м ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), на Научной конференции студентов и молодых ученых биологического факультета БашГУ (Уфа, 1997), на Конференции, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997), на XI Международном конгрессе Федерации европейского научного общества по
физиологии растений (Варна, Болгария, 1998), на 18-ой международной конференции "Interlecl8" (Портсмут, Великобритания, 1999), на конференции молодых ученых «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), на 6-ой конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002), на Ш съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 5-ой Европейской конференции по фиксации азота (Норвич, Великобритания, 2002), на XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), на международной конференции «Наука и бизнес Поиск и использование новых биомолекул биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), на международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), на Ш Республиканской научно-практической конференции молодых ученых «Научное и экологическое обеспечение современных технологий» (Уфа, 2006); на международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им Н И Вавилова РАН (Москва, 2006), на Ш Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006), на IV съезде Общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Пущино, 2006), на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения СИ Алиханяна (Москва, 2006)
Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 35 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах, содержит 45 рисунков и 10 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 419 работ.
