Введение к работе
Актуальность проблемы. На молекулярном уровне, мышечное сокращение является результатом циклического взаимодействия между "поперечным мостиком" (миозиновой голсвкоп), отходящим от толстой нити, и тонкой нитыо, состоящей, главным образом, из актина, что приводит к скольжению миозиновых и актнновых нитей друг относительно друга (Huxley, 1969). Энергия для работы одиночного "поетика" в течения цикла его прикрепления к Ф-актину, генерации силы и отсоединения черпается из химической энергии, высвобождаемой при гидроаизе АТФ (Lymn, Taylor, 1971), при этом происходит чередование отличных по аффинности форм связывания (основными является "сильная" и "слабая") миозиновой головки с Ф-акгином (Eisenberg, Hill, 1985). В скелетных мышцах позвоночных регуляцию актин-киози-нового взаимодействия осуществляет тропонин-тропомиозиновый комплекс тонких нитей (Ebashi, 1974). Считается, что насыщение Са2+ -связыЕачзщих центров тропонина С приводит к каскаду конформационных изменений как н тропонине С, так и н осталь-ных белках-компонентах регуляторного комплекса: тропонине I, тропонине Т и трспомиозине, что снимает ннгчбпгорнсе влияние тропонина I (Zot, Potter, 1987). В гладкої'ьшєчі'нх клэт-ках также существует связанный с тонкими нитями механизм регуляции сокращения, включающий в севя ингибипонание» в отсутствие ионов Са2+ актин-миозкнопого взаимодействии '.емплексом кальдесмон-тропомиозин, причем кальлсенси 7>ппяечся, каг. предполагаем, аналогом комплекса тропонина Ї и тропонина I скелетных мышц '(Biryukov et al., 1SS0). }fec .злітай поиски Ca2t кальїіодулин снимает такое ингибкрулцее возлейстг.чо кальдесмона (Sobue et al., 1942).
К настоящему времени накоплено значительное количестно данных о том, что в мономерах Ф-ачтина в промессе сокращения и при его регуляции происходят кон'і)ормационіше изменения трехмерной упаковки полипепгид:>оп шин (Yan'Tjida, Роняла, 1978, 1980; Боровике.в и др. , 1S7G; Borovilcov. Gmeev, 1933). В соответствии с ре.чтгеноструктуршмн датами іябч " лр.
(Kabsch et al., 1980"», молекула актина состоит из 4 субдоменов. Вопрос о тол, отражает ли конформационные изменения ак-тяноеого мономера з областях локализации флуоресцентных зондов изменения во взаимном расположении субдоменов актиновои молекулы и являются ли такие изменения функционально важными, остается малоизученным.
Использование теневых мышечных волокон (лишенных миозина, тропоіпіозшга и трононина) для сборки в их составе различных комплексов сократительных белков (в т.ч. флуоресцентно-МЄЧЄЇЗ-JX ) или их протеолитических фрагментов, а, в перспективе , белков, подвергнутых сайт-направленному мутагенезу, открывает новые возможности дня исследования процесса генерации силы на молекулярном уровне.
Цель и задачи исследования, і) изучение конформационных изменении в различных областях мономера Ф-актина, вызываемых "слабой" и "сильной" формами связывания головки миозиновоя молекулы, при моделировании различных стадий цикла гидролиза АТФ; 2) исследование влияния скелетної ьшечного и гладкомы-шечного регуляторних белков тропонина I и кальдеснона на характер изменений конформзции Ф-актина, индуцируемых "сильной" формой связывания миозиновои головки; Л) выявление областей ииозиновой головки, ответственных за образование "слабой" и "сильной" форм ее связывания с Ф-актнном; А) Использование теневых мыыечных волокон для сборки в их составе различных комплексов сократительных белков или их протеолитических Фрагментов для исследования двигательного аппарата мьшечных и немышечных клеток.
Научная новизна и практическая значимость работы. С
ционной микрофлуориметрии впервые получено подтверждение предположения о том, что области головки миозиновои молекулы, ответственные за образование "слабой" и "сильной" форм ее связывания с Ф-актином, расположены, соответственно, в протеолитических Н-концевом фрагменте с Мг 75 кДа и С-конце-вом фрагменте с Мг 20 кДа головки. Показано, что присоедине-
ниє этих фрагментов к актиновой нити вызывает в ее мономерах различные конформационные изменения, вмрачгяоїцнеся в разнонаправленном изменении орненташш, относительно ОСИ ТОНКО!'! нити-, диполей излучения и степени подвижности флуорофороя зондов, расположенных в различных областях <субдокенах) мономера Ф-актина.' Высказывается предположений о той, что такие конформационные изменяя отражают изменения во взаимной ориентации различных областей актиновых мономеров.
Обнаружено, что наличие реконструированных в телег ом мышечном волокне регуляторных белков тропонича I и кальдес-мона уменьшает размах конаюриационных изменении в различных областях мономеров Ф-актина при "сильной'' форме связывания миозиновой головки. Высказано предположение о той, что регуляторная функция этих белков выражается в ингибированин изменении ориентации различных областей актиновсго мономера при такой форме связывания головки миознновои молекули.
Выявлено сходство в характере конфоркзпиенкых изменений
В С-КОНЦеВЫХ ОбЯаСТЯХ MOHOKepGB КИТеЯ ІІЬИіеЧНОГО И КЄ)П:ї!ОЧНО-
го актина, собранных в теневом мышечном голокне, прс-ноходя-ших при "сильной" форме связывания ииозшювоп гопсзкн.
моЛЬНЄгшіее рйЗЕНТПе ПОЯ'/ЧНЛН М^ТО"'"чИ С^СрКИ D Tiri'^'iiL-H
мышечном волокне кролика белков-компонентов ( или их протео-литических Фрагментов), в т.ч. модифицированных Ф.чуор^акнт-ными зондами, сократительного аппарата скелетноншечіа-гх,
ГЛЭДКОНЫШеЧИЫХ И НеМЫШеЧКЫХ КЛеТОК. ИсГЮЛЬЗОВДННе !";-.01 о
подхода открьпзает новые возможности для гияетаткл нехлнчз.'п функционирования актомкозикозого двигателыю: о апгмратл пг-мышечной клетки на молекулярном уровне.
Апробация работы. Результаты работы были допохекч на
VIII ВсЄССІОЗНОН СККПОЗИуМе "БиОфИЗИКа И GliOXJWra 6ИОЛОП5ЧЄО-
кои подвижности" (Пущино, 1987), Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, ІРЗЗ), ХУІІІ-XX Европейских конференциях по мышечному сокращен; и клеточной подвижности (1G89, Люнтерен, Голландия; 1930, Брюссель, Бельгия; 1991, Оксфорд, Англия), VI Конференции Мито-
скелетного Клуба (Фугясосентрет, Дания, 1990).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит ... страницы машинописного текста, .. таблиц и .. рисунков. Список литературы включает ... источников.
