Введение к работе
Актуальность темы. Проблема гуморальной регуляции функционирования различных клеток и тканей остается одной из самых значимых и недостаточно исследованных в биологии и медицине. Актуальность исследования возможностей гуморального контроля различных свойств клеток обусловлена в первую очередь запросами клиники, где врачам приходится сталкиваться с последствиями разнообразных нарушений такой регуляции (Galli S.J., 2000; Matsumoto T., 2011; Zulewski H., 2011). Зачастую эти нарушения связаны не только (и не столько) с наличием или отстутствием самого регуляторного фактора, как с возможной потерей чувствительности клеток к нему (Михайлов В.В., Сагалович Б.М., 2011, Tahrani A.A. et al., 2011), и поэтому изучение рецепторного аппарата клетки в решении этой проблемы имеет первостепенное значение. В связи с этим несомненный интерес представляет изучение наличия Р2-рецепторов (рецепторов к АТФ) на разных клетках, в том числе на стволовых клетках.
Несмотря на то, что функциональные свойства любой клетки наряду с работой гена определяются во многом и ее рецепторным аппаратом, изменения качественного состава рецепторов в процессе онтогенеза для большинства клеточных типов практически не исследованы (Droin N. et al., 2011; Ye Z.J. et al. 2011, Alea M.P. et al., 2011). В рамках этой проблемы несомненный интерес представляет рецепторый аппарат стволовых клеток, способных к дифференцировке в различные клеточные типы (Mimeault M. et al., 2007). Одними из таких рецепторов могут быть Р2-рецепторы, основным естественным лигандом которых является АТФ. В литературе имеются убедительные свидетельства наличия Р2-рецепторов во всех органах и тканях человека (Burnstock G., 2006), наличие Р2-рецепторов также установлено в отдельных форменных элементах крови и их предшественниках (Sak K. et al, 2003). Вместе с тем, не исследовано то, как изменяются функциональные свойства клеток с появлением или исчезновением этих рецепторов. Не известно, когда они начинают экспрессироваться и характерны ли они для всех форменных элементов крови и их предшественников (Sak K. et al., 2003). Кроме того, отсутствуют исследования, посвященные взаимосвязи наличия подтипов Р2-рецепторов в стволовых клетках с активностью экто-нуклеотидаз – внеклеточных ферментов, участвующих в распаде нуклеотидов (Зиганшин A. У., Зиганшина Л.Е., 2009).
В настоящее время бурно развивающейся областью медицины и биологии являются попытки использования различных стволовых клеток для лечения и профилактики разнообразных заболеваний (De Santis M. et al., 2011; Gotts J.E., Matthay M.A., 2011; Lai R.C. et al., 2011). При этом, выявление столовых клеток является отдельной трудоемкой задачей; в настоящее время в основе их идентификации лежит, в первую очередь, наличие определенных поверхностных маркеров. В крови имеются клетки предшественницы гемопоэза, маркерами которых является мембранный фосфогликопротеин — CD34, а также трансмембранный рецептор белка тирозинкиназы с-kit, также известный, как рецептор фактора роста стволовых клеток. Вместе с тем, совершенно не исследованно распределение различных подтипов Р2-рецепторов в СD34 и/или с-kit-позитивных клетках, хотя имеются основания считать, что Р2-рецепторы могут присутствовать на этих ранних стадия развития гемопоэтических клеток, и быть вовлечены в процессы дифференцировки и созревания клеток (Burnstock G., 2006). Очевидно, что любые знания о регуляторном потенциале стволовых клеток безусловно окажутся востребованными, как для возможного решения конкретных клинических ситуаций, так и для интересов фундаментальной биологии и медицины.
Целью исследования – изучить наличие различных подтипов Р2-рецепторов в гемопоэтических стволовых клетках и мононуклеарах крови человека, а так же активность эктонуклеотидаз в этих клетках.
Задачи исследования:
1. Изучить наличие подтипов Р2Х- и Р2Y-рецепторов на CD34+клетках и с-kit+клетках крови человека.
2. Исследовать наличие подтипов Р2Х- и Р2Y-рецепторов на лимфоцитах и моноцитах человека.
3. Провести сравнительный анализ наличия различных подтипов Р2-рецепторов на лимфоцитах, моноцитах и клетках-предшественниках гемопоэза пуповинной и периферической крови человека.
4. Определить активность экто-нуклеотидаз в мононуклеарных клетках крови человека и клетках-предшественниках гемопоэза.
Объект исследования – гемопоэтические клетки-предшественники человека, полученные из пуповинной крови и периферической крови доноров; лимфоциты и моноциты пуповинной крови и периферической крови доноров.
Научная новизна
Впервые методом проточной цитометрии установленo наличие всех изученных подтипов Р2-рецепторов на СD34+-клетках и с-kit+-клетках пуповинной крови человека, моноцитах и лимфоцитах пуповинной и периферической крови человека. Приоритетными являются данные, свидетельствующие о том, что активность экто-нуклеотидаз CD34+-клеток пуповинной крови в 1000 раз ниже, чем это значение в популяции мононуклеаров пуповинной крови, и сравнима с активностью этого фермента в популяции мононуклеаров периферической крови. Безусловной новизной обладают результаты исследования, в которых установлено, что в лимфоциты пуповинной и периферической крови не имеют достоверных различий по содержанию в них различных подтипов Р2Y-рецепторов.
Новыми являются количественные сведения о распределении подтипов Р2-рецепторов в различных клеточных популяциях и о связи экспреcсии этих рецепторов с наличием или отсутствием маркеров СD34 и c-kit.
Научно-практическая значимость
Результаты проведенных исследований могут быть востребованы для разработки методов клеточной терапии с иcпользованием гемопоэтических стволовых клеток. Полученные данные существенно приближают нас к пониманию механизмов дифференцировки гемпоэтических стволовых клеток и возможной роли рецепторного аппарата, участвующего в этих процессах. Результаты, описанные в диссертации, могут быть использованы в практике лабораторий, занимающихся проблемами клеточной терапии. Они могут послужить основой для изучения рецепторного аппарата разнообразных стволовых клеток.
Материалы диссертации включены в учебный процесс на кафедре фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники и кафедре гистологии Казанского государственного медицинского университета.
Положения, выносимые на защиту:
-
Лимфоциты, моноциты, СD34+-клетки пуповинной и периферической крови человека экспрессируют на своей поверхности Р2Х2-7 и Р2Y1-, Р2Y4-, Р2Y6-рецепторы.
-
Содержание клеток, экспрессирующих Р2Х-рецепторы, увеличивается в процессе созревания гемопоэтических клеток – наименьший процент таких клеток наблюдается в популяции CD34+/сkit-клеток, а наибольший обнаруживается на лимфоцитах пуповинной крови человека.
-
В лимфоцитах пуповинной крови человека активность эктонуклеотидаз выше на 3 порядка по сравнению с таковой в гемопоэтических CD34+клетках.
Апробация результатов исследования. Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на Российской конференции «Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ», посвященной 75-летию профессора И.А. Студенцовой (Казань, 2008), на Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009, 2011), на Всероссийских студенческих научных конференциях КГМУ (Казань, 2010, 2011), на международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), 16-м Всемирном съезде фармакологов (Копенгаген, Дания, 2010).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 197 источников, из которых 10 отечественных. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 рисунками, 14 таблицами.
