Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Организация кроветворной системы амфибий 8
1.1. Морфология элементов крови 8
1.2. Кроветворные органы 13
1.2.1. Локализация кроветворной ткани амфибий 13
1.2.2. Микроанатомическая структура основных кроветворных органов амфибий 15
1.2.3. Созревание клеток в циркулирующей крови 19
1.3. Дифференцировка клеток крови 19
1.3.1. Клетки-предшественники 19
1.3.2. Эритроидный ряд 20
1.3.3. Миелоидный ряд 26
1.3.4. Тромбоцитарный ряд 29
2. Кинетика обновления тканей амфибий 31
2.1. Методические вопросы исследования кинетики . 31
2.2. Факторы,влияющие на кинетику репродукции клеток амфибий 32
2.3. Сезонные изменения пролиферативной активности тканей амфибий 33
3. Сезонная динамика кроветворения 33
3.1. Особенности экологии и физиологии амфибий умеренного пояса в связи со сменой времен года 33
3.2. Сезонные изменения состава крови амфибий 36
3.3. Сезонные изменения интенсивности разрушения клеток крови 38
3.4. Сезонные изменения морфологии и функции кроветворных органов 41
Материалы и методика 43
1. Животные и их содержание 43
2. Взятие материала и изготовление препаратов 44
3. Авторадиография 45
4. Схемы опытов 45
Результаты 50
1. Морфология 50
1.1. Морфология селезенки травяной лягушки 50
1.2. Морфология отдельных клеток крови травяной лягушки и стадий их созревания 52
1.2.1. Гемоцитобласты 52
1.2.2. Эритроидный ряд 53
1.2.3. Тромбоцитарный ряд .' 54
1.2.4. Нейтрофильный ряд 56
1.2.5. Макрофаги 57
2. Кинетика кроветворения 59
2.1. Авторадиографический анализ интенсивности репродукции и дифференцировки кроветворных клеток в селезенке в зависимости от сезона и температуры 60
2.1.1. Зимой при низкой температуре (опыт 1,а) . 61
2.1.2. Зимой при температуре +18-20С (опыт 1,6,1) . 61
2.1.3. В конце зимовки (опыты 1,в и 1,г) 63
2.1.4. Кроветворение в летний период (опыт 1,д) . 65
2.1.5. Кроветворение в конце лета и осенью 66
2.2. Определение средней длительности митотического цикла гемоцитобластов при 18-20С 70
2.3. Длительность жизни элементов крови и ее сезонные изменения 72
2.3.1..Нейтрофилы 72
2.3.2. Тромбоциты 75
2.3.3. Макрофаги 77
2.4. Анализ сезонных изменений плотности и состава популяции макрофагов 77
2.5. Кровеносное русло как очаг кроветворения 84
2.5.1. Эритропоэз 84
2.5.1.1. Кинетика нормального эритропоэза 84
2.5.1.2. Кинетика эритропоэза при экспериментальной гемолитической анемии 91
2.5.2. Нейтрофильный миелопоэз и тромбоцитопоэз 94
Обсуждение 97
1. Сравнение стратегий поддержания численности клеточных популяций во время зимовки у амфибий и зимнеспящих мле копитающих 98
1.1. Обновление клеток у зимнеспящих млекопитающих . 98
1.2. Обновление клеток у амфибий 100
1.2.1. Нейтрофилы и тромбоциты 103
1.2.2. Эритроциты 105
2. Особенности сезонной динамики популяции макрофагов селезенки 111
Заключение 116
Выводы 120
Литература 124
- Микроанатомическая структура основных кроветворных органов амфибий
- Особенности экологии и физиологии амфибий умеренного пояса в связи со сменой времен года
- Определение средней длительности митотического цикла гемоцитобластов при 18-20С
- Особенности сезонной динамики популяции макрофагов селезенки
Введение к работе
Тема настоящей работы объединяет в себе две в равной степени актуальные и обширные проблемы,которые исследуются сейчас весьма интенсивно. Первая из них - закономерности кинетики и регуляции размножения и дифференцировки клеток в обновляющихся тканях. Кроветворная ткань является одной из таких тканей,причем очень удобной для экспериментального изучения, что и обусловило ее выбор в качестве модельного объекта во многих исследованиях по данной проблеме. Вторая проблема - механизмы адаптации организмов к сезонным изменениям среды. Объединяя эти проблемы в одной работе, мы преследовали задачу изучить последствия сезонной цикличности жизнедеятельности амфибий для кинетики обновления их клеточных популяций.
Выбор амфибий в качестве объекта исследования обусловлен важностью и перспективностью сравнительного подхода как к проблемам кинетики клеточных популяций, так и к проблеме сезонной адаптации на тканевом уровне. Этот подход позволяет выявить разнообразие решений каждой функциональной задачи,стоящей перед организмами,а также отделить общие и необходимые черты этих решений от частных,видоспецифичных.Для исследования кинетики обновления тканей сравнительный подход в настоящее время используется совершенно недостаточно.В то же время на кафедре цитологии ЛГУ в течение целого ряда лет ведется сравнительное изучение клеток крови и полостной жидкости,а также кроветворных органов и процессов кроветворения у животных из самых разных систематических групп.При этом одинаково пристальное внимание уделяется как функциям зрелых клеток (В частности,их роли в защитных реакциях ),так и изучению кинетики их обновления с помощью метода тимидиновой авторадиографии. Выбор широкого круга
объектов (среди них должны быть как близкородственные,так и филогенетически отдаленные животные ) помогает оценить степень эволюционной пластичности данной ткани и ее потенциальные возможности. Для достижения той же цели клетки крови,их кинетика и функции исследуются не только в нормальном равновесном состоянии, но и в различных экспериментальных ситуациях: при воспалении, коагуляции, регенерации тканей и т.д. Многие свойства клеток,. позволяющие открывать функциональные аналогии и проводить плодотворное сравнение тканевой организации у филогенетически различных животных, обнаруживаются только в этих неравновесных ситуациях.
Настоящая работа выполнена в рамках вышеизложенного направления и с применением типичных для него методов,главным образом тимидиновой авторадиграфии.С помощью этого метода удалось впервые измерить некоторые параметры кинетики кроветворения травяной лягушки: среднюю длительность митотических циклов,малодиф-ференцированных клеток,скорость созревания эритроцитов,длительность жизни нейтрофилов и (более приблизительно )тромбоцитов. Что же касается создания экстремальных условий и выведения кроветворной системы из равновесного состояния,то здесь богатейшие возможности предоставляет сам объект.Циклический,сезонный характер кроветворения у лягушки делает этот процесс неравновесным по своей природе,в нормальных условиях.Поэтому даже без экспериментальных воздействий,путем сезонных наблюдений,удалось получить ряд важных фактов: изменение длительности жизни и скорости обновления клеток крови в течение года,уникальный (или просто не изученный среди позвоночных? ) механизм обновления эритроцитов в циркулирующей крови в летнее время,годовой цикл эритропоэза и разрушения эритроцитов и связанный с ним цикл
7 развития многоядерных макрофагов,накапливающих продукты обмена железа.Обнаружилось также,что процессы подготовки к периоду зимнего оцепенения происходят в кроветворной ткани заблаговременно, начиная с августа.
Сочетание этих наблюдений и экспериментальных изменений температурного режима в разные сезоны позволило выявить некоторые закономерности в регуляции кроветворения.Так,оказалось,что скорость размножения и дифференцировки клеток резко зависит от температуры и уменьшается в несколько раз при температуре зимовки, хотя гемопоэз продолжается у зимующих лягушек.Длительность жизни зрелых клеток такой сильной температурной зависимости не, обнаруживает и обусловлена,видимо,более постоянными факторами сезонного ритма,так как изменяется соответственно времени года. Количество покоящихся клеток в кроветворной ткани зависит как от температуры,так и от сезона.
Наконец,применение более острых экспериментальных воздействий (фенилгидразиновая анемия) позволило подробно охарактеризовать кинетику эритропоэза при репарации,сравнить ее с кинетикой нормального эритропоэза и показать их идентичность.Таким образом,оказалось,что нормальный сезонный цикл жизнедеятельности лягушки связан с такими экстремальными ситуациями, когда организму приходится использовать те же механизмы,что и при тяжелой патологии.
Полученные результаты открывают возможности,во-первых,для сравнительного анализа обновления клеток крови у неродственных животных,имеющих сходные физиологические адаптации (например, холоднокровные,впадающие в зимнее оцепенение,и зимнеспящие млекопитающие ).При этом обнаруживаются некоторые удивительные параллели, имеющие глубокое физиологическое обоснование ( самая
8 яркая из них - цикл эритропоэза лягушки и летучей мывшей не менее показательные различия. Во-вторых,знание сезонных особенностей кроветворения амфибий необходимо для дальнейшего углубленного изучения организации кроветворной ткани в этом классе позвоночных и механизмов ее регуляции.Это,с одной стороны, поможет избежать недоразумений при интерпретации данных,с другой - может подсказать удобные экспериментальные модели для дальнейшей работы.Возможно,такие модели окажутся полезны для изучения не только кроветворной ткани и в свою очередь послужат разработке проблемы механизмов сезонной адаптации.
Микроанатомическая структура основных кроветворных органов амфибий
В эритроидном ряду млекопитающих синтез РНК прекращается на .стадии позднего полихроматофильного эритробласта,а белка -на стадии ретикулоцита Козинец и др.,1982 \у птиц Корвин-Павловская и др.,1980 ) синтез гемоглобина наиболее интенсивен на ранних стадиях и прекращается на стадии ортохромного ретикулоцита. Таким образом,эритроциты амфибий дольше сохраняют синтетическую активность в процессе созревания.
Одновременно с синтезом РНК и белка в эритроидном рядуйро-исходит деление клеток.Митозы встречаются на всех стадиях созревания Oreidsohn,i9i6) с максимальной частотой в полихрома ТОфилЬНЫХ Эритробластах (Charlemagne,1972). В ряду МОрфоЛОГИ чески распознаваемых стадий созревания эритроцитов млекопитающих количество делений может варьировать от 3 до 7; в норме созревающий эритроцит проходит 5 делений (Козинец и др.,1982).Последний митоз у млекопитающих,так же как и у птиц (Корвин-Пав-ловская и др.,1983; Козинец и др.,1982).происходит на стадии позднего полихроматофильного эритробласта.Весь процесс созревания от стадии проэритробласта у человека занимает около 5 сут. У амфибий число митотических циклов в эритроидном ряду в ходе нормального эритропоэза не определено,так же как и последняя стадия,не утратившая способности к делению.По морфологическим
Наблюдениях Некоторых авторов (Dawson,1931} Br aimg art,19 5б), в крови амфибий митозы можно обнаружить даже в зрелых эритроцитах. У тритонов митозы встречаются до стадии ретикулоцитов включительно. (Grasso,Woodard,1967; Grasso,1973b). Синтез ДНК У X.laevis (Nesta,Maclean,197 ) И у ДВУХ ВИДОВ рода Triurus (Grasso,Woodard,1967; Grasso,1973b) наблюдается на ВСЄХ стадиях, кроме эритроцита. Целый ряд авторов исследовал дифференцировку эритроцитов не при нормальном эритропоэзе.а на модели экспериментальной острой анемии,вызванной инъекциями фенилгидразина (De witt et ai.,1972; Grasso,1973 a,b; Ohegini et al. ,1979; Casale et al.,1986). Это вещество разрушает зрелые эритроциты,после чего,как оказалось, амфибии могут жить несколько дней без признаков регенерации эритроидных клеток,осуществляя газообмен только за счет растворения газов в плазме.Компенсаторный эритропоэз начинается спустя 3-4 сут у личинок И 5-7 сут у взрослых амфибий (Grasso, 1973а; Nesta,Maclean,1974; De Witt et al.,1972) как В СЄ лезенке,так и в периферической крови,что дает прекрасную возможность ДЛЯ Изучения Этапов ДИфференцироВКИ.ГрасСО (Grasso, 1973а) на спленэктомированных тритонах, т.cristatus показал, что на 7-е или 8-е сутки опыта эритроидные клетки выходят в кровь на стадии более ранней,чем проэритробласты,и созревают к как две последовательные синхронные популяции.Длительность каждой морфологической стадии составляет 2-3 сут,превращение позднего полихроматофильного эритробласта в эритроцит происходит за 10 сут.Полное время созревания эритроцитов о?, cristatus Рав НО 20-25 СУТ.У X.laevis (Nesta,Maclean,1974) ЭТО значение несколько меньше и составляет 15 сут.Длительность созревания эритроцитов амфибий,таким образом,в несколько раз больше,чем у млекопитающих.Вероятно,это связано с большими размерами клеток и необходимостью накопления больших количеств гемоглобина. На модели фенилгидразиновой анемии удалось также приблизительно определить,что эритроидные клетки x.laevis при созревании от стадии базофильного эритробласта должны проходить 2-3 митоза (Cnegini et ai. ,1979). Методом меченых митозов была из 25 мерена длительность последнего митотического цикла в эритропо 93Є R.esculenta И ОТДЕЛЬНЫХ ЄГО фаз (Grosset,Odartchenko, 1975 ). Авторы не уточняют,каким морфологическим стадиям,по их мнению,соответствует последний митотический цикл.Полное время цикла составило 52,0 ч,длительность фазы s- 26,0 ч.Следует учитывать,что данные по кинетике эритропоэза в условиях острой анемии могут не отражать нормальной кинетики этого процесса. Известно,что у млекопитающих ( Козинец и др.,1982 ) и у птиц (Кульминская,Газарян,1976; Кульминская и др.,1978 ) существуют, помимо нормального,резервные механизмы эритропоэза.которые включаются при системных стрессах.Так,у птиц существуют 4 пути эритропоэза, различающиеся по длительности созревания,числу и локализации митозов и количеству продуцируемых клеток.Режим эритропоэза выбирается в зависимости от остроты анемии (Корвин-Пав-ловская и др.,1983 \Можно ожидать,что и у амфибий в норме эрит-ропоэз имеет иные параметры,чем при анемии.
Регуляция эритропоэза амфибий,как и других холоднокровных животных,коренным образом отличается от регуляции эритропоэза у млекопитающих.Как известно,главным эритропоэтическим стимулом для млекопитающих является недостаток кислорода,который вызывает усиление выработки в почках гормона эритропоэтина (Чертков,Фриденштеин, 1977 ).Поэтому гипоксия,гемолиз или кровотечение вызывают однотипный и очень быстрый ответ: интенсификацию эритропоэза.У амфибий (Rosse et al.,1963) tTSK ЖЄ Как у рыб (McLeod et al.,1978) И у черепах (Altland,Parker,1953; Altland,Thompson, i958;Meints et Гэритропоэтическии ответ можно вызвать с помощью кровотечения или гемолитической анемии,но не гипоксии,даже если она сублетальна.Б плазме анемичных лягушек R.pipiens присутствует фактор,который стимулирует эритропоэз при инъекции нормальным лягушкам (Rosse et аі.,1963). от Фактор не влияет на эритропоэз млекопитающих,так же как эритропоэтин млекопитающих не оказывает действия на лягушек.Таким образом, стимулятор эритропоэза амфибий сильно отличается от эритропоэ-тина млекопитающих и вырабатывается не под действием гипоксии. Возможно,что он не гомологичен эритропоэтину.
Особенности экологии и физиологии амфибий умеренного пояса в связи со сменой времен года
Данные по измерению длительности митотических циклов и отдельных их фаз в клетках амфибий немногочисленны и приведены в табл.Г.Как видно из сравнения этих данных,длительность и структура циклов могут быть весьма разнообразны в зависимости от типа ткани,вида и состояния животного.
Большинство исследований по кинетике репродукции клеток амфибий проводятся при температуре +18-23С.При сравнении данных разных авторов различие температуры может существенно влиять на результаты,так как на ряде тканей эмбрионов и личинок амфибий показано (chibon,i973) что от температуры зависит как длительность, так и структура митотических циклов.Так например,при снижении температуры до +І2С в клетках тритона не только значительно увеличивается длина цикла,но и исчезает G1 -фаза.Действие температуры на длительность митотических циклов у взрослых амфибий не изучалось,однако показано ее влияние на количество пролиферирующих клеток: у лягушек R.pipiens, содержащихся в течение 2 недель при +4С,митозы в эпителии роговицы и хрусталика исчезают,при перенесении в тепло они вновь появляются в роговице уже через I СУТ,В Хрусталике - Через 9 Сут (Rothstein et al.,1975).
Важным фактором,влияющим на кинетику репродукции клеток амфибий,может оказаться возраст животных.Так,показано увеличение длины всех фаз митотического цикла в тканях личинок жабы и тритона по сравнению с тканями поздних эмбрионов(chibon,1973). Данные по сравнению кинетики обновления тканей личинок и взрослых амфибий в литературе отсутствуют.
Влияние сезонных факторов на интенсивность пролиферации тканей амфибий изучалась в основном на примере эпителиальных тканей.У R.pipiens в эпителии хрусталика с октября по апрель (при температуре воды +4 - +9С) совершенно отсутствуют митозы. Резкое усиление митотическои активности наблюдается в апреле -июне.В роговице зимой встречаются отдельные митозы,и весенний пик митотическои активности менее выражен.Остальные исследованные ткани (эпителий почки,кожи,языка) имеют сходную динамику пролиферативной активности (rothstein et _al.,1975).
Как уже указывалось,температура имеет большое влияние на скорость и интенсивность клеточной пролиферации у амфибий.С другой стороны,пролиферативная активность тканей лягушки,взятых в разные сезоны,имеет также различия,не зависящие от температуры.Так,в ХОДЄ регенерации Хрусталика yR.temporaria ЗИМОЙ первые митозы появляются через 8 сут после его удаления,а летом, при тех же условиях содержания - через 2 сут Сахарова,Го-личенков,1968 ХГипофизарные инъекции и гипофизэктомия не нивелируют эти различия. У R.pipiens гипофиз эктомия в летнее время
Прекращает митозы В Хрусталике,НО НЄ В роговице (Rothstein et al,.1975). Активность большинства пойкилотермных позвоночных средних широт,и среди них амфибий,подчинена сезонному ритму изменений условий среды.Приспособлением,позволяющим амфибиям обитать в местах с довольно суровым климатом,является зимнее оцепенение. Благодаря этому их годовой цикл делится на две очень контрастные части: активную,включающую в себя размножение,питание и подготовку к зиме,и неактивную,когда,как показано электрофизиологическими методами (Карманова и др.,1984),животные находятся в состоянии,близком к одной из трех форм сна амфибий. Более подробную классификацию фаз годового цикла для к. temporaria дал Пасанен (1980) на примере популяции из Финляндии (Енсуу),0н выделяет следующие фазы: І.Уход в места зимовки (сентябрь - октябрь). 2.Зимовка (до апреля у половозрелых и до мая у неполовозрелых особей). 3.Период перед выходом,когда лягушки мигрируют из зимовочных ям по дну водоема и могут активно плавать (апрель у половозрелых и май у неполовозрелых). 4.Выход на сушу (соответственно начало мая и середина мая) . 5.Нерест (первая половина мая). 6.Кормежка. У лягушек Ленинградской области сроки начала отдельных фаз ненамного отличаются от приведенных выше.Так,по данным за 35 лет,среднее время выхода травяных лягушек на сушу - І8/ІУ (от 2/ІУ до 2/У),время начала размножения - 29/1У.Уход на зимовку происходит от 4/ГК до 26/ІХ (Терентьев,1950). Травяные лягушки зимуют большими скоплениями на дне непро-мерзающих водоемов с чистой водой (рек,озер,колодцев) (Быхов- ский,Фурсенко,І929; Терентьев,І950 ).Во время зимовки и икрометания они,как правило,не питаются,хотя и в эти периоды встречаются особи с пищей в желудке красавцев, 1935; Savage,1961; Kabisch,Engeimann,i97i). Следовательно,за короткий летний период они должны запасти такое количество питательных веществ, которое позволило бы им обходиться без пищи 7-8 месяцев.Показано, что к октябрю - ноябрю у лягушек происходит максимальное накопление гликогена в печени и жира в жировых телах (Ушаков и др.,1979; Schiaghecke,i978) ,причем у животных более северных широт концентрация гликогена больше (Пасанен, 1980 ).Первая половина зимовки проходит за счет расходования запасов жира, которые к марту - апрелю почти совсем истощаются.Гликоген используется в последние месяцы зимовки и в брачный период (Ушаков и др. ,1978 ). Как оказалось,все описанные изменения метаболизма лягушек не следуют прямо за изменениями условий внешней среды,а обнаруживают более или менее устойчивый ритм,который сохраняется некоторое время и при постоянных условиях.При содержании лягушек в лаборатории при постоянной температуре и освещенности наблюдается значительное увеличение концентрации гликогена в печени в начале зимы и уменьшение в конце.Накопление гликогена осенью происходит даже у животных,нє получающих пищи (Koskela, Pasanen,1975).
Определение средней длительности митотического цикла гемоцитобластов при 18-20С
Селезенка R.temporaria представляет собой округлый или эллипсоидный орган,диаметр которого по длинной оси равен 1,7-4,3 мм.Орган прилежит к тонкой кишке,связан с ней складкой мезентерия и покрыт соединительнотканной капсулой.В ткани,заполняющей его,можно выделить красную и белую пульпу ( рис.4).
Красная пульпа состоит из пульпарных тяжей и пространств венозных синусоидов,заполненных свободными элементами крови (рис.5, 6) .Со стороны пульпы хорошо различимы адвентициальные клетки (фибробласты Степень наполненности синусоидов кровью может сильно варьировать у разных животных,однако не обнаруживает никаких закономерных сезонных изменений.
Фибробластическая строма (рис.7 )составляет основу пульпарных тяжей.Между оседлыми стромальными клетками находятся те же свободные клетки,что и в синусоидах.Это зрелые депонированные элементы крови (рис.29),гемоцитобласты (рис.8,а,б).молодые стадии всех рядов гемопоэза,в том числе экстраваскулярно расположенные клетки эритроидного ряда (рис.8,в,г).
Морфология кроветворной ткани и,в частности,красной пульпы селезенки претерпевает некоторые изменения в течение года.У зимующих животных диаметр селезенки обычно заметно меньше,чем у активных.В красной пульпе относительно мало свободных элементов, так что хорошо видны стромальные клетки пульпарных тяжей.
В основном эти свободные элементы представлены гемоцитобластами и зрелыми клетками.Редко встречаются также незрелые дифференцирующиеся клетки различных рядов.Общими признаками этих незрелых клеток являются базофилия цитоплазмы,крупные размеры ядра,деспирализованный хроматин и хорошо выраженное ядрышко(рис.8,г),что характерно для клеток с интенсивными метаболическими процессами.Митозы наблюдаются в кроветворной ткани зимующих животных,но в гораздо меньшем количестве,чем у активных. Для количественной характеристики интенсивности размножения клеток в ткани селезенки была подсчитана плотность митозов (число митозов на I мм селезенки) у лягушек,содержавшихся при температуре наружной среды и при 18-20 в марте - апреле, в конце зимовки ( на материале опытов І,в; 1,г,1 и І,г,ІІ,см. раздел "Материал и методика" ).Результаты,.суммированные в табл. 5,показывают,что в опытах 1,в,1 и 1,г,1 плотность митозов достоверно различается ( Р 0,05 ).В опыте І,в,П,температура во время которого была несколько выше,чем в опыте Г,в,1 (рис.2), плотность митозов также повышается с одновременным увеличением вариабельности данных,и различия по этому показателю с поставленным в те же сроки опытом при 18-20 (1,г,П ) недостоверны. Следовательно,повышение температуры прямо влияет на интенсивность размножения клеток селезенки.
В активный период жизни лягушки в красной пульпе селезенки значительно возрастает количество свободных клеток.Наблюдаются многочисленные клетки с базофильной цитоплазмой,описанные выше; удается проследить все стадии дифференцировки каждого ряда.К осени Середина октября ) в ткани селезенки происходят обратные изменения: свободных элементов и клеток промежуточных стадий гемопоэза становится меньше,деление клеток почти прекращается.
Характерной чертой селезенки осенью является обилие в ней многоядерных макрофагов с крупными глыбами желто-бурого пигмента в цитоплазме рис.9 Белая пульпа представлена лимфоидными фолликулами и тяжами по ходу пульпарных артерий.В фолликулах отсустсвуют зародышевые центры.Иногда между клетками лимфоидных фолликулов внедряются миелоидные элементы.В белой пульпе хорошо различимы большие и малые лимфоциты (рис.Ю причем преобладать могут те или другие,в зависимости от состояния животного и от участка селезенки,но не от времени года.Так,зимой мы наблюдали особей,у которых фолликулы состоят в основном из бластов,тогда как летом встречаются животные с очень скудно развитой белой пульпой. Характерной принадлежностью фолликулов и тяжей белой пульпы являются одноядерные и многоядерные макрофаги,которые разрушают ЭритроЦИТЫ (Asvadourova,1913; Berg,1914) И Содержат В цитоплазме включения гемосидерина.Они встречаются также интра-васкулярно.Их морфология и сезонный цикл будут подробно описаны ниже. Термин "гемоцитобласт" мы применяем к гетерогенной популяции клеток с морфологией большого лимфоцита,имеющей в своем составе, по-видимому, и стволовые,и полустволовые клетки различных рядов кроветворения.Это клетки размером 8-Ю мкм,округлой или овальной формы.Также округлое ядро имеет размеры 7-8 мкм,сильно деспирализованный хроматин и 1-2 довольно крупных ядрышка.Цитоплазма умеренно базофильна.Клетки встречаются как в кроветворной ткани,так и в циркулирующей крови (рис.8,а; II,а). .Эритроидный ряд При изучении клеток эритроидного ряда нами использована следующая классификация,предложенная рядом авторов для амфибий (Smetana,bikovsky,1972; Degli Espositi,Garavini,1975)« Проэритробласт - первая стадия,которую удается идентифицировать морфологически.Это клетка округлой формы с довольно крупным и светлым круглым ядром,размеры которого несколько меньше, чем у гемоцитобласта.Глыбки хроматина немного крупнее и теснее расположены.Четко видно одно,реже несколько ядрышек. Узкая кайма цитоплазмы более базофильна,чем у гемоцитобласта Базофильный эритробласт - это клетка с характерными для эритробластов ровными очертаниями,с сильно базофильной цитоплазмой и темным ядром,размеры которого меньше,чем у проэрит-робласта.Контуры глыбок хроматина слегка размыты,ядрышко удается различить с трудом.На препаратах,окрашенных эозином-азу-ром,плотность окраски ядра,ядрышка и цитоплазмы примерно одинакова, но цитоплазма и ядрышко имеют более фиолетовый оттенок (рис.II,в ).
Особенности сезонной динамики популяции макрофагов селезенки
Осенью количество зрелых и незрелых нейтрофилов в крови лягушки достаточно велико.Относительное количество зрелых нейтрофилов у большинства животных максимально в сентябре - октябре и достигает 5-13$ от всех элементов крови ( рис.24,а,III,ІУ, У,У1,Г).В октябре - ноябре (рис.24,а,І,П,У,УІ,І) количество нейтрофилов резко снижается и в течение всей зимы остается меньше 1$.Только у одной лягушки,которая погибла в конце марта, количество нейтрофилов держалось зимой на уровне 1,5$,а в феврале увеличилось до 7,13$ ( рис.24,а,111,1) .Количество незрелых нейтрофилов максимально в сентябре - октябре,а в течение зимы не превышает нескольких десятых или сотых долей процента (рис. 24,а,2).
І9/УІІІ,через 2 недели после введения %-тимидина,относительное количество меченых нейтрофилов составляет от 62,5$ до 96,0$ (в одном случае - 24,7$ ) (рис.24,а,3),причем подавляющее большинство клеток мечено очень сильно и содержит в среднем уиразных животных от 84,7 до 175,0 зерен серебра над ядром (рис.24,б; 25,1,а ).Еще через 2 недели,2/IX,количество меченых нейтрофилов возрастает до 90,0 - 100$ (рис.24,а,3 ),а среднее количество зерен серебра падает до 16,82 - 22,70 на ядро(рис. 24,6; 25,1,0) .
Дальнейшем в течение всей зимы не происходит значительных изменений ни в количестве меченых нейтрофилов,которое остается близким к 100$ (рис.24,а,3) ,ни в распределении количества зерен серебра над ядрами (рис.25,1,в) .Это означает,что скорость обновления нейтрофилов сильно уменьшается уже в сентябре , гораздо раньше начала зимовки.
Об этом же свидетельствуют результаты ранее поисанного опыта 1,д,1 по кинетике обновления популяции нейтрофилов в летний период (рис.20,г).Количество меченых нейтрофилов,равное сразу после окончания инъекций 71,0$,в течение первой половины августа уменьшается довольно быстро и за две недели достигает 36,5$.Затем замещение меченых клеток немечеными замедляется,и в середине октября 25,0$ нейтрофилов по-прежнему являются мечеными.
С наступлением весны (у одной лягушки в марте - апрелей у двух в мае) количество нейтрофилов в крови увеличивается (рис. 24,а,ИДУ,У,І).У животных,клетки которых в начале опыта были мечены очень интенсивно,можно заметить одновременное уменьшение плотности метки (рис.24,б,И,1У).У двух животных наблюдается также уменьшение количества меченых нейтрофилов с 96,5 и 79,75$ соответственно до 2,0 и 3,0$ (рис.24,а,ГУ,У,з).У третьего, содержащего наиболее интенсивную метку,количество меченых клеток остается больше 90$ ( рис.24,а,11,3 ).Все эти данные указывают на начало неитрофильного миелопоэза и обновления популяции нейтрофилов.У четвертой лягушки ни в мае,ни в июне не удалось обнаружить признаков миелопоэза (рис.24,1).
В условиях патологии интенсификация нейтрофильного миелопоэза происходит также и у зимующих лягушек при низкой температуре. Так, у двух животных,которые погибли до окончания опыта (в октябре и в марте),мы наблюдали незадолго до гибели появление большого количества очень крупных нейтрофилов,как зрелых, так и молодых (рис.26).Эта новая популяция почти полностью вытесняла нейтрофилы обычного размера.У нормальных лягушек подобных нейтрофилов не обнаружено.
Приведенные данные показывают,что в период активной жизни лягушки (в конце лета) происходит почти полная смена циркулирующих нейтрофилов каждые 2 недели: немеченые клетки сменяются сильно мечеными,а они,в свою очередь,слабо мечеными.Отсюда можно проблизительно определить,что длительность жизни нейтрофилов активных лягушек равна 2 неделям.
Длительность жизни нейтрофилов можно вычислить более точно, учитывая, что срок созревания клеток нейтрофильного ряда после последней фазы синтеза ДНК (т.е.,срок появления первых меченых зрелых нейтрофилов в селезенке) равен 24 ч.Это следует из результатов опыта 2,6 (рис.3,2,б).Примем,что: I.Обновление нейтрофилов летом идет с относительно постоянной скоростью. 2.Б течение 6-кратных ежесуточных инъекций 3Н-тимидина (9/УІІІ - І4/УІІІ) мечеными оказались все или подавляющее большинство клеток миелоидного ряда,что не противоречит данным Хайтауэра (Hightower,i978) по кинетике миелопоэза у амфибий. З.До 19ДіІІ ( первый срок наблюдения) не происходит значительного разбавления метки в клетках миелоидного ряда,поэтому нейтрофилы,созревающие в этот период,мечены. Тогда,начиная с І0/УІІ (момент появления первых меченых клеток) вплоть до 19АIII все созревшие нейтрофилы будут содержать метку.Длительность жизни нейтрофилов (т.е.,срок,когда немеченые клетки на 100% будут заменены мечеными) можно получить из пропорции.
