Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Влияние неблагоприятных факторов среды на пренатальное развитие головного мозга млеко питающих (обзор литературы) 14
1.1. Влияние стресса матери на развитие головного мозга у млекопитающих 15
1.2. Роль серотонина в пренатальном развитии млекопитающих 22
1.3. Влияние пренатальной гипоксии на развитие головного мозга крыс 31
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 37
ГЛАВА 3. Влияние стресса матери на пренатальное развитие мозга крыс 52
3.1. Непосредственные реакции развивающегося головного мозга крыс на стресс матери 52
3.2. Отдаленные последствия стресса матери в структурной организации отделов головного мозга у потомства крыс 52
ГЛАВА 4. Влияние синтетического глюкокортикоида дексаметазона на развитие мозга крыс 112
4.1. Непосредственные реакции клеток развивающегося мозга крыс на воздействие дексаметазона 112
4.2. Отдаленные последствия воздействия дексаметазона в пренатальный период развития крыс 115
ГЛАВА 5. Влияние дефицита серотонина на пренатальное развитие млекопитающих 150
5.1. Изучение возможного цитотоксического действия парахлорфенилаланина на клетки эмбриона мыши 150
5.2. Развитие эмбрионов мыши на фоне дефицита серотони-на (доимплантационные и ранние постимплантационные стадии) 150
5.3. Развитие эмбрионов мыши на фоне дефицита серотонина (поздние постимплантационные стадии) 151
5.4. Формирование структур головного мозга у мышей, развивавшихся на фоне дефицита серотонина 155
5.5. Морфометрический анализ слоев neocortex на 3, 5 и 10 постнатальные сутки у мышей, развивавшихся в условиях дефицита серотонина 165
5.6. Динамика формирования астроцитов в neocortex мыши в ранние сроки постнатального периода развития после пренатальной деплеции серотонина. Иммуноцитохимическое исследование на выявление специфического глиального фибриллярного кислого
белка (GFAP) 170
5.7. Электронно-микроскопическое исследование нейронов и глиальных клеток в neocortex животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина 174
5.8. Отдаленные последствия пренатальной деплеции серотонина 184
ГЛАВА 6. Влияние острой гипоксии на пренатальное развитие мозга крыс 204
6.1. Непосредственные реакции развивающегося головного мозга крыс в ответ на острую гипоксию 204
6.2. Отдаленные последствия острой пренатальной гипоксии в развитии головного мозга крыс 207
ГЛАВА 7. Обсуждение 235
7.1. Влияние иммобилизационного стресса матери на развитие отделов головного мозга крыс 235
7.2. Действие синтетического глюкокортикоида дексаметазона на развитие отделов головного мозга крыс 246
7.3. Влияние дефицита серотонина на пренатальное развитие млекопитающих 250
7.4. Влияние острой пренатальнои гипоксии на развитие отделов головного мозга крыс 266
Заключение 274
Выводы 276
Список литературы
- Роль серотонина в пренатальном развитии млекопитающих
- Отдаленные последствия стресса матери в структурной организации отделов головного мозга у потомства крыс
- Отдаленные последствия воздействия дексаметазона в пренатальный период развития крыс
- Развитие эмбрионов мыши на фоне дефицита серотонина (поздние постимплантационные стадии)
Введение к работе
Актуальность темы. Исследования механизмов внутриутробного развития центральной нервной системы относятся к числу актуальных задач современной биологии и медицины. В период эмбриогенеза формируются основные структурно-функциональные характеристики дефинитивного головного мозга и могут закладываться основы различных патологических состояний и нервно-психических заболеваний, проявляющихся после рождения. Высокий интерес исследователей к проблемам влияния неблагоприятных факторов среды (экологических факторов, гипоксии разного генеза, стрессов, различных фармакологических препаратов, курения, употребления алкоголя, наркотиков и т.д.) на развивающийся организм обусловлен постоянным повышением частоты неврологических нарушений у новорожденных и детей разных возрастных групп. Актуальность изучения этой проблемы обусловлена еще и тем, что при всех усилиях, направленных на лечение и реабилитацию этих детей к пубертатному возрасту среди них регистрируется значительное число инвалидов. По данным статистики различные отклонения нервно-психического развития, обусловленные пренатальной патологией, диагностируются в разных областях России примерно у 27-44% детей в возрасте до 15 лет (Володин Н.Н. и др. 2001).
В последние годы особое внимание исследователей привлекает изучение последствий влияния стресса матери на формирование поведенческих реакций, обучения, памяти, выявлению физиологических отклонений у потомства. В специальной литературе имеются свидетельства того, что различные стрессовые воздействия, связанные с эмоциональными нагрузками или воздействиями неблагоприятных факторов среды во время беременности, вызывают отклонения в строении отделов головного мозга, сопровождающиеся функциональными расстройствами ЦНС в постнатальном периоде развития. Как известно, стресс матери повышает ее
гормональную активность, нарушает регуляцию функций гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы и значительно усиливает секрецию кортикоидов.
Воздействие на плод высокого уровня материнских эндогенных глюкокортикоидных гормонов при стрессе приводит, как показывают наблюдения у человека и экспериментальные исследования на животных, к снижению внимания и способности к обучению, склонности к депрессии, изменению в мотивационно-эмоциональной сфере, к нарушениям моторной активности, низкому порогу раздражительности, повышению страха и тревожности и т.д. (Weinstock М., 1997; Weinstock М., 2001; Lemaire V., Koehl М., Le Moal., 2000).
Не менее важным является исследование влияния повышенного уровня глюкокортикоидов на развивающийся мозг, возникающий после введения их синтетических аналогов. В настоящее время в акушерской практике синтетические глюкокортикоиды (дексаметазон, бетаметазон, дексазон и др.) имеют достаточно широкое терапевтическое применение. Они используются как иммуносупрессоры, противовоспалительные средства, а также для ускорения развития легких у плода при угрозе преждевременных родов. Иногда дексаметазон применяется на протяжении почти всей беременности при риске врожденной почечной гиперплазии. Результаты недавних исследований показали, что воздействие синтетических глюкокортикоидов в пренатальный период приводит к нарушению развития некоторых отделов мозга, сокращению количества синапсов, а также вызывает задержку созревания нейронов, уменьшение массы всего мозга у потомства крыс (Muneoka К., Mikuni М., Ogava Т. et al., 1997; Young N.A., Teskey G.C., Henry L.C., et al., 2006). Эффекты воздействий глюкокортикоидов на плод человека до сих пор недостаточно изучены. Однако известно, что у детей, пренатально подвергавшихся действию дексаметазона, наблюдается изменение познавательной способности, эмоционального и социального поведения, задержка психомоторного развития (Trautman P.D. et al., 1995;
Lajic S., Wedell A. et al., 1998). Наблюдения у человека и данные, полученные в экспериментах на грызунах, свидетельствуют о том, что воздействие повышенного уровня глюкокортикоидов (экзогенного происхождения или эндогенного кортизола в ответ на стресс матери во время беременности) приводят к неблагоприятным эффектам, включающим нейроэндокринные и поведенческие расстройства, которые конечно необходимо изучать. Однако одним из актуальных и особо значимых направлений исследований в этой области на современном этапе должны быть исследования механизмов структурных изменений отделов головного мозга плода, новорожденного и индивидуума в постнатальном периоде развития. Данные о клеточных механизмах и структурных основах функциональных нарушений ЦНС в формациях головного мозга в настоящее время отсутствуют.
Механизмы перечисленных выше эффектов стресса в той или иной мере связаны как с глюкокортикоидами, так и с моноаминами. Острый и хронический стресс вызывает в разной мере выраженное в отдельных структурах мозга изменение уровня серотонина, числа пре- и постсинаптических серотониновых рецепторов, особенно в участках мозга связанных с контролем страха и тревожности (Aldridge J.E. et al., 2003; Janusonis et al., 2004). Эти факты свидетельствуют о том, что серотонинергическая система является мишенью воздействия гормонов стресса, особенно кортикоидов. В ответные реакции эмбрионов и плодов на воздействие материнского стресса вовлекается развивающаяся серотонинергическая система. Однако как влияет изменение уровня содержания серотонина и его метаболизма на ключевых стадиях морфогенеза на эмбриональное развитие и, в том числе, формирование структур головного мозга млекопитающих остается не известным.
Одним из значимых повреждающих агентов влияющих на развитие головного мозга является гипоксия различной этиологии (внешняя среда, заболевания матери и т.д.). Развивающийся мозг человека и млекопитающих
чувствителен к гипоксии. Ее воздействие в пренатальный период, по
мнению клиницистов, вызывает наибольшее число отклонений в развитии
нервной системы, составляющих большую гетерогенную группу
нейропатологий. Экспериментальные исследования на животных показали,
что пренатальная гипоксия, как и материнский стресс, приводит к
нарушениям формирования поведенческих реакций, развитию двигательной
активности, ослаблению способности к обучению, снижению массы тела
(Tashima L. et al., 2001; Vexler Z., Ferriero D., 2001; Pascual J., Koenigsberger
M., 2003). Влияние различных форм гипоксии на строение и функции
систем и органов достаточно хорошо изучено у взрослых животных, однако реакции клеток различных отделов развивающегося мозга в период раннего нейрогенеза на повреждающее действие гипоксии, а также структурные изменения формаций мозга у потомства в постнатальный период не исследованы.
Изучение этих проблем требует проведения модельных экспериментов на
животных, основное направление которых должно быть связано с
исследованием влияния повреждающих факторов: повышенного уровня
глюкокортикоидных гормонов, влекущего за собой изменение уровней
содержания и метаболизма моноаминов, а также острой пренатальной
гипоксии на развитие структур головного мозга, во время раннего
постим плантационного периода, когда формируются закладки формаций
головного мозга, и на стадиях их активного роста. Необходимо проследить
последствия пренатальных воздействий неблагоприятных факторов в
постнатальный период развития, и выявить конкретные клеточные и
тканевые механизмы, приводящие к формированию аномалий развития ЦНС.
Широкое использование в клинике синтетических аналогов
глюкокортикоидных гормонов для терапии беременных, о влиянии которых на развитие потомства известно крайне мало, указывает на острую необходимость фундаментальных исследований побочных эффектов этих препаратов. Получение данных такого рода представляется необходимым
для установления механизмов морфогенеза эмбрионального мозга, а также для более глубокого понимания основ формирования врожденных патологий ЦНС.
Цель исследования. Изучение клеточных механизмов эмбрионального развития и реакций таких полифункциональных формаций головного мозга млекопитающих как неокортекс, гиппокамп, стволовые моноаминергические ядра в ответ на различные стрессовые воздействия в пренатальныи период и их эффекты в последующем онтогенезе.
Для этого поставлены следующие ЗАДАЧИ:
Изучить влияние повреждающих факторов (повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов, как эндогенных после хронического материнского стресса, так и экзогенных после введения синтетического кортикоида дексаметазона; сниженного уровня серотонина и острой пренатальной нормобарической гипоксии) на развитие исследуемых отделов эмбрионального мозга лабораторных млекопитающих.
Проследить непосредственные реакции нейральных эмбриональных клеток развивающегося головного мозга на воздействия повреждающих факторов.
Выявить отдаленные последствия пренатальных воздействий повреждающих факторов, определив динамику изменения структурных характеристик формаций мозга на разных этапах постнатального периода развития (препубертатном, пубертатном и у половозрелых животных).
Новизна полученных результатов. Впервые получены данные о динамике развития клеточных и тканевых реакций в отделах развивающегося головного мозга грызунов в ответ на воздействия повреждающих факторов. В зависимости от глубины и характера изменений выявлены адаптивные и
10 деструктивные реакции, являющиеся структурной основой формирования преиатальной патологии ЦНС.
Впервые установлено, что избыточный уровень глюкокортикоидов (как
следствие материнского стресса, так и введения синтетических аналогов) во
время беременности, вызывает непосредственные реакции нейральных
клеток развивающегося мозга, приводящие к быстрой апоптотической
гибели части из них, нарушает базисные гистогенетические процессы
развития и оставляет длительный след в виде структурных изменений в
формациях головного мозга у потомков в постнатальном периоде и
достигших половозрелого возраста. Избыток глюкокортикоидов в ранние
периоды формирования мозга и его функций приводит к тяжелым
аномалиям развития неокортекса, гиппокампа и стволовых
моноаминергических ядер, проявляющихся в недоразвитии и истончении
слоев, сокращении количества клеток в структурах, изменении соотношения
разных типов клеток, отсроченной гибели нейронов. Показано, что
серотонин функционально активен на протяжении всего пренатального
периода. Он необходим для нормального развития эмбриона как в
доимплантационный, так и постимплантационный периоды развития
млекопитающих. Дефицит серотонина на доимплантационных стадиях
приводит к гибели дробящихся зародышей, а в постимплантационный
период вызывает задержку развития и дифференциации нейральных и
глиальных клеток в отделах развивающегося мозга, нарушает формирование
ряда структур головного мозга, в том числе, серотонинергического центра
мозга - дорсального ядра шва, что приводит к вторичному дефициту
эндогенного нейронального серотонина и может инициировать развитие
новых патологических процессов. Получены новые сведения о влиянии
острой пренатальной гипоксии на развитие неокортекса и структур
гиппокампа. Показано, что гипоксия вызывает непосредственную
выраженную реакцию эмбриональных нейральных клеток, приводящую значительную их часть к апоптотической гибели, и оставляет след в
11 постнатальном периоде развития, представленный недоразвитем кортикальных структур и формаций гиппокампа. Впервые морфологически показано, что клетки развивающихся различных отделов гиппокампа имеют разную чувствительность к гипоксии. Выявлено, что повреждающее действие гипоксии на эмбриональный мозг имеет стадиоспецифический эффект.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты данной работы являются существенным вкладом в понимание клеточных механизмов формирования структурных основ врожденных патологий ЦНС, проявляющихся после рождения. Установленные непосредственные клеточные реакции и модификации базисных гистогенетических процессов во время формирования отделов головного мозга, в том числе стволовых моноаминергических ядер, в ответ на воздействия стрессовых факторов в пренатальный период, расширяют представления о патогенезе нейродегенеративных заболеваний в постнатальном онтогенезе. Выявлен существенный факт, что во время эмбриогенеза биологически активные вещества (гормоны, моноамины), запускающие и регулирующие клеточные и тканевые процессы генетической программы развития мозга, даже при непродолжительном воздействии эпигенетических факторов, могут искажать эту программу, приводя к формированию отклонений в строении отделов мозга, которые сохраняются в течение всего последующего онтогенеза. Материалы данного исследования определяют круг экспериментальных моделей для изучения возникновения разнообразных нарушений поведенческих реакций, памяти, обучения, депрессии, врожденных психопатологий. Представленные данные могут служить основой для создания моделей медикаментозной коррекции врожденных нарушений, а также привлечь широкое внимание к профилактике последствий неблагоприятных воздействий во время беременности, особенно в период
12 основного органогенеза у эмбрионов, наиболее чувствительного и опасного для жизни и здоровья потомства.
Полученные данные могут быть использованы в преподавании морфологических дисциплин в процессе подготовки гистологов, эмбриологов, неонатологов, детских неврологов и усовершенствовании врачей.
Основные положения, выносимые на защиту:
Воздействия использованных повреждающих факторов среды на развивающийся мозг вызывают модификации базисных гистогенетических процессов — пролиферации, миграции и дифференциации нервных клеток. Это приводит к формированию однотипных структурных отклонений в строении отделов головного мозга, которые сохраняются в течение всего последующего онтогенеза.
Избыточный уровень глюкокортикоидов и пониженный уровень серотонина в эмбриональный период существенно влияют на развитие фетального мозга, изменяя процессы нейро-, глиогенеза и дифференциации нейронов. Структурные изменения и клеточная гибель в отделах головного мозга формируются в пренатальный период и сохраняются после рождения.
Пренатальный период развития млекопитающих высоко чувствителен к низким уровням серотонина. Серотонин играет важную роль в механизмах морфогенеза, начиная с ранних доимплантационных стадий. Его дефицит приводит к нарушению нейро- и глиогенеза, лежащих в основе аномалий развития структур головного мозга. Серотонин является авторегулятором развития серотонинергического центра мозга - nucleus raphe dorsalis. Снижение уровня серотонина на ранних этапах эмбриогенеза приводит к структурным изменениям в nucleus raphe dorsalis, уменьшению количества серотонинсинтезирую-щих нейронов, что может вызывать его вторичный дефицит.
13 4. Повреждающее действие острой пренатальной гипоксии имеет стадиоспецифический эффект. Наибольшая степень выраженности структурных изменений в отделах мозга регистрируется при воздействии гипоксии на более ранних постимплантационных стадиях, во время, когда активны процессы пролиферации, миграции и дифференцировки нервных клеток, обеспечивающих формирование структур мозга и их клеточный состав.
Роль серотонина в пренатальном развитии млекопитающих
Среди биологически активных веществ (в настоящее время их известно около 40), разнообразных по химической природе, выделяют так называемые классические нейротрансмиттеры — ацетилхолин и биогенные амины: серотонин (5-НТ), дофамин, норадреналин, адреналин и гамма аминомасляную кислоту (ГАМК). Существует мнение, что общим для классических нейротрансмиттеров является то, что они образуются из аминокислот, используемых для синтеза белков и то, что они функционально активны в течение всего онтогенеза, начиная с донервных стадий развития (Бузников Г.А., 1987; Brown К.М., Anitole K.G., 1993; Lauder J.M., 1993; Buznikov G.A., Shmukler Y.B., Lauder J.M., 1996; Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер B.M.,1997).
Установлено, что биогенные моноамины функционируют сначала как внутриклеточные регуляторы, затем становятся локальными гормонами и, наконец, приобретают роль синаптических передатчиков, т.е. переход от донервных к нейрональным этапам онтогенеза сопровождается изменениями физиологической роли классических нейротрансмиттеров. На протяжении всего цикла индивидуального развития действие нейротрансмиттеров точно адресовано. Именно поэтому донервные и нейроиальные биогенные моиоамины играют важную роль в пространственно-временной организации онтогенеза (Бузников Г. А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер В.М.,1997)
Известно, что донервный и нейрональный серотонин выступает как триггер и регулятор гаметогенеза. Серотонин был обнаружен в ооцитах морских звезд и амфибий, в фолликулярной жидкости у человека. Предполагается, что этот моноамин может иметь смешанное (донервное, ненервное и нейрональное) происхождение, т.е. синтезироваться как в самих ооцитах и фолликулярных клетках, так и поступать из материнского организма (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер В.М.,1997).
Показано, что донервный серотонин выступает как регулятор делений дробления, ионного гомеостаза и ранних межклеточных взаимодействий у беспозвоночных и нисших позвоночных животных. Эта функция возникает в период от оплодотворения до завершения бластуляции. Нейротрансмиттер синтезируется непосредственно в зиготе или бластомерах. Зигота является аутокринной системой, включающей все сигнальные вещества — первичные и вторичные мессенджеры — и весь аппарат трансдукции и рецепции сигналов (Бузников Г.А., 1987; Capasso А., Parisi Е. et. al, 1987; Buznikov G.A., Shmukler Y.B., Lauder J.M., 1996;).
Внутриклеточные рецепторы участвуют в запуске и регуляции делений дробления и в межбластомерной адгезии. Для каждого из нейротрансмиттеров — регуляторов делений дробления, видимо, существует своя группа внутриклеточных рецепторов. У животных они отличаются по фармакологическим свойствам и не идентичны ни одному из известных типов рецепторов к серотонииу, дофамину, адреналину или ацетилхолину. Возможно, что на этих ранних стадиях развития присутствуют не истинные фармакологические рецепторы, а их функциональные эквиваленты. Предполагают, что роль донервных нейротрансмиттеров в запуске и регуляции делений дробления является универсальной у всех исследованных групп беспозвоночных и позвоночных животных, и всегда осуществляется при посредстве внутриклеточных рецепторов (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер В.М.,1997; Buznikov G.A., Shmukler Y.B., Lauder J.M., 1996).
Нейротрансмиттеры могут быть посредниками взаимодействий не только между дочерними бластомерами, но и между различными участками цитоплазмы внутри одной клетки, и в значительной степени определять судьбу дочерних клеток (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер В.М.,1997; Buznikov G.A., Shmukler Y.B., 1981).
Донервные нейротрансмиттеры (ацетилхолин и биогенные моноамины) известны как регуляторы морфогенетических клеточных движений и процессов происходящих при бластуляции и нейруляции у млекопитающих. На этих стадиях развития происходит нейротрансмиттерная специализация клеток, изменения свойств и локализации рецепторов, характера их функционального сопряжения со вторичными мессенджерами (ионами Са+2, цАМФ, диацилглицеринами, инозитолтрифосфатом и др.). Нейротрансмиттерные функции могут быть разными в различных группах клеток зародыша, появляться и исчезать. Во время делений дробления рецепторы к нейротрансмиттерам локализуются как внутриклеточно, так и на клеточной поверхности. На стадии нейруляции их многообразие возрастает (Бузников Г.А., 1987; Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер В.М., 1997; Falugi С, 1993).
Донервные и нейрональные нейротрансмиттеры являются морфогенами. Термин «морфоген» используется для обозначения эндогенных веществ, специфически влияющих на морфогенетические процессы в определенных группах клеток. Выраженность этих влияний зависит от градиента концентрации морфогена (Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер В.М., 1997). Показано, что морфогенетическая активность биогенных моноаминов возникает у позвоночных во время нейруляции. Серотопип и катехоламины активно захватываются клетками нервной трубки и, действуя на цитоскелет, регулируют морфогенетические клеточные движения, изменения формы клеток при замыкании нервной трубки. Пространственно-временная организация замыкания коррелирует с градиентами моноаминов в нервной трубке.
Отдаленные последствия стресса матери в структурной организации отделов головного мозга у потомства крыс
Исследование непосредственных реакций развивающейся нервной ткани на стресс матери проводили на 16 эмбриональные сутки, так как на этой стадии эмбриогенеза идут активные процессы органогенеза и развития зачатков формаций головного мозга.
Через 3 часа после процедуры иммобилизационного стрессирования самки крысы в развивающемся neocortex в субвентрикулярной зоне, где особенно активны процессы миграции нейробластов, присутствуют апоптотические тельца. Они собираются в группы и, в основном, локализуются у эндотелия стенок сосудов, в эпендимной зоне вблизи просвета желудочков или у наружной поверхности развивающейся кортикальной пластинки. Часто группы апоптотических телец встречаются в просветах сосудов (рис. 1).
Через 1 сутки после стрессирования матери, у плода в разных отделах развивающегося мозга на 17 эмбриональные сутки достаточно часто регистрируется гибель нейральных клеток. Группы апоптотических телец обнаруживаются в конечном мозге у эндотелия стенок эмбриональных сосудов, у наружной поверхности развивающегося неокортекса, а также в эмбриональном среднем мозге. Достаточно часто погибшие клетки можно встретить в эпендиме либо у просвета боковых желудочков, либо в просвете желудочков и просвете сосудов эмбриона, куда выводятся остатки погибших клеток из нейроэпителиального пласта (рис. 2).
Отдаленные последствия пренатального материнского стресса на развитие отделов головного мозга и их состояние в постнатальном периоде онтогенеза исследовали в препубертатный (25 постнатальные сутки) и пубертатный периоды (40 постнатальные сутки), а также у половозрелых животных (90 постнатальные сутки). В эти же постнатальные сроки было исследовано влияние пренатального материнского стресса на формирование структур мозга у животных, развивавшихся на фоне дефицита серотонина. 3.2.1. Морфология структур головного мозга после пренатального стресса у крыс на 25 постнатальные сутки.
Neocortex. У подопытных животных во всех исследованных областях коры (area frontalis, area parietalis, area temporalis, area occipitalis) слои истончены, особенно глубокие V и VI. Нейроны верхних слоев II-IV имеют округлую, иногда эллипсоидную форму ядер и небольшой объем цитоплазмы. Форма клеточных тел в основном веретеновидная в отличие от таковой в контроле, где слои II и III в основном состоят из малых пирамидных, вертикально ориентированных нейронов (рис. З а). У подопытных животных верхние слои разрежены, есть места выпадения нейронов, вещество Ниссля в цитоплазме распределено гомогенно. Преимущественно в этих слоях встречаются клетки с признаками хроматолиза разной степени выраженности. Цитоплазма таких клеток значительно просветлена, часто содержит разного размера вакуоли, при этом ядро клетки может быть деформировано (рис. 36). Иногда встречаются клетки-тени и места выпадения нейронов (рис. 36). Свободных и сателлитных глиальных клеток в верхних слоях значительно меньше, чем в контроле (50 ± 2,1 и 84 ± 2,3 клетки соответственно). Нередко встречается гиперхроматоз глиальных клеток.
В слое V больших пирамидных клеток меньше, чем таковых в контроле. Слой разрежен (рис. 4а,б). Нейроны имеют пирамидную или веретеновидную форму. Ядра округлые или эллипсоидные с 1 ядрышком. Объем цитоплазмы небольшой, особенно у клеток малого размера. Иногда цитоплазма содержит вакуоли, в таких клетках вещества Ниссля очень мало, оно распылено. Глиальных клеток в этом слое почти в 2 раза меньше, чем в контроле (80±1,9 и 150±2,1 клеток соответственно). Нередко клетки глии имеют сморщенное гиперхромное ядро.
Слой VI у контрольных животных состоит из полиморфных клеток, имеющих веретеновидную, овальную или многоугольную форму. Здесь присутствуют немногочисленные среднего размера пирамидные клетки (рис. 5а).
У подопытных животных слой VI истончен и состоит в основном из клеток небольшого размера округлой формы, содержащие круглые ядра с 1 ядрышком (рис.5 б). Объем цитоплазмы мал. Часто клетки содержат мелкие вакуоли у основания дендрита. В глубоких слоях V и VI встречается диффузно рассеянные сморщенные нейроны, а также с признаками гиперхроматоза. Глиальных клеток, как свободных, так и сателлитных почти в 2 раза меньше, чем в контроле (87±2,4 и 157±2,1 клеток соответственно). Area cingularis. У контрольных животных в передней подобласти лимбической коры нейроны как поверхностных, так глубоких слоев мало различаются по форме и величине клеточных тел. Они имеют преимущественно округлую или овальную форму. В задней лимбической подобласти структурное разнообразие нейронов несколько больше, чем в передней. Здесь в норме в поверхностном комплексе слоев (II-III-IV) клеточные тела нейронов малого размера имеют в основном округлую или слегка овальную форму и содержат круглые ядра. Плотность расположения нейронов достаточно высокая, но в слое IV мелкие звездчатые нейроны разполагаются более рыхло. В задней лимбической подобласти слой V состоит из более крупных пирамидных нейронов. Слой VI представлен нейронами небольшого размера округлой или веретеновидной формы.
У животных, переживших пренатальный стресс, основная часть нейронов верхних слоев передней подобласти лимбической коры имеет меньший размер клеточных тел, чем таковой в контроле, и крайне малый объем цитоплазмы. Нейроны располагаются более рыхло, их меньше, чем в контроле. Слои истончены, есть места выпадения нейронов.
Отдаленные последствия воздействия дексаметазона в пренатальный период развития крыс
Морфология структур головного мозга на 60 постнаталъные сутки у крыс после введения дексаметазона в дозе 1 мг/кг на 13 сутки эмбрионального развития.
Neocortex. У большинства подопытных крыс во всех изученных областях коры (area frontalis, area parietalis, area temporalis, area occipitalis) слои истончены. У отдельных животных значительная плотность расположения нейронов в neocortex дает основание предположить, что нейропиль в нем развит слабо (рис. 47).
Верхние слои (II-IV) составляют мелкие нейроны выраженной веретеновидной формы, их меньше, чем в контроле. Цитоплазмы мало, она в виде узкого ободка окружает округлой формы ядро. Глиальных элементов как свободных, так и сателлитных меньше, чем в контроле (84±2,7 и 126±2,4 соответственно)
В слое V больших пирамидных нейронов, имеющих традиционную пирамидную форму, крайне мало. В основном присутствуют нейроны среднего и малого размера, имеющих выраженную веретеновидную форму (рис. 47а), с ядрами овальной формы и малым объемом цитоплазмы, нередко содержащей мелкие вакуоли). Количество глиальных элементов меньше, чем в контроле (98±2,8 и 134±3,1 соответственно).
Слой VI составляют нейроны небольшого размера, содержащие округлой формы ядра и малый объем цитоплазмы. Редко встречаются сморщенные гиперхромные клетки (рис. 476). Глиальных клеток также меньше, чем в контроле (79±3,2 и 115±1,8 соответственно).
Area cingularis. В передней лимбической подобласти в поверхностном комплексе слоев и глубоких слоях V и VI преобладают мелкие веретеновидные нейроны с малым объемом цитоплазмы. В задней подобласти лимбической коры верхние слои (П-Ш и IV) истончены. Их составляют очень мелкие нейроны, с округлой или неправильной формой клеточного тела и крайне малым объемом цитоплазмы (рис.48а). Глубокие слои (V и VI) также истончены и состоят из меньшего количества клеток. Размер клеточных тел меньше, чем в контроле. Есть места выпадения нейронов (рис. 486).
Hippocampus. У подопытных животных в полях hippocampus СА1, САЗ и СА4 слои пирамидных нейронов несколько истончены, однако гибели клеток не обнаружено. Незначительная гибель гранулярных клеток встречается в fascia dentata.
Substantia nigra. У животных в эксперименте в substantia nigra zona compacta присутствуют сморщенные гиперхромные погибшие нейроны. У части клеток отмечена вакуолизация цитоплазмы, частичная или полная утрата вещества Ниссля (рис. 49).
Иммуноцитохимическое выявление тирозингидроксилазы в нейронах substantia nigra zona compacta
Иммуноцитохимическое исследование нейронов на содержание тирозингидроксилазы показало, что у подопытных животных иммунореактивных клеток в substantia nigra zona compacta значительно меньше, чем в контроле. Наряду с дофаминсинтезирующими нейронами присутствуют погибшие клетки (рис. 51). Уменьшение количества дофаминсинтезирующих нейронов и их гибель, может приводить к снижению объема синтеза дофамина и его оборота в организме.
Nucleus raphe dorsalis. У подопытных крыс в nucleus raphe dorsalis нейронов меньше, чем в таковом у контрольных животных. Крупные клетки практически отсутствуют, в основном, nucleus raphe dorsalis составляют клетки среднего и малого размера с небольшим объемом цитоплазмы. У части нейронов цитоплазма вакуолизирована и деформированы ядра. Нередко деформированы и сами тела клеток. Присутствуют гиперхромные погибшие клетки (примерно 3-4 клетки на поле зрения).
Морфология структур головного мозга на 60 постнаталъные сутки у крыс после введения дексаметазона в дозе 3 мг/кг на 13 сутки эмбрионального развития.
Neocortex. Во всех изученных областях коры (area frontalis, area parietalis, area temporalis, area occipitalis) слои значительно истончены и разрежены. В верхних слоях (II-IV) количество клеток меньше, чем в контроле. Нейроны содержат ядра овальной формы, малый объем цитоплазмы, которая в виде узкого ободка окружает ядро. Вещества Ниссля также мало. Ориентация клеток и дендритных отростков радиальная. Присутствуют нейроны с признаками хроматолиза (примерно 3-4 клетки на поле зрения). Глиальных элементов как свободных, так и сателлитных очень мало (61±2,2 и 126±2,4 соответственно).
В слое V нейронов, имеющих выраженную пирамидную форму мало (рис. 52а). Преобладают клетки среднего размера, имеющие округлую или овальную форму ядра и малый объем цитоплазмы. Есть места выпадения нейронов. Глиальных элементов, сателлитных и свободных, значительно меньше, чем в контроле (74±2,8 и 134±3,1 соответственно).
Слой VI составляют небольшие по размеру нейроны, преимущественно округлой формы с малым объемом цитоплазмы. Присутствуют места выпадения нейронов (рис. 526). Глиальных элементов незначительное количество (48±3,0 и 115±1,8 в контроле).
Area cingularis. В передней лимбической подобласти в поверхностном комплексе слоев и глубоких слоях V и VI присутствуют мелкие веретеновидные нейроны, объем цитоплазмы мал. В задней подобласти лимбической коры верхние слои (П-Ш и IV) истончены. Здесь преобладают нейроны малого размера округлой формы и малым объемом цитоплазмы. Глубокие слои (V и VI) также истончены, состоят из меньшего количества клеток. Встречаются места выпадения нейронов.
Развитие эмбрионов мыши на фоне дефицита серотонина (поздние постимплантационные стадии)
Исследование парахлорфенилаланина (пХФА) на цитотоксичность проводилось на мышах линии С57В1. пХФА вводили самкам на 15 сутки беременности в используемой дозе 400 мг/кг. Были исследованы различные эмбриональные и материнские (плацента) ткани.
Известно, что при действии токсических агентов структурные нарушения в эмбриональных клетках в достаточно высокой степени проявляются уже через 3-8-10 часов. В наших экспериментах через указанные промежутки времени после введения препарата не было обнаружено повреждающего действия пХФА на клетки ни в зародышевых, ни во внезародышевых, ни в материнских (матка, фетальная и материнская части плаценты) тканях.
Изучение зародышей мышей после введения пХФА на стадии зиготы (1 сутки беременности) показало, что из числа исследованных (более 70) ранних дробящихся зародышей ни один не достиг стадии бластоцисты. Зиготы либо не начинали дробление, либо проходили одно, два деления дробления и останавливались в своем развитии.
Изучение развития зародышей мышей после введения пХФА на стадии 2 бластомеров (2 сутки беременности) показало, что через сутки зародыши находились на стадии 4-6 бластомеров. В контроле к этому времени зародыши уже прошли 3-е деление дробления и находились на стадии 8 бластомеров. Через 2 суток после введения препарата (4 сутки развития) были обнаружены зародыши 3 морфологически различимых групп: эмбрионы, состоящие из 4-6 бластомеров, морулы (10-12 бластомеров) и бластоцисты, состоящие из 26-30 бластомеров. Все контрольные эмбрионы в это время находились на стадии бластоцисты, имели развитую полость и четко различимые трофобласт и внутреннюю клеточную массу (рис. 80). Следует отметить, что хотя преобразование морул в бластоцисты у подопытных и контрольных зародышей проходило в одно и тоже время, однако бластоцисты в опыте состояли из значительно меньшего количества более крупных клеток и имели относительно небольшую полость (рис. 80). Через 3 суток после введения пХФА (5 сутки развития) результаты были подобны данным, полученным на предыдущем сроке исследования, т.е. зародыши находились на стадиях 4, 6, 8 и 10 бластомеров, морулы небольших размеров и бластоцисты с маленькой полостью и небольшим количеством крупных бластомеров. Изучение развития зародышей через 6 суток после введения пХФА на 2 сутки развития показало, что эти эмбрионы способны индуцировать децидуальную реакцию и часть из них завершает процесс имплантации. При гистологическом исследовании было обнаружено, что половина сформировавшихся децидуом не содержала зародышей. Видимо, вызвав децидуальную реакцию, зародыши с недоразвитым трофобластом не способны завершить имплантацию. Часть эмбрионов присутствовала в децидуоме, как и в контроле, зародыши находились на стадии «яйцевого цилиндра», однако его размер был значительно меньше, чем в контроле.
В предыдущих сериях опытов было показано, что препарат сам по себе не оказывает повреждающего действия на эмбриональные клетки, тем не менее к концу эмбриогенеза (на 17-18 сутки развития) обнаруживались плоды с аномалиями развития. Значительный эффект отмечался после введения пХФА на 8-9 сутки беременности, в этом случае период активного органогенеза и развития центральной нервной системы проходил на фоне значительного снижения уровня серотонина (см. выше). Число плодов, имеющих аномалии развития достигало 40%. При введении пХФА на 6-7 сутки беременности аномалии развития встречались у 20-25% плодов. Спектр врожденных уродств был обширным. Наблюдались случаи недоразвития плодов (их малый размер), образования мозговых и пупочных грыж, укорочения нижней челюсти и конечностей, микрофтальмия, расщелина твердого неба.
Кроме анатомических аномалий развития частыми были обширные подкожные гематомы на голове, спине, конечностях и брюшной стороне тела. При этом отмечалась явная зависимость числа эмбрионов, имеющих гематомы, от срока введения пХФА. Так, при введении препарата на 6-7 день беременности гематомы имелись у 31% плодов, а при введении на 8-9 день - 61%). При данных условиях эксперимента погибших плодов в постимплантацинный период не было.
Исследование плодов с нарушениями формирования мозга показало наличие как открытых (часть мозга выступает из черепа и кожи), так и закрытых (часть мозга выступает из черепа под кожу) мозговых грыж (рис. 81). На гистологических срезах обнаруживались обширные кровоизлияния в мозге и в полости III желудочка, в отдельных участках продолговатого мозга, полосатого тела, в сосудистом сплетении.
Наряду с кровоизлияниями наблюдалось расширение и стаз кровеносных сосудов в головном и спинном мозге, внутренних органах и конечностях. Описанные реакции кровеносных сосудов могут быть обусловлены нарушениями серотонинергической иннервации сосудов, нарушениями их проницаемости, тонуса и кровотока.
