Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Значение цитогенетического метода изучения микроядер в оценке возрастных закономерностей пролиферации клеточных популяций (обзор литературы) 8
1.1. Молекулярные основы возрастных изменений клеточного генома 8
1.2. Свойства и механизмы образования клеток с микроядрами 9
1.3. Возрастные особенности образования микронуклеированных клеток в специализированных популяциях 13
1.4. Клеточное деление, соматическая полиплоидия и нарушения генома фолликулярных nipoimroii в онтогенезе 17
Глава II. Материал и методы исследования 23
Глава III. Анализ клеток с микроядрами в оценке онтогенетических закономерностей пролиферации фолликулярного эпителия щитовидной железы 30
3. 1. Микроскопическая с фуктура мнкромдер 30
3.2. Возрастная динамика содержания микронуклеированных тироцитов 33
3.3 Морфометрическая характеристика микроядер 38
3.4. Плоидность тнреондпой паренхимы 43
3.5. Пролиферация фолликулярного эпителия в постнатальном онтогенезе 47
3.5.1. Митотическая активность тироцитов 47
3.5.2. Синтез ДНК в фолликулярном и интерфолликулярном эпителии 52
3.5.3. Формирование генетически поврежденных клеток в фолликулах разного размера 62
Глава IV. Обсуждение результатов исследования 64
Выводы 73
Практические рекомендации 75
Литература 76
- Свойства и механизмы образования клеток с микроядрами
- Клеточное деление, соматическая полиплоидия и нарушения генома фолликулярных nipoimroii в онтогенезе
- Морфометрическая характеристика микроядер
- Синтез ДНК в фолликулярном и интерфолликулярном эпителии
Свойства и механизмы образования клеток с микроядрами
Общепризнанным механизмом образования микроядер является постмитотическая микронуклеация. Если генотоксические факторы не вызывают летальных повреждений делящихся клеток [«митотичсская катастрофа» по терминологии M.Castedo et al. (2004)]. отставшие хромосомы или их фрагменты при переходе в Gi-период интерфазы могут разрушаться и элиминироваться из клетки или формировать дополнительные ядерные тельца -микроядра (M.Fenech, 2000). Детальная кинетика формирования микроядер подробно описана при изучении тканевых культур фибробластов: отставшие хромосомы скручиваются, переплетаются между собой и подвергаются дес-пирализации, между их петлями формируется плотное гомогенное вещество, а вокруг ядерная оболочка (И.А.Алов, В.ВКазаньев, 1969). В исследованиях О.В.Зацепиной с соавт. (1982) и И.И.Киреева с соавт. (1988) детально описан процесс образования микроядер в эмбриональных клетках почек свиней в опытах in vivo при моделировании анеугенных повреждений: под влиянием гипотонических растворов хромосомы метафазных клеток разобщаются и претерпевают ряд структурных переходов, приводящих в конечном итоге к появлению множественных микроядер.
Наряду с классическим механизмом постмнтотической микронуклеа-ции, в культуре опухолевых клеток описано формирование микроядер в S-фазе клеточного цикла путем почкования от интерфазного ядра (N.Shimizu et al.,1998; T.Tanaka,N.Shimizu,2000). Феномен элиминации из ядра циркулярных ацентрических фрагментов ДНК (double-minute chromosomes), образующихся не в результате мутаций, а вследствие амплификации онкогенов, имеет важный биологический смысл - снижение туморогенного потенциала опухолевой клетки за счет ее освобождения от избыточных онкогенов (D.D.Von Hoff etal.,1992).
При изучении на уровне световой микроскопии микроядра имеют четко выраженную ядерную оболочку и по структуре близки к интерфазным ядрам соответствующего типа клеток, часть микроядер может содержать ядрышко и (или) ядрышковые организаторы (И.А.Алов, 1972; К.Ш.Михайлова, О.В.Зацепина, 1993). Единичные электрон но микроскопические исследования микроядер в культуре нормальных и опухолевых клеток также свидетельствуют о сходстве их строения с типичной структурой интерфазного ядра: в микроядрах обнаруживаются внутренняя и внешняя ядерные мембраны, ядерные поры, рибонуклеопротеидные частицы и хроматин (О.В.Зацепина с соавт., 1982; Labidi B.et а!.,1985; И.И.Киреев с соавт.,1988; Paglin S. et al.,1997). Однако для части мелких микроядер характерно появление участков слияния внутренней и внешней ядерных мембран, а также отсутствие периферического конденсированного хроматина (M.T.Goldberg, P.Chidiac,1986).
Исследования соматических клеток в красном костном мозге и в тканевых культурах (фибробласты, фолликулярные клетки яичника и др). показали несколько вариантов дальнейшего существования образовавшихся микрону клеированных клеток. Достаточно часто микроядра подвергаются пикнозу и выводятся из клетки (И.А.Алов, В.В Казаньев, 1969). возможна экструзия и морфологически жизнеспособных микроядер (S.Nito et al., 1988; J.W.Parton etal., 1991). В основе инициации гибели мнкронуклепршшпных клеток могут лежать иммунологические механизмы; за счет изменения антигенной структуры цитолеммы генетически аберрантных клеток возможно развитие цито-литической реакции лимфоцитов-киллеров (Н.Н.Ильинских с соавт., 1976).
Другой вариант - редупликация ДНК в составе микроядер (N.K.Das,1962; H.Kato,A.Sandberg,1968). Часто синтез ДНК в разных микроядрах идет асинхронно {М Gregoire et аІ.,1982), тимидиновую метку включают от 2,5 до 10% образовавшихся микроядер; пройдя S-фазу, последние способны к профазной перестройке, переходу в метафазу и слиянию микроядерной метафазы с метафазой основного ядра (И.А.Алов, В.В.Казаньев,1969; И.И.Киреев с соавт.,1988). В качестве единичных наблюдений в опухолевых клетках описано слияние микроядра с основным ядром в ннтерфазе (N.Shimizuetal.,1998).
Поскольку микроядра происходят из фрагментов хромосом или целых хромосом, углубленный анализ строения микроядер может оказаться достаточно информа in иным Оля оценки механизмов генотоксических повреждений (кластогенный и анеугенный эффекты). Об этом свидетельствуют результаты работ по изучению микроядер в культуре лимфоцитов или клеток красного костного мозга при действии на организм «классических» кластогенов (ионизирующее облучение, митомицин С) и анеугенов (винбластин, винкристин, колхицин). С целью идентификации микроядер, происходящих из целых хромосом, обычно используются тонкие методы идентификации в них центромеров: флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) или иммунофлюо-ресцентное выявление антикинетохорных антител (CREST staining (В M.Miller et al.,1991). Частота центромер-позитивных микроядер при введении винбластина в культуру лимфоцитов достигает 72-89%, в то время как при радиационных поражениях - только 7-49% (R.Huber et al.,1996). Сходные результаты получены на эритроидных клетках грызунов при сравнении эффекта винкристина и гамма-облучения: большинство микроядер, индуцированных радиацией, давали негативную, а винкристином - позитивную реакцию на кинетохоры (R.Gudi et а!.,1990); при введении колхицина доля центромер-позитивных микроядер достигает 66%, а митомицина С - 4,5 % (B.M.Miller, I.D.Adler,1990).
В исследованиях J.Grawe et а!.(1993,1994) обнаружена прямая корреляция между содержанием ДІЖ и частотой центром ер-позитивных микроядер в полихроматофильных эритроцитах: среди микроядер с минимальным содержанием ДНК (0,8-1,7% диплоидного генома) их менее 20%, в то время как среди микроядер с максимальным содержанием ДНК (1,7-10% диплоидного генома) - более 80%. Это свидетельствует, что определение количества ДНК в микроядрах также может дать объективную информацию о механизмах их индукции. Поскольку количество ДНК тесно коррелирует с размерами ядерных структур (Я.Е.Хесии, 1967; К.Ташкэ, 1980), проведен ряд исследований по измерению диаметра или площади микроядер при введении веществ, преимущественно поражающих хромосомы и митотический аппарат. На эритроидных клетках грызунов показано, что при введении веществ, обладающих кластогенной активностью, средние размеры микроядер существенно меньше, чем при введении анеугенов (K.Yamamoto, Y Kikushi, 1980; H.Tinwell, J.Ashby, 1991; N.Komae et al.,1997); при разных механизмах повреждения отчетливо различаются кривые распределения размерных классов микроядер (B.M.Schneider et al.,1995). Сходные результаты получены и в культуре лимфоцитов (B.Hogstedi,A.Karlsson,1985). По мнению K.Vanderkerken et at (1989), каждый из трех методов (выявление центромер-позитивных микроядер, определение количества ДНК в микроядрах и измерение средней площади микроядер) позволяет достаточно надежно дифференцировать микроядра, индуцированные кластогенами и анеугенами.
Клеточное деление, соматическая полиплоидия и нарушения генома фолликулярных тироцитов в онтогенезе
Среди растущих популяций фолликулярные тироциты представляются одной из наиболее перспективных и слабоизученных клеточных систем для анализа возрастных закономерностей накопления генетических нарушений:
тиреоидный эпителий характеризуется высокой структурной и функциональной лабильностью в ответ на разнообразные воздействия внешней и внутренней среды (Щитовидная железа: Фундаментальные аспекты, 1998);
с возрастом отмечается отчетливый рост частоты патологии ЩЖ, связанной с повреждениями генома тироцитов и нарушениями их пролиферации (S.Mariottietal.,1995;M.Habraand.,N.J.Sarlis,2005);
фолликулярные тироциты относятся к обратимым постмитотическим клеткам, характеризующимся относительно невысокой скоростью клеточного обновления - от 100 до 250 сут. у крыс и мышей (Р-А.Гибадулин, Ю.А.Романов, 1966; А.В.Павлов, 1990); в серии исследований, проведенных ранее в лаборатории кафедры гистологии Ярославской государственной медицинской академии показано, что микроядерный тест на модели предварительно стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов в опытах in vivo является информативным и чувствительным методом для оценки интенсивности влияния геногоксичных агентов на гиреоидную паренхиму (М.А.Гансбургский,2005; А.В.Павлов с соавт.,2006).
Поскольку, для образования микроядер необходимы:
а) наличие нерепарируемых повреждений ДНК, возникающих под влиянием эндогенных и экзогенных факторов;
б) достаточный уровень митотической активности, обеспечивающий переход морфологически неидентифицируемых латентных повреждений в структурные аберрации, поэтому представляет существенный интерес проанализировать степень изученности этих факторов применительно к возрастным изменениям фолликулярного эпителия щитовидной железы.
Пролиферативная активность тироцитов в онтогенезе. Наиболее подробно количественно изучена возрастная динамика процессов клеточного деления в экспериментах на лабораторных крысах первого года жизни. Максимальные значения величины митотического индекса и индекса меченых ядер (импульсная метка 3Н-тимидином) тироцитов обнаружены в первую неделю постнатального развития (соответственно 2,7-3,1%о и 5-7%), затем следует плавное снижение показателей ко 2-3 месяцу до уровня 0,2-0,35%о для МИ и 0,2-0,3% для ИМЯ (G.E.Sheline,1969; Ю.А.Романов с соавт.,1969; K.Christov et al.,1973; E.Conde et at.,1992). У ювенильных животных (3-4 мес.) и крыс репродуктивного возраста (6-8 мес.) МИ колеблется в диапазоне от 0,2 до 1,5%о, а ИМЯ - от 0,2 до 0,8% (B.Messier, C.P.Leblond, 1960; Р.А.Гибадулин, Ю.А.Романов, 1966; O.Redmond,A.R.Tutiery,1979; В.А.Глумова с соавт., І980; В.А.Глумова, 1987). Сведения о пролифератив-ной активности у животных старше 1 года единичны: по данным K.Christov et al.( 1973) ИМЯ тироцитов у 13-месячных крыс составляет 0,2%.
С возрастом могут меняться и параметры клеточного цикла тироцитов: по сравнению с 10-дневными крысами у животных в конце 1 года жизни (340 дней) общая продолжительность цикла возрастает с 14 до 19 часов, премущественно за счет удлинения периода S и длительности митоза (K.Christov etal.,1973).
Сходные по направленности данные получены при изучении возрастной динамики пролиферации паренхимы ЩЖ других лабораторных животных - мышей (Р.А.Гибадулин, 1967; Ю.А.Романов, 1969), морских свинок (H.T.BIumenthal,1945). При изучении 117 ЩЖ человека, разбитых на три возрастные группы (плодный период, 0-19 лет и 20-60 лет) обнаружено, что частота тироцитов с экспрессии ядерного антигена пролиферации Ki-67 составила соответственно 7,4, 0,23 и 0,08% (A.G.Saad et al.,2006).
Необходимо отметить, что количественный анализ величин МИ и ИМЯ тироцитов при импульсном введении предшественников ДНК не дает полной информации о пролиферативной активности железистых клеток в постна-тальной жизни. Это связано с наличием отчетливо выраженных суточных ритмов митотической активности в ЩЖ, неодинаковым уровнем клеточного размножения тироцитов в фолликулах разных размерных классов (Р.А.Гибадулин, Ю.А.Романов,1966; В.А.Глумова с соавт.,1980), а также относительно низким количеством делящихся клеток в каждый момент времени. Гораздо более информативной является прямая оценка суммарного количества ДНК-синтезирующих клеток на протяжении суток (суточный проли-феративный пул), основанная на повторном введении меченых предшественников ДНК (3Н-тимидина, бромуридина) с интервалом, меньшим продолжительности периода S (О.И Епифанова с соавт.,1977). Данный подход может оказаться плодотворным и при оценке вклада фолликулов разных размерных классов и интерфолликулярного эпителия в обеспечение постнатального роста и клеточного обновления тиреоидной паренхимы. Однако подобные исследования ЩЖ в литературе до настоящего времени отсутствуют.
Наряду с количественным анализом возрастной динамики процессов клеточного деления для комплексной оценки пролиферативных свойств высокоспециализированных клеточных линий существенный интерес представляет вопрос, насколько в ходе онтогенеза изменяется плоидность клеток - важнейшая интегральная характеристика их генома (В.Я.Бродский, И.В.Урываева,1981, V.Ya.Brodsky,I.V.Uryvaeva,!985). По данным большинства авторов паренхима ЩЖ взрослых крыс и человека в норме представлена преимущественно одноядерными диплоидными фолликулярными тироци-тами (И.В.Урываева с соавт.,1968, G.U.Auer et al.,1985; R.S.Camargo et al.,2005). В небольшом количестве могут встречаться полиплоидные элементы, представленные у людей одноядерными тетраплоидными (1,6-6,1%), а у крыс - двуядерными (до 2%) гланду л оцитами (P.Gilbert, P.Pfitzer, (977; А.В.Павлов с соавт.,2005). В то же время, в одной из перевиваемых линий FRTL-5 тироцитов крыс (АТСС CRL8305), часто используемой для модельных экспериментов по изучению свойств тиреоидного эпителия, V.Tasevski el al. (1998) обнаружен не диплоидный, как это принято считать, а тетрапло-идный состав популяция.
Данные о возрастной динамике плоидности тиреоидной паренхимы единичны. R.Bohman et al.(1985) описано появление одноядерных тетрашю-идных тироцитов (4с) у крыс первых двух недель жизни, количество этих клеток снижается в интервале 3-50 недель и вновь увеличивается у 100-недельных животных. По мнению авторов, первый подъем доли тетраплоидных клеток в популяции обусловлен интенсивной пролиферацией тироцитов, а второй - торможея и истуилення в митоз в Gj -фазе.
Существенный интерес представляет вопрос о плоидности образовавшихся микронуклспрованпых железистых клеток. В работе А.В.Павлова с соавт (2005) показано, что все аберрантные тироциты, образовавшиеся в результате действия м є тил нитрозомоче вины, являются тетраплоидными. Однако насколько данный феномен универсален для других ситуаций (возрастные перестройки, ионизирующее облучение, различные химические мутагены и пр.) продолжает оставаться неясным.
Возрастные нарушения генома тироцитов. Одним ИЗ убедительных аргументов в пользу накопления с возрастом уровня генетических повреждений тиреоидного эпителия является наблюдаемый на протяжении жизни человека рост количества доброкачественных и злокачественных узловых заболеваний (M.Habraand.,NJ.Sarlis,2005), в основе которых лежат разнообразные нарушения генома тироцитов (F.Moretti et al.,2000; D.L.Learoyd et al.,2000; K.Krohn et al.,2005): частота спорадического рака щитовидной железы прогрессивно возрастает на протяжении всей жизни и достигает максимума к 50-69 годам (Щитовидная железа: Фундаментальные аспекты, 1998), в этом возрасте существенно увеличивается уровень очаговых гиперпластических разрастаний ЩЖ (Physiological basis of aging and geriatrics.1994, S.Mariotti et al.,1995). В настоящее время выделены гены и группы генов, мутация которых связана с определенным видом узловой патологии ЩЖ. Мутации генов GSP и TSHR ассоциируются с доброкачественными гиперфункционирующими узелками ЩЖ и аденомами, для фолликулярной аденомы характерны точечные мутации генов RAS, PTEN (H.G.Suarez,20QO; G.Tailini,2002; K.Krohn et al-,2005)- Спорадического папиллярный рак ЩЖ отличается мутациями генов семейства BRAF (X.Xu et al.,2003; M.Xing,2005), фолликулярный рак - семейств RAS и PAX8/PPAR (M.A.Pierolti,2001). Молекулярный анализ интерфазных хромосом тироцитов человека показывает прогрессирующее с возрастом уменьшение длины их теломер, этот процесс наиболее выражен после 50 лет (M.Kammori et al.,2002).
Морфометрическая характеристика микроядер
Результаты морфометрического анализа ядерных структур микронуклеированных тироцитов представлены в таблице 3.
а) Модельные эксперименты. При гамма-облучении, вызывающем преимущественное повреждение хромосом (класто генный эффект).
Выявляются только мелкие микроядра (рис.7, а.б), составляющие в среднем 7.6% от суммарного объема ядерного аппарата аберрантной клетки. Введение колхицина, приводящее к избирательному поражению митотического аппарата клетки (анеугенный эффект), приводит к появлению более крупных мнкроядер (рнс.7. в.г). составляющих в среднем 32% от суммарного объема ядерного аппарата аберрантной клетки.
б) Возрастные изменения
Значения средней площади микроядер тироцитов находятся в интервале между результатами, полученными в модельных экспериментах. По сравнению с новорожденными, как абсолютные, так и относительные размеры микроядер у ювенильных крыс и животных репродуктивного возраста достоверно не изменяются (р 0.05). однако у старых крыс эти показатели снижаются соответственно на 20 и 28% (р 0,05).
е) Анализ размерных массов микроядер Изучение распределения микроядер по размерным классам их относительной площади (за 1.0 была принята общая площадь ядерных структур аберрантной клетки) в модельных экспериментах однозначно показало, что как для кластогенного, так и анеугенного эффектов характерен специфический характер гистограмм (рис 8.а). Не менее 95% экспериментальных точек при гамма-облучении лежало в интервале 0.01-0.19 (модальное значение 0,07), а при введении кохицина - в интервале 0.19-0,43 (с максимумом 0.34). Поэтому уровень 0.19 выбран в качестве границы между двумя размерными классами микроядер - мелкими {А) и крупными (В), образовавшимися в результате соответственно кластогенного и анеугенного генотоксического действия на тироциты.
Анализ распределения микроядер по размерным классам их относительной площади, проведенный у животных разных возрастных групп, свидетельствует о закономерных изменениях данного показателя на протяжении постнатального развития (рис. 8.6 и 9):
а) новорожденные В аберрантных тироцитах преобладают крупные микроядра класса В (72,7% всех ми крону кле и ро ванных тироцитов); среди последних наиболее выражен размерный класс 0.31 (27.2%). Доля мелких микроядер невелика - 27,3%.
б) 1-2 месяца По сравнению с новорожденными для этого периода характерно постепенное снижение частоты крупных микроядер класса 0,31 с 27,2% до 19.6% и росте 4.6% до15.2% частоты мелких микроядер класса 0.13; одновременно появляются мелкие микроядра класа 0,04 (2,2%).
Вследствие этих процессов доля микроядер класса В снижается до 65.2%. а микроядер класса А - возрастает до 34.8%. в) 24 месяца Вышеописанные тенденции усиливаются: частота микроядер преобладающего у новорожденных размерного класса 0,31 снижается до минимальных значений (4,5%), в то время как доля мелких микроядер классов 0.04 и 0.13 возрастает соответственно до 8.2% и 19,7%.
В конечном итоги это приводит к преобладанию доли мелких микроядер (А) над крупными (В) - соответственно 60.7% и 39,3%.
Таким образом ведущими тенденциями изменения морфометрических параметров микроядер аберрантных тироцитов на протяжении постнатального онтогенеза являются:
Уменьшение абсолютных и относительных средних размеров микроядер;
Количественное преобладание крупных микроядер над мелкими у новорожденных, ювенильных и половозрелых животных;
Прогрессирующее снижение с возрастом доли крупных (А) и нарастание содержания мелких (В) микроядер, приводящее к отчетливому преобладанию последних у старых крыс (рис.9).
Синтез ДНК в фолликулярном и интерфолликулярном эпителии
Фолликулярная организация ЩЖ закономерно изменяется на протяжении постнатального онтогенеза (В.Л.Быков, 1979,197%), поэтому для углубленного изучения возрастных особенностей пролиферации тироцитов предпринята попытка анализа величин индекса меченых ядер (ИМЯ) и суточного пролиферативного пула (Рс) не только на уровне органа, но и основных структурных компонентов тиреоидной паренхимы (фолликулы и интерфолликулярный эпителий).
а) Количественный анализ фолликулярной организации ЩЖ. Поскольку показатели пролиферативной активности выражаются в % по отношению к общему числу учтенных клеток, в основу выделения классов фолликулов положен подсчет среднего числа клеток на срезе фолликула; этот подход впервые предложен и успешно апробирован в работах Р.А.Гибадулина и Ю.А.Романова (1966), Ю.А.Романова (1969), В.А.Глумовой с соавт. (1980). При этом учитывались только содержащие коллоид типичные фолликулы с четко выраженным однослойным эпителием, из подсчета исключались заведомо тангенциальные срезы фолликулов («горбушки»).
В основу объективного выбора универсальных границ размерных классов фолликулов для анализа пролиферативной активности тиреоидной паренхимы на протяжении постнатального онтогенеза крыс положен анализ распределения фолликулов по числу клеток на срезе, наблюдаемого у новорожденных животных (рис.18). В этом возрасте (красная линия графика) отчетливо преобладают (85%) мелкие фолликулы (класс Д — 3-10 клеток на срезе фолликула, см. левую часть кривой, приближающуюся к нормальному распределению), более пологая правая часть кривой соответствует средним фолликулам (класс В - 11-30 клеток). Начиная с I месяца постнатального развития в паренхиме ЩЖ обнаруживаются крупные фолликулы (класс С - 31-50 клеток), а у 7- месячных животных -сверхкрупные фолликулы (класс D- более 51 клетки).
Сопоставление использованного показателя с более широко распространенным в литературе анализом размеров фолликулов по их среднему диаметру (В.Л.Быков.1979а; О.К.Хмельницкий.2002) показало, что между этими показателями во всех возрастных группах обнаружена тесная прямая корреляция (значення коэффициента корреляции Пирсона г для новорожденных. 1-месячных. 7-месячных и 2-летних крыс составили соответственно+0.95:+0.97;+0.90 и +0.91 (р 0.05). зависимость описывается сходными уравнениями линейной регрессии (рис.20);
У= 7.358 1.905Х (новорожденные). У= 16.67 + 2.211Х(\ мес),
У= 19.86+ 1.891X17 мес). У= 20.85 + 2.147Х (24 мес) где У - средний диаметр фолликула (мкм). X - среднее число клеток на срезе того же фолликула.
Количественная динамика содержания фолликулов выделенных размерных классов на протяжении лостнатального онтогенеза обобщена в таблице 5.
Класс А (мелкие фолликулы). Фолликулы этого класса преобладают у новорожденных, доля их в популяции достигает 85%. По сравнению с этим сроком к концу 1 месяца жизни крыс их содержание снижается на 1/3, начиная с 7 месяца доля микрофолликулов снижается в 2,3- 2,7 раза и стабилизируется на уровне 32-38%.
Класс В (средние фолликулы). По сравнению с новорожденными отмечен отчетливый рост их доли в популяции в 2,6 раза к концу 1 мес. и в 3,5 раза к 7 мес. Начиная с этого возраста фолликулы данного класса становятся преобладающими, их доля стабилизируется на уровне 48-53% .
Класс С (крутые фолликулы) Отсутствуют у новорожденных крыс, появляются в небольшом количестве (3%) у месячных животных. У половозрелых и старых животных их содержание возрастает в среднем в 4 раза и стабилизируется на уровне 12-13%.
Класс D (сверхкрупные фолликулы). Отсутствуют у новорожденных и месячных крыс, половозрелых и старых животных доля их невелика - в среднем 2%.
б) Содержание ДНК-синтезирующих тироцитов в фолликулах различного размера. При повторных инънекциях Н-тимидина ДНК синтезируюшж тироциты обнаруживаются в фолликулах всех размерных классов во всех изученных возрастных группах (рис.21). Результаты раздельного определения величины суточного пролиферативного пула (Рс) тироцитов в фолликулах основных размерных классов у крыс в возрасте I, 7 и ЗО мес. обобщены в таблице 6.
У 1-месячных крыс при насыщении организма третированным тимидином на протяжении 24 часов величины Pt в микрофолликулах в 1,7 раза превышали таковые, рассчитанные для средних (В) и в 3.3 раза - для крупных фолликулов (С).
У 7-месячных крыс наибольшую пролиферативную активность также сохраняют мелкие фолликулы: в них значения Рс выше в 3,4 раза, чем в средних (В). в 4,2 раза - чем в крупных (С) и в 2,4 раза - чем в сверхкрупных (О). По сравнению с 1-месячными животными наблюдаемое возрастное снижение общего уровня пролиферативной активности проявилось в наибольшей степени в фолликулах классов В (в 4,3 раза) и С (в 2,8 раза), в то время как в классе микрофолликулов (А) значения Рс снизились не более, чем в 2,2 раза.
У двухлетних животных уровень пролиферативной активности во всех классах выравнивается, достоверных различий между классами Д. в и О не выявляется (р 0.05). Наименьшие значения Рс (в 3-4 раза ниже, чем в мелких и средних) обнаружены в крупных фолликулах (класс С).
При 12-кратных инъекциях изотопа 7-месячным крысам на протяжении 2,5 суток получены сходные результаты (табл. 6). Более высокие значения Рс, по сравнению с таковыми при изучении животных того же возраста после 4 инъекций 3Н-тимидина могут быть объяснены повторным вхождением в митотический цикл части разделившихся тироцитов (рециклирование), что неизбежно приводит к возрастанию числа меченых клеток.
Необходимо подчеркнуть, что уровень пролиферативной активности тироцитов в сверхкрупных фолликулах (D) во всех изученных возрастных группах оказался достаточно высок: не ниже уровня средних (S) фолликулов.
Для оценки вклада фолликулов каждого размерного класса в суммарную пролнферативную активность тиреоидной паренхимы проведены специальные расчеты. В каждой возрастной группе величины Р« определенные для каждого размерного класса фолликулов (табл.6) умножали на относительное содержание (в долях от 1,0) фолликулов данного класса (табл.3). После суммации показателей рассчитывали средневзвешенное значение Рс для тиреоидной паренхимы и относительный вклад в него фолликулов каждого размерного класса1 (рис.22).
Расчеты показывают, что основной вклад в пролиферацию тиреоидной паренхимы вносят мелкие фолликулы (класс А). С возрастом степень их участия постепенно снижается с 85% у новорожденных до 49% у 2-летних животных. Одновременно прогрессивно возрастает пролиферативный потенциал всех средних фолликулов (класс В)- соответственно с 15 до 45%. Вклад крупных и сверхкрупных фолликулов невелик - в сумме он составляет не более 8% у 7-месячных и 5.3% - у 24-месячных крыс.
Средневзвешенные значения Р в возрасте 1, 7 и 24 мес. составили соответственно 3.99; 1,15 и 0.94% (рис.22,а). Эти данные хорошо коррелируют с результатами подсчета митотического индекса тироцитов и свидетельствуют, что в тиреоидной паренхиме крыс на протяжении всей жизни Сохраняется достаточно высокий уровень пролиферативноЙ активности.
в) Пролиферативная активность интерфолликулярного эпителия Величина Рс в интерфолликулярном эпителии свидетельствует (табл.6), что пролиферативная активность в данном компоненте тиреоидной паренхимы у месячных и 7-месячных крыс находится на уровне микрофолликулов класса Д (р 0.05). У старых животных величины Рс значимо не отличаются от показателей, рассчитанных для фолликулов всех изученных классов (р 0,05).
