Введение к работе
Актуальность темы.
Увеличение концентрации свободного цитоплазматического Са2+ -кальциевый сигнал - является важнейшим элементом ответа клетки на внешний стимул, запускающий основные- клеточные реакции, такие как деление, сокращение, секреция [Penner, 1988; Augustine, Neher, 1992]. Источником кальциевого сигнала является как выброс Са2* из внутриклеточных хранилищ, так и его вход через плазматическую мембрану (ПМ). Вход Са2+ из внеклеточной среды обусловлен существованием в ПМ Са2+-проницаемых ионных каналов (ИК), открываемых либо при изменении потенциала на мембране, либо при связывании внешнего химического стимула с мембранным рецептором. В последнем случае, информация о связывании может передаваться с рецептора на ИК напрямую, либо через цепь событий, приводящих к образованию вторичных посредников.
Во многих невозбудимых клетках активация рецепторов, связанных с
метаболизмом фосфатидилинозитола и образованием инозитол (1,4,5)-
трисфосфата (1Рз), вызывает двухфазное увеличение концентрации
свободного цитоплазматического кальция [Benidge, 1984]. Тот факт,
что 1Рз приводит к выбросу Са2+ из дело, хорошо документирован
[Putney, 1987а], в то время, как природа механизма, контролирующего
1Рз-индуцированный вход Са2+, не ясна. Доступные данные
обсуждаются в рамках двух гипотез: 1) инозитол (1,4,5)-трисфосфат
прямо активирует Са2+ каналы в плазматической мембране ("1Рз
модель"), или 2) вход Са2+ запускается неизвестным сигналом,
генерируемым в ответ на опустошение внутриклеточных Са2+ депо
("емкостная модель" - "гипотеза опустошения") [Putney, 1990]. "ІРз
модель" получила прямое подтверждение как в
электрофизиологических [Kuno, Gardner, 1987; Mozhayeva, Naumov, Kuryshev, 1990; Vaca, Kunze, 1995; Kiselyov, Mamin, Semyonova, Mozhayeva, 1997], так и в биохимических [Khan, Steiner, Snyder, 1992a; Khan, Steiner, Klein, Schneider, Snyder, 1992b] исследованиях. Было показано, что инозитол (1,4,5)-трисфосфат-активируемые каналы в плазматической мембране селективны к двухвалентным катионам, не чувствительны к мембранному потенциалу и имеют проводимость 4-30 пСм. С другой стороны, существует целый ряд данных, что опустошение внутриклеточных Са2+ депо ингибиторами микросомальной АТР-азы, инозитол (1,4,5)-трисфосфатом, или инъекцией в клетку высоких концентраций Са2+ буферов приводит к появлению Са2+ проводимости плазматической мембраны многих типов клеток [Hoth, Реплег, 1993; Zweifach & Lewis, 1993; Premack, McDonald, Gardner, 1994; Vaca, Kunze, 1994; Oike, Gericke, Droogmans, Nilius, 1994; Luckho(T& Clapham, 1994] Этот факт рассматривается как прямое подтверждение "гипотезы опустошения". Ранее было показано существование в плазматической мембране клеток А431 рецепторов для таких агонистов, как эпидермальныи
фактор'роста, уридинтрифосфат, брадикинин [Gonzalez, Gross, Heppel, Webb, 1988; Hepler, Nakahata, Lovenberg, DiGuiseppi, Herman, Earp, Harden, 1987]; активация этих рецепторов приводит к образованию икозитол (1,4,5)-трисфосфата и последующему повышению концентрации свободного внутриклеточного кальция. Этот факт делает клетки A43I удобным объектом для выяснения конкретного механизма входа Са2+ в клетку, опосредованного 1Рз.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы состояла в выяснении механизмов, обеспечивающих вход ионов Са2+ через плазматическую мембрану клеток А431 в процессе их активации агонистами, связанными с образованием инозитол (1,4,5)-трисфосфата, и в изучении регуляции этого входа.
Были поставлены следующие задачи:
-
Выяснить возможность прямой активации инозитол (1,4,5)-трисфосфатом входа кальция через Са2*-селективные каналы в плазматической мембране клеток А431.
-
Изучить механизмы регуляции и свойства этих каналов.
-
Определить физиологическую значимость 1Рз-индуцируемого входа кальция.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований впервые показано существование в плазматической мембране клеток А431 высоко селективных Сан ханалов, непосредственно активируемых инозитол (1,4,5)-трисфосфатом. Изучены свойства и выявлен сложный механизм регуляции активности этих каналов мембранным потенциалом, уровнем свободного цитошгазматического кальция; показано вовлечение G-белка в регуляцию активности каналов.
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные в настоящей работе данные представляются важными для выяснения конкретного механизма входа ионов кальция в клетку при ее стимуляции агонистами, связанными с образованием инозитол (1,4,5)-трисфосфата. Установлено, что именно прямое действие 1Рз на Са2+-селективные каналы в плазматической мембране обеспечивает этот вход. Выявленный сложный и физиологически значимый механизм регуляция активности данных каналов существенно обогащает картину кальциевого сигнала и предлагает относиться с большей осторожностью к условиям наблюдения, обнаруживая сложную зависимость результатов от конкретных экспериментальных условий.
Апробация работы
Основные положения работы доложены и обсуждены на: Конференции
Физиологического Общества Великобритании (Лидс, 1996), 41 Съезде
Биофизического Общества США (Новый Орлеан, 1997), отчетной
сессии Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург, 1996) и на
научных семинарах Лаборатории Ионных Каналов Клеточных
Мембран Института цитологии РАН.
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов исследования, изложения экспериментальных
данных, обсуждения результатов, выводов и списка литературы,
содержащего публикаций. Работа изложена на страницах
машинописного текста и иллюстрирована рисунками.
