Введение к работе
Актуальность проблемы. Шизофрения является одной из основных проблем современной психиатрии, имеющей существенное социально-экономическое значение, поскольку ею страдает около 1% популяции (Жариков Н.М., 1972; Тиганов А.С., 1999). По прогнозу ВОЗ, к 2020 г. шизофрения может выйти на пятое место среди болезней, вызывающих потерю трудоспособности.
Несмотря на длительный период изучения шизофрении, в настоящее время
отсутствует единая точка зрения в отношении этиологии и патогенеза этого тяжелого
психического заболевания. К средине прошлого века на основании результатов
качественных нейроморфологических исследований сложились представления о том, что для шизофрении характерна особая «стертая» картина дистрофического процесса с очаговыми выпадениями нейронов коры в сочетании с ареактивностью глии (Александровская М.М., 1939; Снесарев П.Е., 1950; Гиляровский В.А., 1955; Левкович-Соколова А.П., 1958). Современный этап исследований шизофрении характеризуется появлением объективных стереологических методов морфометрических исследований в нейроморфологии, а также внедрением в практику клинических исследований чувствительных методов прижизненной структурной (компьютерная, магнито-резонансная и диффузионно-тензорная томография) и функциональной (позитронно-эмиссионная томография, магнито-резонансная спектроскопия) визуализации мозга. Применение стереологической морфометрии позволило установить, что дефицит нейронов в мозге не является характерной особенностью этого заболевания. Отсутствие астро- и микроглиоза в мозге также рассматривается большинством авторов как свидетельство отсутствия дегенеративного процесса в мозге при шизофрении (Harrison Р., 1999, 2004; Weinberger D., McClure R., 2002). Но что за патологический процесс лежит в основе этого заболевания остается неясным.
В настоящее время на первый план вышла гипотеза, согласно которой в основе патогенеза шизофрении лежат нарушения межнейрональных синаптических связей, определяемые гиперфункцией дофаминергических нейронов среднего мозга (в том числе черной субстанции), а также снижением активности глутамат-зависимого проведения нервных импульсов. Наиболее четко это представлено в концепции A. Carlsson (2000, 2006), который говорит о дисбалансе между активностью ряда структур дофаминергической и глутаматергической нейронных систем мозга на уровне базальных ганглиев мозга.
Синаптическая гипотеза находит косвенные подтверждения в результатах прижизненных и нейроморфологических исследований мозга больных шизофренией. Были
установлены как нарушения микроструктурной организации миелиновых трактов и пучков, связывающих различные отделы мозга пациентов по данным диффузионно-тензорной томографии (Kuroki N. et al., 2006; Nestor P. et al., 2007), так и изменения корреляционных взаимосвязей между активацией ряда структур головного мозга при шизофрении по данным позитронно-эмиссионной томографии и магнито-резонансной спектроскопии (Suzuki М. et al., 2005; Goodrich-Hunsaker N. et al., 2005).
Важным результатом нейроморфологических исследований являются данные об
уменьшении размеров нейронов и/или редукции их дендритного дерева, которое является
основным рецептивным полем нейрона, в различных областях мозга (Kalus P. et al., 2000;
Rosoklija G. et al., 2000). Многие авторы расценивают эти изменения как нарушение
развития мозга (Cotter D., Pariante С, 2002; Arnold S. et al., 2005). Исследования,
проведенные с использованием методов гистохимии, авторадиографии и гибридизации in situ позволили выявить нарушения плотности глутаматергических и дофаминергических аксонов, а также нарушения экспрессии различных синаптических маркеров и связывания рецепторов медиаторов в областях коры и гиппокампе при шизофрении (Benes F., 2000; Lewis D.A., Gonzalez-Burgos G., 2008). Выявленные изменения затрагивают, по крайней мере, три нейротрансмиттерные системы: дофаминергическую, глутаматергическую и ГАМК (у-амино-маслянная кислота) - ергическую, и касаются как внутренних ассоциативных связей, так и путей, связывающих различные структуры мозга. Однако полученные в этом направлении результаты не позволяют заключить, связаны ли выявляемые нарушения с изменениями собственно синаптических контактов.
Большое значение для подтверждения основных положений синаптической гипотезы
имеют исследования ультраструктуры и числа синаптических контактов в указанных
областях мозга. Однако такие исследования немногочисленны и касаются в основном
таких ключевых структур синаптической гипотезы патогенеза шизофрении, как
префронтальная кора и полосатое тело, поэтому многие вопросы остаются нерешенными.
До сих пор не получено подтверждения гиперфункции дофаминергических нейронов
среднего мозга, изначально постулировавшейся синаптической гипотезой
шизофрении. A. Carlsson (2000) выдвинул предположение, что для шизофрении характерно нарушение регуляции активности дофаминергических нейронов, а не их гиперфункция. Последнее нашло подтверждение в данных о качественных изменениях при шизофрении ультраструктуры синапсов в черной субстанции, которая является одним из основных источников дофамина в мозге (Уранова Н.А., Левите О.И., 1987). Для выяснения вопроса, приводят ли эти изменения к нарушениям иннервации именно дофаминергических нейронов необходимо использование иммуноцитохимической идентификации
постсинаптических мишеней измененных аксонных терминалей с количественной оценкой числа соответствующих синапсов.
Что касается глутаматергической составляющей синаптической гипотезы (особенно в
аспекте связи между дофаминергической и глутаматергической системами), в этом
отношении большой интерес представляет гиппокамп, который осуществляет обработку и
интеграцию информации, поступающей от ассоциативных зон коры всех сенсорных
представительств (Vinogradova О., 2004). Имеются как клинические, так и
экспериментальные свидетельства влияния повреждения нейронов гиппокампа на активность дофаминергических нейронов среднего мозга (Csernansky I., Bardgett М., 1998; Lodge D., Grace A., 2007). Показаны также прижизненные нарушения кортико-гиппокампальных взаимодействий при шизофрении (Goodrich-Hunsaker N. et al., 2005; Suzuki M., 2005).
По данным позитронно-эмиссионной томографии дисфункция гиппокампа при шизофрении положительно коррелирует преимущественно с тяжестью позитивной (бред, галлюцинации и т.п.), а не негативной симптоматики (эмоциональная дефицитарность, расстройства мышления и др.) (Tamminga С.A. et al., 1992; Lahti А.С. et al., 2006). Подавление активации гиппокампа связано также с когнитивными расстройствами у пациентов, такими, как нарушения вербальной памяти и внимания, которые авторы связывают с проявлениями психоза (Goldberg Т.Е. et al., 1994; Heckers S. et al., 1998).
По данным магнито-резонансной спектроскопии в основе дисфункции гиппокампа при шизофрении лежат нарушения глутаматергической нейромедиации (Maier М. et al., 2000; Blasi G. et al., 2004). Результаты исследований рецепторов глутамата и синаптических маркеров в аутопсийном мозге указывают на преимущественное поражение поля САЗ гиппокампа (Eastwood S.et al., 1995a,b; Harrison P.. et al., 2003). Гигантские глутаматергические синаптические контакты, образуемые мшистыми волокнами на шипиках пирамидных нейронов поля САЗ, играют ведущую роль в экспрессии когнитивных функций у человека и животных (Kesner R. et al., 2004; Vinogradova О., 2004) и являются важным звеном афферентного пути, осуществляющего кортико гиппокампальные взаимодействия (Замбржицкий И.А., 1972; Vertes R., 2006). Эти синапсы обладают уникальной ультраструктурой и могут быть легко идентифицированы без дополнительных маркеров (Amaral D., Dent J., 1991). Тем не менее, ультраструктура и число синаптических контактов в гиппокампе при шизофрении до настоящего времени практически не изучены.
В рамках вопроса о состоянии межнейрональных синаптических связей при шизофрении большое место занимает патология глиальных клеток и нарушения глио-
нейрональных и глио-глиальных взаимодействий. Это связано с появлением в последние годы целого ряда новых данных. Во-первых, установлено, что глиальные клетки непосредственно участвуют в передаче нервных импульсов, при этом астроциты являются полноценным участником глутаматергической нейромедиации (Ventura R., Harris К., 1999; Haydon P., Carmignoto G., 2006), а олигодендроциты, как известно, образуют миелиновые оболочки аксонов, регулирующие скорость проведения нервных импульсов (Fields D.R., 2005). Во-вторых, астроциты, олигодендроглия и микроглия участвуют в поддержании адекватной цито-, миело и синаптоархитектоники мозга (Cuadros М.А., Navascues, 1998; Streit, 2002). В-третьих, глиальные клетки осуществляют энергетическую и трофическую поддержку нейронов, а также экспрессируют специфические факторы, от которых зависят размеры и архитектура дендритного дерева нейронов (Dai X., et al., 2003; Foster R. et al., 2006). Наконец, микроглия и астроциты являются иммунокомпетентными клетками мозга, они экспрессируют широкий спектр цитокинов и трофических факторов, посредством которых глиальные клетки взаимодействуют между собой, а также с нейронами и их отростками (Lehnardt S. et al., 2002; Sloane J.A., 1999, 2003; Hinman J.D. et al., 2004).
При шизофрении по последним данным речь идет о дисфункции глии. При этом в такой глутаматергической структуре как гиппокамп изменения обнаруживаются наиболее часто и касаются всех видов глиальных клеток. Показаны нарушения экспрессии и активности ферментов обмена глутамата в астроцитах гиппокампа, которые по некоторым данным прогрессируют в течении заболевания (Steffek A. et al., 2006; Bendikov І, 2007). Получены данные о нарушениях при шизофрении экспрессии целого ряда миелин- и олигодендроцит-связанных генов в мозге, при этом гиппокамп является областью с наибольшей выраженностью таких изменений (Dracheva S. et al., 2006). Появление новых маркеров микроглиальных клеток для позитронно-эмиссионной томографии позволило установить, что для шизофрении характерна активация микроглии в мозге (van Berckel et al., 2008), наиболее выраженная в гиппокампе (Doorduin J. et al., 2009).
В связи с этим в настоящее время изменения глии при шизофрении стали привлекать к себе и повышенное внимание нейроморфологов. Особенно это касается олигодендроглии, что связано с многократно показанными в прижизненных исследованиях нарушениями структуры миелинизированных трактов мозга у пациентов. Был установлен дефицит олигодендроцитов в сером и белом веществе ряда областей мозга (Востриков В.М. и др., 2004; Вупе W. et al., 2006), который, по последним данным, характерен и для гиппокампа (Schmitt A. et al., 2009). В префронтальной коре обнаруженный дефицит олигодендроцитов сочетается с выраженными изменениями их ультраструктуры (Uranova N.A. et al., 2001). Но в гиппокампе эти клетки исследованы недостаточно, особенно в плане возможных
изменений аксо-глиальных взаимодействий и структуры миелинизированных аксонов. Интерес к микроглии обусловлен данными об активации этих иммунокомпетентных клеток в мозге пациентов, а также полученными доказательствами важной роли иммунных нарушений в патогенезе шизофрении. Принято считать, что микроглиоз не характерен для шизофрении, однако в последние годы существенно расширились представления о разнообразии морфологических форм микроглии, а также о связи их морфологии с особенностями функционального статуса. Описаны (в том числе в мозге человека) новые морфологические формы активированной микроглии - палочковидные («rod») и круглые, которые характеризуются определенными особенностями взаимодействия с нервными клетками ( Wierzba-Bobrowicz Т., et al., 2004; Xue Q.-S. et al., 2007). Эти новые аспекты реактивности микроглии при шизофрении еще не изучались.
Исследования глии и в особенности межклеточных взаимодействий требуют электронномикроскопического подхода, однако до сих пор имеются только единичные описания изменения ультраструктуры глии. Эти ранние работы, выполненные на небольшом количестве случаев, проводились без использования количественных методов, что лишает их необходимой доказательности (Глезер И.И., Сухорукова Л.И., 1966; Сухорукова Л.И., 1966). Тем не менее, авторы считают, что при шизофрении изменены все типы глиальных клеток и тяжесть этих изменений заметно больше при прогредиентном течении заболевания.
Приведенные данные позволяют выдвинуть в качестве актуальной задачи при
выяснении патогенеза шизофрении исследование на ультраструктурном уровне
особенностей межнейрональных, глио-нейрональных и глио-глиальных взаимодействий в
мозге при этом заболевании. Возможности для решения такой задачи дает
электронномикроскопический метод в сочетании с иммуноцитохимическими и количественными стереологическими подходами, что позволит одновременно идентифицировать синаптические контакты, различные типы глиальных клеток, нейроны и их отростки и комплексно охарактеризовать особенности межклеточных взаимодействий. Учитывая клиническую гетерогенность шизофрении для выяснения роли нарушений межклеточных взаимодействий в формировании патологии мозга при шизофрении необходимо проведение клинико-морфологического анализа.
Цель исследования. Выявить изменения ультраструктуры и числа межнейрональных синаптических связей в структурах дофаминергической (черная субстанция) и глутаматергической (гиппокамп) систем мозга, а также изучить особенности глио-нейрональных и глио-глиальных взаимоотношений в гиппокампе при шизофрении и
оценить возможную связь изменений межклеточных взаимодействий с клиническими особенностями шизофрении. Задачи исследования.
1. Изучить качественные и количественные характеристики ультраструктуры, а также
число синаптических контактов на дендритах тирозингидроксилаза - иммунопозитивных
дофаминергических нейронов черной субстанции в норме и при шизофрении.
2. Провести качественное и количественное исследование ультраструктуры
синаптических контактов между аксонами гранулярных нейронов зубчатой фасции и
шипиками пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа и определить их численную
плотность в норме и при шизофрении.
3. Провести качественное исследование ультраструктуры олигодендроцитов, а также
качественное и количественное исследование ультраструктуры миелинизированных
аксонов в поле САЗ гиппокампа в норме и при шизофрении.
4. Определить качественные и количественные характеристики ультраструктуры
астро- и микроглии и оценить их объемную фракцию и численную плотность в поле САЗ
гиппокампа в норме и при шизофрении.
5. Провести анализ возможных взаимосвязей между изменениями ультраструктурных
морфометрических параметров миелинизированных аксонов и глиальных клеток в поле
САЗ гиппокампа при шизофрении.
6. Провести сопоставление выявленных изменений межнейрональных, глио-
нейрональных и глио-глиальных взаимодействий с клиническими особенностями
шизофрении по показателям длительности болезни, возраста пациентов к периоду начала
заболевания, типа течения заболевания и преобладанию позитивной или негативной
симптоматики шизофрении к моменту смерти.
Научная новизна. В настоящей работе впервые описаны изменения ультраструктуры синаптических контактов и снижение их числа на дендритах иммуноцитохимически идентифицированных дофаминергических нейронов черной субстанции в мозге больных шизофренией, свидетельствующие о нарушении афферентной регуляции активности этих нейронов.
Получены новые данные о снижении численной плотности гигантских глутаматергических синаптических контактов между аксонами гранулярных нейронов зубчатой фасции и гигантскими шипиками пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа. Показано, что характер изменений ультраструктуры этих синаптических контактов связан с преобладанием позитивной или негативной симптоматики шизофрении: снижение
размеров шипиков наблюдалось только в случаях шизофрении с преобладанием позитивной симптоматики заболевания.
Получены новые данные о дистрофических и деструктивных изменениях ультраструктуры олигодендроцитов в сочетании с нарушением аксо-глиальных взаимодействий и атрофией части миелинизированных аксонов пирамидном слое гиппокампа при шизофрении.
Впервые в мозге человека в норме и при шизофрении на ультраструктурном уровне описан весь спектр известных на сегодняшний день морфологических форм микроглиальных клеток: рамифицированная, амебоидная, круглая и палочковидная микроглия. Установлено, что при шизофрении происходит сдвиг в количественном составе популяции микроглиальных клеток в сторону преобладания либо амебоидной, либо палочковидной микроглии, и этот сдвиг тесно связан с возрастом манифестации психоза. При ранней манифестации психоза преобладали микроглиальные клетки амебоидного типа, при начале заболевания в зрелом возрасте - палочковидная микроглия.
Впервые обнаружена тесная связь выраженности атрофии миелинизированных аксонов и патологии олигодендроглии с преобладанием определенных морфологических форм микроглии при шизофрении: для случаев шизофрении с преобладанием палочковидной микроглии характерна большая выраженность изменений ультраструктуры олигодендроцитов и достоверное повышение численной плотности атрофичных миелинизированных аксонов.
Впервые выявлены прогрессирующие с течением заболевания дефицит митохондрий и накопление липофусцина в астроцитах гиппокампа при шизофрении. Показано увеличение численной плотности и объемной фракции перинейрональных астроцитов пирамидном слое гиппокампа при шизофрении.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленные в работе нарушения ультраструктуры и дефицит синаптических контактов, образованных на дендритах дофаминергических нейронов черной субстанции, являются морфологическим подтверждением существующей гипотезы о том, что нарушения дофаминергической нейромедиации в мозге при шизофрении связаны с нарушением регуляции активности нейронов дофаминовой системы мозга. В клинических исследованиях показана тесная связь между дисфункцией дофаминовых нейронов черной субстанции, нарушениями мотивационного обучения и проявлениями психоза у пациентов.
Теоретическая значимость данных о дефиците синаптических контактов между мшистыми волокнами зубчатой фасции и шипиками пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа при шизофрении определяется тем, что эти синапсы играют важную роль в
экспрессии гиппокамп-зависимых когнитивных функций и являются существенным звеном афферентного пути, ответственного за кортико-гиппокампальные связи, нарушения которых при шизофрении легли в основу одной из существующих теорий психоза.
Теоретическое значение имеют данные, обосновывающие существенное значение изменений межклеточных глио-нейрональных и глио-глиальных взаимодействий в нарушениях межнейрональных связей при шизофрении. При шизофрении патология олигодендроглии сочеталась с нарушением аксо-глиальных взаимодействий и атрофией части миелинизированных аксонов. Гетерогенность в распределении морфологических форм микроглии при шизофрении проявлялась как преобладание либо амебоидной, либо палочковидной микроглии, при этом только с преобладанием последней связано достоверное увеличение численной плотности атрофичных миелинизированных аксонов и большая выраженность изменений олигодендроглии. Снижение численной плотности глутаматергических синаптических контактов в гиппокампе сочеталось с прогрессирующим в течение болезни дефицитом митохондрий и накоплением липофусцина в астроцитах, непосредственно участвующих в глутаматергической нейромедиации. Увеличение численной плотности и объемной фракции перинейрональных (но не свободных) астроцитов можно расценивать как проявление компенсаторных процессов в гиппокампе при шизофрении, направленных на поддержание функционирования нейрона.
Учитывая клиническую гетерогенность шизофрении, важным результатом исследования является обнаружение связи особенностей выявленных нарушений межклеточных взаимодействий с клиническими характеристиками заболевания: снижение размеров постсинаптических шипиков на дендритах пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа найдено только в случаях шизофрении с преобладанием позитивных психотических симптомов; преобладание амебоидных или палочковидных микроглиальных клеток и связанная с ним выраженность патологии олигодендроглии и миелинизированных аксонов зависели от возраста манифестации психоза; дефицит митохондрий и накопление липофусцина в астроцитах нарастали в процессе заболевания. Вывяленные клинико-морфологические корреляции являются существенным вкладом в развитие патогенетических представлений, и в дальнейшем могут послужить основой для выработки новых, патогенетически обоснованных терапевтических подходов к лечению заболевания.
Предложенный автором комплексный подход к оценке патологии мозга путем исследования межклеточных взаимодействий с использованием современных стереологических методов морфометрии, иммуноцитохимии и статистических методов для анализа ультраструктуры ткани мозга на достаточно больших площадях срезов, сравнимых с используемыми при светооптических количественных исследованиях (метод оптического
диссектора), был внедрен в практику лаборатории клинической нейроморфологии Научного центра психического здоровья РАМН и может быть применен при изучении ткани мозга в экспериментальных и клинико-анатомических исследованиях.
Апробация работы. Основное содержание работы отражено в 24 научных публикациях, в том числе в 11 статьях. Из них в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК России, опубликовано 10 статей (5 в отечественных и 5 в зарубежных журналах).
Материалы диссертации были доложены и обсуждены на объединенной межлабораторной конференции НЦПЗ РАМН 29 сентября 2009 года, протокол № 4.
Основные положения работы доложены и обсуждены на 9-ом Всемирном конгрессе по биологической психиатрии (Париж, Франция, 2009), 2-й Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008), на Российской конференции «Взаимодействие науки и практики в современной психиатрии» (Москва, 2007), на 8-ом Всемирном конгрессе по биологической психиатрии (Вена, Австрия, 2005), на 13-й Российской конференции по нейроиммунологии (Санкт-Петербург, 2004), на 10-ом зимнем рабочем совещании по шизофрении (Давос, Швейцария, 2000), на 29-ом ежегодном заседании общества нейронаук США (Майами Бич, США, 1999), на 17-й Российской конференции по электронной микроскопии (Москва, Черноголовка, 1998), на международном конгрессе по шизофрении (Колорадо Спрингс, США, 1997), на 8-ом зимнем рабочем совещании по шизофрении (Кранс-Монтана, Швейцария, 1996).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на русском языке, состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста, включая 52 рисунка и 5 таблиц. Библиография включает 44 наименования работ отечественных и 562 зарубежных авторов.
