Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1.Окислительный стресс. Механизмы развития окислительного стресса 10
1.1.1. Кислород и активные кислородные метаболиты 10
1.1.2. Радикальные окислительные процессы 12
1.1.3. Характеристика основных форм активных кислородных метаболитов 13
1.2. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов і J
1.2.1. Ферментативные антиоксиданты 17
1.2.2. Неферментативные антиоксиданты 20
1.3. Биологическая роль активных кислородных метаболитов 23
1.3.1. Физиологическое значение свободнорадикального окисления 23
1.3.2. Значение перекисного окисления липидов в механизмах реализации стрессовых воздействий 25
1.3.3. Влияние свободных радикалов на структуру и функцию органов желудочно-кишечного тракта 26
1.3.4. Влияние свободных радикалов на структуру и функцию тканей опорно-двигательного аппарата 28
2. Материал и методика исследований.. 31
3. Результаты исследований 46
3.1. Сравнительный анализ функционального состояния системы антиоксидантной защиты и активности свободнора дикального окисления в сыворотке крови и гомогенатах тканей поросят
3.1.1. Сравнительный анализ активности свободнорадикального окисления и функционального состояния системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят в условиях экстенсивной и интенсивной технологий содержания 46
3.1.2. Функциональное состояние системы антиоксидантной защиты и свободнорадикального окисления в сыворотке крови и гомогенатов тканей тонкой и толстой кишки поросят в условиях интенсивной технологии содержания и применения антиоксиданта тиофана
3.2. Особенности распределения некоторых макро- и микроэлементов у свиней в условиях промышленной технологии содержания и применения антиоксиданта тиофана 55
3.3. Влияние антиоксиданта тиофана на морфофункциональное состояние тонкого кишечника свиньи в условиях окислительного стресса 60
3.4. Влияние антиоксиданта тиофана на морфофункциональное состояние толстого кишечника свиньи в условиях окислительного стресса 65
3.5. Морфофункциональная характеристика костной ткани тела позвонка свиньи в условиях окислительного стресса и использования антиоксиданта тиофана 69
Обсуждение 75
Выводы 95
Предложения 97
Библиографический список 98
Приложения 10,
- Кислород и активные кислородные метаболиты
- Физиологическое значение свободнорадикального окисления
- Сравнительный анализ активности свободнорадикального окисления и функционального состояния системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят в условиях экстенсивной и интенсивной технологий содержания
- Влияние антиоксиданта тиофана на морфофункциональное состояние тонкого кишечника свиньи в условиях окислительного стресса
Введение к работе
Актуальность исследований. Использование промышленной технологии животноводства характеризуется повышением производительности труда в связи с активным внедрением механизации и автоматизации производственных процессов. Однако несоответствие отдельных звеньев технологии приводит к нарушению функционирования сформировавшихся в процессе эволюции основных физиологических систем организма животных. Это обуславливает развитие хронического стресса и его вредных последствий, и в итоге становится одним из основных сдерживающих факторов повышения эффективности животноводства [21,25,50, 93,106].
Вследствие избыточной секреции надпочечниками глюкокортикоидов и ка-техоламинов при стрессе возникает комплекс физиологических и биохимических реакций, сопровождающихся избыточной генерацией активных кислородных метаболитов и, как следствие, повышением спонтанного перекисного окисления липидов с образованием их конечных, высокотоксичных продуктов: малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, гидроперекисей [64,77, 82].
По данным литературы, чрезмерное образование свободных радикалов имеет цепной характер [210] и определяется как окислительный стресс [5]. Цито-токсические продукты свободнорадикального окисления, вступая в реакции со структурными компонентами клетки, а также межклеточного вещества, изменяют физические и биологические свойства мембран, разобщают окислительное фосфорилирование, нарушают работу встроенных в мембрану ионных насосов и каналов [16, 18, 66, 108, 178]. Это приводит к нарушению структуры и функции, а в конечном итоге к гибели клетки [42]. Поскольку механизм свободнорадикального повреждения имеет универсальный характер, то воздействию подвергаются клетки всех тканей и органов.
Наиболее чувствительными к повреждающему эффекту окислительного стресса оказываются органы, содержащие в своей структуре избыточное количество субстрата для свободнорадикального окисления. Одним из них является кость, представляющая собой вместилище не только для красного, но и желтого костного мозга.
Согласно существующему представлению о единстве структуры и функции, повреждение костной ткани свободными радикалами должно найти свое отражение в изменении минерального обмена, что практически не представлено в публикациях отечественных и зарубежных авторов. Поскольку органы желудочно-кишечного тракта являются основным местом поступления микроэлементов в организм, а липидные мембраны энтероцитов могут вовлекаться в свободнорадикальное окисление, кость и кишечник могут рассматриваться в качестве органов-мишеней при окислительном стрессе [43, 81, 92, 166, 167]. Принимая во внимание, что микроэлементы входят в состав активных центров ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы [252], обеспечивающих свободнорадикальную защиту, а также, в силу физиологических особенностей, высокую чувствительность свиньи к недостатку минеральных веществ [6], изучение влияния окислительного стресса на состояние минерального обмена и транспорт макро- и микроэлементов в желудочно-кишечном тракте, а также морфофункциональное состояние органов ЖКТ и костной ткани представляется актуальным.
Цель исследования: дать морфофункциональную оценку и определить возможность коррекции окислительного стресса у свиней в условиях промышленной технологии с использованием антиоксиданта тиофана. Задачи исследования:
1. Провести сравнительный анализ показателей свободнорадикального окисления и активности системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят при экстенсивной и интенсивной технологиях содержания.
2. Определить показатели свободнорадикального окисления и активность системы антиоксидантной защиты в тканях слизистой оболочки кишечника поросят в условиях промышленного комплекса и влияния на них антиоксиданта тиофана.
3. Изучить распределение некоторых макро- и микроэлементов в слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника, а также в костной ткани поросят в условиях окислительного стресса и при применении антиоксиданта тиофана.
4. Представить сравнительную морфофункциональную характеристику слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, а также костной ткани • тела позвонка поросят при окислительном стрессе и использовании антиоксиданта тиофана. Научная новизна. Впервые исследовано влияние антиоксиданта тиофана на показатели свободнорадикального окисления и состояние системы антиокси-дантной защиты в сыворотке крови поросят в условиях экстенсивной и интенсивной технологий содержания.
Установлен свободнорадикальный механизм поражения клеток и межклеточного вещества слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, а также костной ткани поросят в условиях интенсивной технологии содержания.
Доказано, что при окислительном стрессе структурно-функциональные нарушения клеток и межклеточного вещества слизистой оболочки кишечника обусловлены депрессией ферментативного и неферментативного звеньев анти-оксидантной защиты вследствие нарушения транспорта микроэлементов, входящих в состав их активных центров.
Впервые показано, что использование антиоксиданта тиофана в условиях окислительного стресса снижает содержание продуктов свободнорадикального окисления в сыворотке крови, тканях слизистой оболочки тонкого, толстого кишечника поросят и корректирует показатели минерального обмена.
Практическая значимость. Определены параметры, характеризующие состояние окислительного стресса у поросят в условиях промышленной технологии содержания.
Предложен метод коррекции последствий окислительного стресса антиоксидантом тиофаном.
Результаты исследований используются в учебном процессе при преподавании дисциплин «Физиология» и «Биология свиньи» студентам Биолого-технологического института НГАУ. Основные положения, выносимые на защиту:
1. У поросят в условиях промышленной технологии развивается общий окислительный стресс, о чем свидетельствуют повышенное содержание продуктов СРО и снижение активности системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови.
2. Повышенный уровень содержания диеновых конъюгатов (ЦК), малонового диальдегида (МДА) в тканях тонкого, толстого кишечника поросят и снижение активности системы антиоксидантной защиты - супероксид-дисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и восстановленного глутатиона (ВГ) в условиях промышленного комплекса является проявлением окислительного стресса и корректируется антиоксидантом тиофаном.
3. В условиях промышленного комплекса нарушение распределения макро-и микроэлементов в слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника, а также костной ткани поросят является следствием окислительного стресса и корректируется антиоксидантом тиофаном.
4. Структурно-функциональные нарушения клеток и межклеточного вещества костной ткани, слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, обусловленные окислительным стрессом, корректируются антиоксидантом тиофаном.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы животноводства: наука, производство и образование» (Новосибирск, 2006), II Международной научно-практической конференции «Аграрная наука сельскому хозяйству» (Барнаул, 2007), V Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития АПК в России» (Красноярск, 2007); Международной научно-практической конференции «Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК»» (Москва, 2007), XIV Меж дународной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирский государственный университет, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ,, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследований, реізультатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками и содержит 15 таблиц. Список литературы включает 258 источников, в том числе 144 на иностранном языке.
Кислород и активные кислородные метаболиты
Существование живых организмов на Земле (кроме небольшого числа бактерий - облигатных анаэробов) невозможно без кислорода, являющегося неотъемлемым компонентом метаболических процессов [120, 245] и около 90 % потребляемого молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования. Вместе с тем во всех живых организмах кислород постоянно вовлекается в различные реакции с образованием в терминальной стадии активированных кислородных метаболитов (АКМ): Of, 02, Н202, НО , ОСГ, RXV и др. Многие из этих соединений являются радикалами, имеющими неспаренный электрон, и обозначаются как свободные радикалы [151].
Применительно к биологическим системам понятия «свободные радикалы» и «АКМ» не совпадают. Неспаренный электрон может быть локализован на атомах углерода, серы, азота; и для живых организмов важное значение имеют тиильные радикалы глутатиона (GS") или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах S и N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогало-гениты не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы. Чтобы объединить данные соединения в одну группу с радикалами, вводят понятие «активные формы кислорода» или «активные метаболиты кислорода», которым обозначают ферментативные продукты активации кислорода [17]. В биологическом плане наиболее удачно понятие «активированные кислородные метаболиты» (АКМ), под которым подразумевается широкий класс кислородных соединений радикальной и нерадикальной природы [66].
АКМ инициируют реакции свободнорадикального окисления (СРО, в том числе перекисное окисление липидов - ПОЛ), приводящие к химической модификации и разрушению биомолекул. Избыточная продукция АКМ и (или) нарушение нормального функционирования систем антиоксидантной защиты вызывают усиленное окислительное повреждение биомолекул, что приводит к развитию дисфункции клеток и тканей организма, что определяется как окислительный стресс (ОС) [5,66, 77, 82].
Следует отметить, что прочно закрепилось мнение о том, что генерация АКМ является не эволюционной ошибкой, а напротив, - характерным физиологическим процессом, результатом эволюционного отбора [123]. Свободноради-кальные реакции, по-видимому, лежали в основе зарождения жизни на планете и эволюционировали вместе с изменением содержания молекулярного кислорода [66].
В настоящее время отмечается возросший интерес к АКМ со стороны биохимиков и биофизиков, физиологов, патофизиологов, иммунологов. В этой связи опубликовано большое количество обзорных работ, в которых подробно рассмотрены химические свойства СЬ и его элементоорганических форм [85, 165, 186], роль АКМ в поражении тканей, органов, клеток и молекул [124, 183, 248], в потенцировании повреждающего действия ксенобиотиков [234]; поражении, вызванном ишемией/реперфузией [10]; в .реализации функций фагоцитов [137, 204] и лимфоцитов [258]; при воспалительных процессах [138,173], бактериальных и вирусных инфекциях [63,198], диабете [59,219], склерозе [13], ревматических заболеваниях [55], кардиомиопатиях, нефропа-тиях [57], ретинопатиях [197], катаракте [128], онтогенезе и клеточной пролиферации [141], канцерогенезе [91, 121, 251], атерогенезе [238], при старении и развитии возрастных патологий [121], физических нагрузках [235]. Кроме того, установлено, что во многих организмах различных таксономических групп - от бактерий и до млекопитающих, включая человека, АКМ участвуют в регуляции экспрессии больших групп генов, контролируемых регуляторными элементами SoxR, SoxS, OxyR, NF-кВ, АР-1, Sp-1, c-Myb, p53 и других [38, 39, 143, 150]. 1.1.2. Радикальные окислительные процессы
Молекулярный кислород активно взаимодействует с органическими радикалами, имеющими неспаренный электрон, при этом константа скорости присоединения 02 к радикалам слабо зависит от природы окисляемого субстрата и определяется преимущественно только диффузией. Таким образом, в физиологических условиях существования многих аэробных организмов молекулярный кислород является эффективным трансформатором органических радикалов, в результате чего время жизни и концентрация липидных радикалов в клетках очень малы. Высокая агрессивность молекулярного кислорода в отношении органических радикалов лежит в основе развития цепных процессов свободнора-дикального окисления [33, 91].
Свободнорадикальное окисление липидов наблюдается во всех тканях аэробных организмов, главным образом в мембранах и липопротеиновых структурах, и является вырожденно-разветвленным цепным процессом. На сегодняшний день теория и кинетические параметры развития процессов пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) в разных экспериментальных системах хорошо разработаны и изучены. Весь процесс ПОЛ делят на стадии: зарождение цепей, развитие цепных реакций и их разветвление, обрыв цепей [9].
Образующиеся в процессе окисления свободные радикалы могут реком-бинировать с образованием неактивных молекулярных продуктов, однако в реальных условиях в биологических системах в силу низкой концентрации свободных радикалов вероятность протекания таких реакций крайне мала, и свободные радикалы со значительно большей скоростью взаимодействуют с молекулами субстрата или с ингибиторами, которые всегда присутствуют в клетках и межклеточных средах. В организмах млекопитающих ингибиторами или антиоксидантами выступает широкий спектр соединений различной химической природы: витамины Е, К, С, коэнзим Q, мочевая кислота, каротиноиды и др. [18]. При взаимодействии с данными соединениями образуются неактивные радикалы, не способные участвовать в продолжении цепи окисления [66].
Физиологическое значение свободнорадикального окисления
До середины 90-х годов прошлого тысячелетия АКМ рассматривались преимущественно как цитотоксические деструктивные молекулы. С развитием новых междисциплинарных направлений в биологии в последнее десятилетие отношение к ним изменилось, и они стали рассматриваться, как регуляторные соединения [189, 214]. В физиологических условиях свободнорадикальное окисление протекает на крайне низком уровне, что исключает накопление его конечных токсических продуктов (свободных радикалов жирных кислот, липоперекисей, альдегидов, кетонов, оксикислот) в концентрациях, опасных для жизнедеятельности организма. Считается, что существует вполне определенный стационарный уровень реакций СРО. Установлено, что он является тканеспецифическим и для активно метаболизирующих тканей характерен более высокий уровень СРО [82]. С его физиологическими эффектами связана ведущая роль АКМ в индукции апоптоза, регуляции клеточной энергетики и пролиферации [154, 253].
Супероксидный радикал кислорода является необходимым компонентом системы микросомального окисления - активации ферментов супероксигеназ. Установлено, что О г активируют фактор транскрипции NF-кВ, который регулирует экспрессию генов, кодирующих ряд цитокинов [192, 225].
Перекись водорода уже не рассматривается в качестве исключительно токсической и деструктивной молекулы. Установлено, что в живых системах она проявляет свойства физиологического регулятора, наряду с оксидом азота Н2О2 служит важным стимулятором вазодилятации. Показано, что под действием сдвигового напряжения повышается синтез эндотелиоцитами НгСЬ (предположительно, мембрансвязанными ферментами), что приводит к открытию кальций-зависимых калиевых каналов гладкомышечных клеток сосудов, их гиперполяризации и релаксации. Такой механизм может играть важную роль в поддержании кровоснабжения миокарда при постишемической реперфузии, когда уровень N0" снижен. В концентрации 10" М перекись водорода усиливает пролиферацию фибробластов в культуре [47], а в концентрации около 2 мМ может модулировать секреторную активность кишечника. В индукции синтеза белков теплового шока, повышающих резистентность клеток к высоким температурам, радиации, токсическому действию ионов тяжёлых металлов и лекарственных препаратов, основная роль отводится также перекиси водорода [129, 237]. Регуляторная роль Н2О2, но не 0{ и ОН , показана также для синтеза меланина в коже. Действие ультрафиолетового света на меланоциты приводит к образованию в них Н2О2, которая, в свою очередь, усиливает в клетках активность тирозиназы, отвечающей за начальную стадию превращения тирозина в меланин. Повышенный уровень образования меланина необходим для защиты клеток кожи от фотоиндуцированного повреждения [19]. Установлено, что пере киси, образующиеся в результате неферментативного окисления, выступают в роли неспецифических регуляторов фаго- и пиноцитоза, регулируют проницаемость мембран лизосом [130].
Физиологический эффект гидроксйльного радикала обусловлен его регу-ляторными свойствами в отношении активации тромбоцитов, индуцируя их агрегацию и продукцию ими тромбоксана Аг.Установлено, что ОН-радикалу отводится ведущая роль в индукции апоптоза, регуляции клеточной энергетики.
Таким образом, свободнорадикальное окисление непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов и при определенной интенсивности является одним из типов нормальных метаболических процессов, обеспечивает поддержание гомеостаза [82]. Однако многие вопросы регулятор-ной функции АКМ, их взаимодействия с антиоксидантами, а также их отношение к физиологическим и патофизиологическим состояниям сегодня все еще остаются спорными [66].
Кортико-висцеральный генез многих заболеваний имеет в своей основе нарушение адаптационного синдрома с развитием неврозоподобных расстройств. В то же время дисбаланс показателей ПОЛ и АО-систем в настоящее время рассматривается как нейрохимические корреляты дезадаптации [24]. Установлено, что хронические стрессовые ситуации сопровождаются обязательной активацией ПОЛ [25, 44, 64, 65]. По мнению Ф.З.Меерсона (1981), звено "стресс - инициация ПОЛ—повреждение" является важным звеном в патогенезе многих заболеваний. Эти данные подтверждаются непременным возрастанием свободнорадикальных процессов в головном мозге при экспериментальном стрессе, особенно в стадии тревоги и истощения [88, 89] и "развитием АО-недостаточности" [2].
Свободнорадикальные механизмы в развитии церебральной патологии уже признаны неоспоримыми [29, 170, 171] в связи с их ключевой ролью в ги перреактивности и гибели нейронов [84] из-за изменения условий функционирования рецепторных комплексов. Это не может не отражаться на качестве си-наптической передачи, поскольку определяющим фактором при передаче сигнала в синапсе является именно структурно-функциональная организация синаптических мембран [113].
Установлено, что у высших животных реакции неферментативного ПОЛ составляют обязательный компонент стресса, ответственный за многие повреждения тканей [44, 69]. У животных при различных видах стресса (акустическом, эмоционально-болевом, физическом и др.) активируется СРО и накапливаются продукты ПОЛ в различных органах [65, 98, 110]. Считается, что главной причиной активации ПОЛ при стрессе является выброс в кровоток катехо-ламинов [14, 65]. В эксперименте на лабораторных животных доказано, что их введение активирует процессы ПОЛ, ингибирует СОД и повреждает клетки различных тканей [37]. При этом одним из ключевых механизмов является нарушение метаболизма кальция и повреждение мембран клеток, накоплению продуктов ПОЛ, ведущих к нарушению окислительного фосфорилирования и проницаемости мембранных органелл [15,17,26,44].
Участие свободных радикалов в развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта активно обсуждается в литературе [35, 36, 74, 107]. Считается доказанной их ключевая роль в воспалительных заболеваниях толстой кишки [7, 12], печени [56, 61], при некоторых заболеваниях поджелудочной железы [139] и возникновении гастродуоденальных язв [657, 61].
Повреждение эпителиальных клеток желудка и кишечника свободными радикалами у собак установлено при ишемии D.A.Parks и соавт. (1983). Автор считает, что наиболее значительные поражения происходят на уровне пи-лорической зоны - зоны желудка с максимальной концентрацией ксанти ноксидазы [174] и корректируется предварительным применением ловушек свободных радикалов [146]. Агрессия свободных радикалов по отношению к СОЖ объясняется обширной лейкоцитарной инфильтрацией [146] и повышенной генерацией ими свободных радикалов, а также макрофагами [155].
Морфологическим проявлением ишемии кишечника является массивная постнекротическая десквамация эпителия, особенно в области верхушек кишечных ворсинок, дезинтеграция lamina propria с появлением геморрагии и зон изъязвлений. Результатом этих изменений является нарушение барьерной функции слизистой оболочке и кишечной абсорбции. Доказано, что в генезе этих нарушений свободные радикалы играют важную роль [81]. Считается, что в развитии язвенной болезни желудка ведущая роль принадлежит развивающемуся дисбалансу процессов ПОЛ и антиоксидантной защиты [26, 100].
В физиологических условиях действие свободных радикалов на СОЖ сдерживается слизью, покрывающей желудочные клетки. Следует отметить, что важная роль отводится гликопротеинам слизи и глутатионпероксидаза, содержащаяся в больших количествах в клетках СОЖ человека, участвует в ее цитопротекции [72]. Однако защитная способность слизи может быть преодолена при высокой концентрации свободных радикалов в желудке [140]. В присутствии свободных радикалов реологические свойства слизи быстро меняются. Помимо того, установлено, что у больных язвой желудка отмечается снижение активности указанного фермента. Это рассматривается в качестве одной из причин злокачественной трансформации язв [156].
Сравнительный анализ активности свободнорадикального окисления и функционального состояния системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят в условиях экстенсивной и интенсивной технологий содержания
Опираясь на данные литературных источников о том, что в условиях промышленного содержания животные испытывают влияние различных стрессовых факторов [21, 25, 50, 93, 106], а также на сведения о повышении уровня свободнорадикального окисления (СРО) при стрессе [65, 97, 99], мы предприняли исследование сыворотки крови поросят, находившихся в условиях фермерского хозяйства и промышленного комплекса ОАО «Кудряшовское», на содержание продуктов свободнорадикального окисления (МДА и ДК) и активность ферментов антиоксидантной защиты.
В таблицах 2, 3 отражены интегральные показатели содержания продуктов СРО и активности ферментов антиоксидантной системы в сыворотке крови поросят фермерского хозяйства и свинокомплекса. Анализ данных показывает, что в первые сутки наблюдения уровень диеновых конъюгатов в сыворотке крови поросят контрольной группы свинокомплекса ОАО «Кудряшовское» в 1,8 раз превышает аналогичный показатель поросят фермерского хозяйства. Содержание МДА в сыворотке крови на 57,14 % статистически достоверно превышает соответствующий показатель в сыворотке крови поросят фермерского хозяйства. Результаты биохимического анализа (табл. 3) сыворотки крови поросят промышленного комплекса ОАО «Кудряшовское»; свидетельствует о снижении уровня активности ферментативного звена антиоксидантной системы по сравнению с поросятами фермерского хозяйства. Установлено, что активность СОД на 15,97 % снижена относительно аналогичного показателя поросят, находившихся в условиях фермы. Исследования показали; что уровень активности КАТ на 37,23 % ниже, по сравнению с активностью соответствующего фермента поросят фермерского хозяйства. Превышение содержания продуктов свободнора-дикального окисления и депрессия ферментов антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят на промышленном комплексе являются доказательством развития окислительного стресса.
Для исключения влияния географических, климатических и возрастных факторов на показатели СРО и активности ферментов антиоксидантной системы был проведен анализ этих показателей в динамике эксперимента отдельно по каждому из хозяйств (табл. 2,3).
Установлено, что у поросят всех групп, находившихся в условиях фермерского хозяйства, показатели МДА и ДК, а также активность ферментов антиоксидантной системы не имеют достоверных различий в течение всего периода наблюдения, начиная с первых и до последних суток эксперимента. Из этого следует, что у поросят в условиях фермерского хозяйства развитие окислительного стресса не обнаружено. Не обнаружены также возрастные изменения этих показателей (табл.2).
Анализ результатов исследования, приведенных в таблице 3, показывает, что в сыворотке крови поросят контрольной группы, находившихся в условиях промышленного свинокомплекса, с 1 по 21 сутки наблюдения отмечается увеличение содержания основных продуктов свободнорадикального окисления. Установлено, что уровень ДКк21 суткам эксперимента возрастает на 52,72 %.
Содержание МДА в сыворотке крови поросят контрольной группы также достоверно увеличивается. Его концентрация на 45,45 % превышает соответствующий показатель первых суток наблюдения.
В сыворотке крови поросят контрольной группы, не получавших антиоксидант тиофан, отмечается подавление активности исследуемого ферментативного звена антиоксидантной защиты. В частности, уровень активности СОД к концу наблюдаемого периода уменьшился на 40,02 %. Показатель активности каталазы относительно первых суток наблюдения статистически достоверно снизился более чем на 40 %. Увеличение продуктов СРО и снижение активности ферментативного звена антиоксидантной системы в сыворотке крови поросят контрольной группы является свидетельством развития окислительного стресса.
На 21-е сутки эксперимента в сыворотке крови поросят первой опытной группы промышленного свинокомплекса «Кудряшовский», которые получали антиоксидант тиофан, уровень продуктов СРО был статистически достоверно ниже, по сравнению с первыми сутками эксперимента.
Содержание ДК с 1-х по 21-е сутки наблюдения снизилось на 41,84 %, МДА - на 32,35 % соответственно (табл.3). Вместе с тем, активность ферментов антиоксидантной защиты статистически достоверно возрастало на протяжении всего периода наблюдения. Установлено, что уровень активности СОД с 1-х по 21-е сутки эксперимента увеличился на 37,46 %, а КАТ на 35,32 %.
В сыворотке крови поросят второй опытной группы (получали только масло), с 1-х по 21-е сутки наблюдения уровень ДК увеличился на 59,12 %, а МДА - на 90,63 %. Исследование активности системы антиоксидантной защиты показало, что уровень активности СОД с 1 по 21 сутки наблюдаемого периода уменьшился на 36,91%, а КАТ на 17,79%. Результаты проведенных исследований показали, что, во-первых, в условиях интенсивной технологии содержания у поросят развивается окислительный стресс. Во-вторых, повышенное содержание продуктов СРО и депрессия фер ментативного звена антиоксидантной системы у поросят контрольной и второй опытной групп в течение исследуемого периода не является возрастной особенностью. В-третьих, применение антиоксиданта тиофана приводит к снижению показателей СРО и повышению активности системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят первой опытной группы. Однако, данное исследование не дает возможности оценить локальное проявление окислительного стресса в тканях органов ЖКТ.
Влияние антиоксиданта тиофана на морфофункциональное состояние тонкого кишечника свиньи в условиях окислительного стресса
У поросят контрольной группы складки слизистой оболочки образуют короткие ворсины, преимущественно листовидной формы (рис. 1 А). Ядро клеток крупное, округлой или овальной формы, содержит большое количество эухроматина и, как правило, располагается в центре клетки. Цитоплазма неравномерно окрашивается гематоксилином, что проявляется в усилении реакции на периферии клетки. Типичным признаком является присутствие клеток с признаками пикноза ядра и плазморексиса цитоплазмы, а также клеток, в цитоплазме которых определяются многочисленные оптически прозрачные вакуоли различного размера. В цитоплазме клеток выявляются единичные бледно окрашенные реактивом Шиффа гранулы. Интенсивность их окрашивания незначительно понижается после предварительного ферменто-лиза контрольных срезов в растворе амилазы.
На апикальной поверхности эпителиоцитов щеточная каемка слабо выражена, неравномерно окрашивается альциановым синим (рис. 2 А) и реактивом Шиффа. Среди клеток эпителия встречаются единичные бокаловидные экзокри-ноциты. Морфологически они представлены крупными клетками, округлой формы, цитоплазма которых бледно окрашивается альциановым синим (рис. 2 А) и реактивом Шиффа (рис. 5 В). Интенсивность ШИК-реакции незначительно понижается после ферментативной обработки срезов в растворе амилазы. Базальная мембрана эпителия находится в состоянии отека и характеризуется субпороговой реакцией на кислые ГАГ и гликопротеиды. При постановке реакции по Маллори, коллагеновые волокна окрашиваются неравномерно: определяются локальные участки интенсивно, либо бледно или не воспринимающие краситель. В собственной пластинке кровеносные сосуды расширены, полнокровны. Межклеточное вещество в состоянии отека (рис. 1 В), бледно окрашивается реактивом Шиффа и альциановым синим.
Структура эпителия крипт характеризуется высокой степенью неоднородности. Наряду с колоноцитами, которые имеют крупное ядро с преимущественным содержанием эухроматина, присутствуют клетки с признаками деструкции: их цитоплазма неравномерно окрашивается гематоксилином, содержит мелкие и крупные оптически прозрачные вакуоли (рис. 2 В).
Бокаловидные клетки в эпителии крипт мелкие, овальной формы. При окрашивании альциановым синим содержат неравномерно окрашенное в интенсивные оттенки голубого цвета бесструктурное вещество. При окрашивании реактивом Шиффа клетки характеризуются умеренной ШИК-позитивной реакцией.
В подслизистой основе определяется отек межклеточного вещества. Кровеносные сосуды расширены, заполнены клетками крови. В капиллярах типичным признаком является сладж-феномен эритроцитов.
У поросят первой опытной группы, получавших антиоксидант тиофан, ворсины тонкого отдела кишечника статистически достоверно на 39,2 % превышают высоту ворсин, по сравнению с соответствующими образцами поросят первой опытной группы (табл. 10). В отличие от препаратов поросят контрольной группы, ворсины имеют отчетливо выраженные ундуляции. В структуре эпителия преобладают эпителиоциты, которые имеют призматическую форму. Крупное ядро овальной формы расположено на базальном полюсе клетки и содержит большое количество эухроматина. Цитоплазма характеризуется гомогенным умеренно базофильным окрашиванием (рис. 3 А). В составе эпителия встречаются единичные клетки с признаками пикноза ядра и плазморексиса цитоплазмы.
При постановке реакции на суммарные кислые ГАГ в цитоплазме определяются многочисленные мелкие, диффузно расположенные альцианпо-зитивные гранулы. В отличие от препаратов поросят контрольной группы, в области апикальной поверхности клетки отчетливо заметна базофильно окрашенная щеточная каемка, которая проявляет резко положительную гистохимическую реакцию с альциановым синим (рис. 4 А) и реактивом Шиффа (рис. 5 А). Интенсивность ШИК-реакции не изменяется после обработки срезов в растворе амилазы.
По сравнению с препаратами контрольной группы, бокаловидные эк-зокриноциты представлены крупными клетками овальной формы. При реакции на суммарные кислые ГАГ их цитоплазма полностью заполнена интенсивно окрашенным альциан-позитивным веществом. В отличие от соответствующих образцов тонкого кишечника поросят контрольной группы базальная мембрана эпителия четко выражена и имеет вид тонкой, равномерно окрашенной альциановым синим и реактивом Шиффа структуры.
Межклеточное вещество собственной пластинки и подслизистой основы в отличие от соответствующих образцов поросят контрольной группы гомогенно окрашивается реактивом Шиффа и альциановым синим. Интенсивность реакции незначительно усиливается по периферии кровеносных сосудов, которые располагаются параллельно продольной оси кишечной ворсины и имеют четкие контуры.
Данные морфометрического анализа свидетельствуют, что площадь собственной пластинки в препаратах тонкого кишечника животных первой опытной группы достоверно превышает, а количество клеток эпителия не имеет статистически достоверных различий с соответствующими показателями поросят контрольной группы (табл. 10).
Результаты морфометрического анализа свидетельствует, что глубина залегания крипт на 43,23 % статистически достоверно превосходит данный показатель поросят контрольной группы (табл.10). Эпителиоциты цилиндрической формы с обильной, умеренно базофильной цитоплазмой. Ядро овальной формы, содержит большое количество эухроматина и располагаются на базальном полюсе клетки (рис. 6 А). Характерным признаком является отсутствие клеток с признаками деструкции.
