Введение к работе
Актуальность проблемы. Вопросы взаимосвязи структуры и функции митохондрий постоянно находятся в центре внимания широкого круга исследователей. В последние годы произошли и происходят революционные события в митохондриологии. В традиционные представления о роли митохондрий в клетке внесены существенные коррективы. Ещё сравнительно недавно наши представления о митохондриях сводились только как к энергетическим станциям клетки, где роль митохондрий в развитии патологии ограничивалась нарушением энергообеспечения, и исключительно с этих позиций рассматривались все ультраструктурные преобразования митохондрий, в то время как многие ультраструктурные состояния митохондрий невозможно объяснить в свете таких представлений. В настоящее время основным компонентом в развитии многих патологий считается окислительный стресс. Термин «окислительный стресс» не имеет на сегодня чёткого определения, он используется для широкого круга разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих как повышенную внутриклеточную генерацию активных форм кислорода (АФК), так и окислительное повреждение клетки. Как известно, ткань миокарда является одним из активных потребителей кислорода. Снижение уровня кислорода - гипоксия вызывает значительные нарушения структуры и функции миокарда. Наиболее чувствительными к гипоксии структурами клетки являются митохондрии, поэтому большой интерес представляет изучение состояния митохондрий в этих условиях. Кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации приводит не только к нарушению энергетики клетки, но и резко изменяет скорость генерации АФК митохондриями. Не смотря на огромное количество работ и неослабевающий интерес, на протяжении всего времени изучения ультраструктуры митохондрий, к состоянию этих органелл в условиях гипоксии, нехватка фактических данных пока ещё не позволяет составить полное представление о действии гипоксии на состояние митохондрий и прежде всего в ткани миокарда, где повреждающее действие гипоксии имеет место при многих патологиях миокарда.
Цель работы состояла в изучении морфофункциональных характеристик митохондрий кардиомиоцитов при длительном действии гипоксии. Был применен специальный экспериментальный подход: исследование проводили на кусочках изолированного миокарда, инкубированных при 20 С в условиях длительной гипоксии начиная с 6 ч и далее через каждые 12 ч, в течение 3-х суток. Были поставлены следующие задачи исследования:
1. Исследовать особенности ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов
изолированных кусочков миокарда после 72 ч инкубации в условиях гипоксии;
2. Исследовать динамику изменений ультраструктуры митохондрий
кардиомиоцитов изолированных кусочков миокарда в течение 72 ч инкубации
ткани в условиях гипоксии, начиная с 6 часов и далее через каждые 12 часов;
3. Изучить функциональные особенности митохондрий кардиомиоцитов
изолированных кусочков миокарда после 72 ч гипоксии на изолированных
митохондриях, а так же непосредственно in situ методом электронно-
микроскопической гистохимии на выявление функциональной активности
цитохром с-оксидазы.
Научная новизна. Определены основные ультраструктурные признаки ткани миокарда на модели изолированных кусочков ткани миокарда в условиях безкислородной среды, при которых сохраняется нативность ультраструктуры кардиомиоцитов и дыхательная активность митохондрий в течение 3-х суток. Впервые описана динамика возникновения популяции мелких электронно-плотных митохондрий, располагающихся внутри митохондрий основной популяции -«митохондрий внутри митохондрий». Впервые исследованы особенности специфических для условий гипоксии перестроек внутренней мембраны митохондрий кардиомиоцитов: геометрически упорядоченных ячеистых структур. Показано, что эти структурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны изменяют свою морфологию при добавлении в среду инкубации АДФ, а также полностью исчезают при выделении митохондрий по общепринятой методике в 0,25 М сахарозе. Изучены функциональные изменения системы окислительного фосфорилирования митохондрий во времени при глубокой длительной гипоксии кардиомиоцитов. Впервые удалось получить кластеры митохондрий, объединенные межмитохондриальными контактами во фракциях. Показана функциональная активность цитохром с-оксидазы в мелких, электронно-плотных митохондриях при полном или частичном отсутствии таковой в митохондриях основной популяции. Впервые обнаружена поразительная стабильность и получена функциональная характеристика межмитохондриальных контактов при гистохимическом исследовании экспериментальной ткани на цитохром с - оксидазную активность.
Практическая ценность работы. Предложенная в настоящей работе экспериментальная система исследования действия гипоксии может использоваться для изучения механизмов нарушения тканей сердца при тяжёлых поражениях миокарда. Установленные в работе закономерности изменений
структуры митохондриального аппарата кардиомицитов также могут быть использованы при изучении и интерпретации ультраструктуры митохондрий при действии гипоксии в различных исследованиях клеток и тканей. Полученные данные углубляют фундаментальные знания о действии гипоксии на ультраструктуру митохондриального аппарата.
Апробация работы. Материалы работы были представлены: на II Всероссийской конференции «Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики (митохондриальная патология)», (Москва, 2002), Международной конференции "Митохондрии в патологии" (Пущино, 2003), 1-й Съезд Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), FEBS Congress (Варшава,2004), III Съезде биофизиков России (Воронеж 2004), Международной конференции "Митохондрии в патологии" (Пущино, 2005), XXI Российской
конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006), 14 European Bioenergetics Conference ЕВЕС, Moscow State University (Moscow, 2006), International Small-Angle Scattering Workshop is devoted to Yu. M. Ostanevich, (Dubna,2006), Первой Всероссийской школе-семинаре (Современные достижения бионаноскопии) физ-фак МГУ (Москва, 2007), Sixth National Conference on Application of X-ray, Synchrotron Radiation, Neutrons and Electrons for Material Characterization, (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Список литературы". Работа изложена на 103 страницах, включает 47 рисунков, список литературы содержит 220 ссылок.
