Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1.1. Стресс у микроорганизмов 9
глава 1.2.гипо-игипероксия 11
гипероксия (окислительный стресс) 11
гипоксия 20
Глава 13. Осмотический стресс Галостресс 23
Глава 1.4. Температурный стресс (тепловой шок/гипертермия, холодовой шок/
гипотермия) 30
Глава 1.5. Множественное стрессорное воздействие, перекрёстно-адаптивное
(антагонистическое) взаимодействие неродственных видов СТРЕССОРНЫХ
воздействий 40
Глава 1.6. заключение по обзору литературы 53
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 55
Глава 2.1. Объекты и методы исследования 55
Объекты 55
МЕТОДЫ культивирования и анализа 55
Методы статистики 58
Глава 2.2, Идентификация исследованных микроорганизмов 61
Идентификация Candida lipolytica и Rhodotorula aurantiaca б 1
Идентификация Malassezia sp. 63
АДАПТАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ К СОЧЕТАННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ
ГИПОКСИИ И ОСМОТИЧЕСКОГО СТРЕССА 67
Глава 3.1. Параметры роста 67
Candida lipolytica 68
Rhodotorula aurantiaca 71
Malassezia sp. 74
Candida rhagii 76
Debaryomyceshansenii 78
3.1.6. Заключение по разделу 3.1 80
Глава 3.2. Дыхание 85
Candida lipolytica 86
rhodotorula aurantiaca 89
Malassezia sp. 91
Candida rhagii 93
Debaryomyces hansenii 95
Заключение по разделу 3.2 97 Глава 3.3. Активность каталазы 102
Candida lipolytica 103
rhodotorula aurantiaca 105
Malassezia sp. 107
Candida rhagii 109
Debaryomyces hansenii 111
Заключение по разделу 3.3 113 ГЛАВА3.4. Свободные внутриклеточные аминокислоты 117 глава 3.5. Отношение Candida lipolytica kNaCloth росте на разных средах 120 Глава 3.6. Физиологические особенности дрожжей Malassezia sp. 122 Глава 3.7. Rhodococcus erythropolis 125
ЗАКЛЮЧЕНИЕ „__„__^_^_ 128
ВЫВОДЫ 134
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Ш
Введение к работе
Актуальность темы. Естественная среда обитания (микро)организмов характеризуется совокупностью множества физических, химических и биологических факторов. Не вызывает сомнений, что естественные места обитания не всегда являются оптимальными для роста и размножения организмов, т. е. в природе на микроорганизмы часто действует хотя бы один фактор, который можно охарактеризовать как стрессорный (стрессовый). Изучение жизни микроорганизмов в условиях неблагоприятных воздействий является важной задачей микробиологии и издавна привлекало исследователей [Кашнер, 1981]. На сегодняшний день основным подходом в изучении стрессорных воздействий остается исследование действия какого-либо одного стрессора на рост и метаболизм бактериальной или дрожжевой монокультуры. Такой принцип исследования важен и оправдывает себя простотой постановки экспериментов и интерпретации полученных данных. Имеется множество работ, посвященных изучению воздействия на микроорганизмы одиночных стрессорных факторов и механизмов адаптации к ним [Кашнер, 1981; Гусев и Минеева, 1992]. Наиболее изученными являются такие стрессоры, как гипертермия [Тэнси и Брок, 1981, Hottiger et al., 1987; Collinson and Dawes, 1992; Mutoh et al., 1995; Mojica et al., 1997; Kilstrap et al., 1997; Macario et al., 1999], неоптимальные концентрации NaCI [Larsen, 1962; Brown and Simpson, 1972; Shindler, 1976; Lukas et al., 1990; Van Zyl et al., 1990; Galinski and Truper, 1994], факторы, вызывающие окислительный стресс [Fridovich, 1975; Wilkins et al., 1978; Гаенко с соавт., 1985; Imlay et al., 1988; Jamieson, 1995; Tran et al., 1993].
Однако, как показывают работы последних лет, это лишь одна сторона проблемы. В естественных условиях обитания микроорганизмы испытывают сочетанное воздействие нескольких стрессоров. Например,
микроорганизмы, обитающие в экосистемах средней полосы,
сталкиваются с суточными и сезонными колебаниями температуры,
влажности, солнечной радиации, солёности и пр. Показано значительное
отличие ответной реакции и состояния микробной клетки от таковых
при монострессе. Для принципиально разных стрессоров обнаружено,
что предварительное воздействие (часто в сублетальных дозах) одного
стрессора повышает устойчивость клеток к воздействию другого. Это
явление получило название преадаптации [Flahaut et al., 1996, 1997;
Lorca and de Valdez, 1999; Schmidt and Zink, 2000; Gouesbet et al., 2001;
Periago et al., 2002a, 2002b]. В условиях одновременного воздействия
нескольких стрес сорных факторов между ними может возникать
антагонизм, снижающий вредные последствия. Такое явление обычно
называют перекрёстной адаптацией/защитой,
кроссадаптаццей/защитой или антагонизмом стрессорных факторов [Leblanc et al., 2000; Nanasombat, 2001; Park Sang-Ho et al., 2001; Kim Woojin et al., 2001]. При этом может происходить увеличение степени толерантности к определенному стрессору (стрессорам), иногда перерастание толерантности в зависимость ("-фильность"). Явление перекрестной адаптации на сегодняшний день изучено недостаточно. Сейчас только происходит накопление данных о сочетанном воздействии стрессорое. Наибольшее внимание уделяется таким сочетаниям, как гипертермия и неоптимальные концентрации NaCl [Кунтиков и Горленко, 1998; Leblanc et al., 2000; Periago et al., 2002a, 2002b], углеродное голодание, гипертермия и осмотические стрессоры [Мссаші, 1993; Murata, 1999; Herbert and Foster, 2001], осмотические стрессоры и Н202 [Hartke et al., 1995; Browne and Dowds, 2001], воздействие ультрафиолетового излучения и углеродное голодание [Srinivasan and Kjelleberg, 2001] и др. Изучение же механизмов адаптации к совместному действию стрессоров находится в начальной стадии.
Весьма распространенным сочетанием стрессорных факторов в естественных условиях обитания микроорганизмов является высокое осмотическое давление (в частности, избыток NaCl) и недостаток кислорода. Примерами экосистем, характеризующихся высоким содержанием NaCl и низким парциальным давлением кислорода, могут служить пластовые воды нефтяных месторождений, почвы мангровых лесов, морские донные экосистемы и др. Кроме того, подобные же условия могут возникать при очистке загрязненных почв или сточных вод с высокой соленостью. Сочетанное воздействие гипоксии и гиперосмотических условий на микроорганизмы практически не изучено, по крайней мере, нам не удалось обнаружить таких работ. Исследования в этом направлении проводились только в лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН [Арзуманян с соавт., 2000], которые и послужили отправной точкой для данной диссертации.
Таким образом, очевидна актуальность изучения влияния гипоксии и повышенных концентраций NaCl на микроорганизмы, выделенные из различных экосистем, а также актуальность изучения механизмов адаптации к такому воздействию.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение параметров роста и жизнедеятельности эукариотных и прокариотных микроорганизмов в условиях повышенных концентраций NaCl и гипоксии.
Задачи исследования:
Идентификация неколлекционных штаммов микроорганизмов, исследованных в данной работе.
Изучение одновременного влияния на рост микроорганизмов повышенного содержания NaCl и низкого содержания кислорода в среде.
Изучение дыхания микроорганизмов при высоком содержании NaCl и низком содержании кислорода в среде.
Изучение влияния комбинированного действия NaCl и гипоксии на каталазу микроорганизмов, как один из белков общего стрессорного ответа.
Изучение состава внутриклеточных аминокислот у микроорганизмов в условиях гипоксии и гиперосмотического стресса.
Научная новизна. Впервые проведено исследование сочетай ного действия высоких концентраций хлорида натрия и низкого парциального давления кислорода на эукариотные и прокариотные микроорганизмы.
Проведено изучение роста, дыхания, активности катал азы и состава внутриклеточных аминокислот в этих условиях. Впервые показано усиление гало фил ьных/галотолерантных свойств для Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii и Rhodococcus erythropolis в микроаэробных гиперсолёных условиях. Показано, что при росте на богатых средах микроорганизмы (на примере Candida lipolytica) значительно лучше адаптируются к стрессорным условиям, чем при росте на синтетических, даже содержащих осмопротекторы (глицерин).
Впервые обнаружено, что в микроаэробных гиперсолёных условиях происходит усиление дыхания микроорганизмов, клетки которых изначально находились в стрессорных условиях (для всех видов). При этом гипоксия нивелирует действие высокой концентрации соли, т.е. проявляет антагонистический эффект. Для неадаптированных клеток показано подавление дыхания.
Впервые показано, что микроаэробных гиперсолёных условиях, наблюдается значительное усиление активность каталазы для культур изначально находившихся в стрессорных условиях (для Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii и Debaryomyces hansenii). Для неадаптированных клеток обнаружен обратный эффект.
Впервые показано, что при сочетанном действии высокого содержания NaCl в среде и низкого парциального давления кислорода, происходит заметное увеличение внутриклеточного пула большинства аминокислот.
Впервые экспериментально показана осмопротекторная роль внешней липидной оболочки для дрожжей рода Malassezia..
Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют представление о поведении микроорганизмов в сложных стрессорных условиях и о механизмах защиты от сочетанного действия гипоксии и осмостресса. Результаты работы позволят дать рекомендации по более эффективному применению микроорганизмов в системах биологической очистки в экстремальных условиях; по методам антимикробной обработки материалов, используемых в разных сферах жизнедеятельности человека, а также пищевых продуктов.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Школе - конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 21st International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)". (Lviv, Ukraine. August 2001), 1-й Съезде микологов России (Москва, 2002), XV Международной зимней молодёжной научной школе (Москва, 10-14 февраля 2003), 1-й Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" (Budapest, Hungary. 26 - 29 August. 2003), 2-ой Московский Международный Конгресс "БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития" Москва, Россия. 10-14 Ноября 2003.
Публикации По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 9 печатных работ, из них 2 полнотекстовых статьи и 7 тезисов.
Объём и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 157 страницах и включают 2 фотографии, 27 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Объекты и методы исследования" и "Результаты и обсуждения"), "Заключение", "Выводы" и "Список литературы", который содержит 82 работы отечественных и 116 зарубежных авторов.
