Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Проблема морфологической оценки при диагностике сердечного трансплантата 12
1.2 Микроскопическое строение сердечной мышцы 13
1.3 Энергетический метаболизм миокарда 15
1.4 Ишемическое повреждение миокарда 17
1.4.1 Модели ишемии миокарда in vivo 17
1.4.2 Механизмы ишемического повреждения кардиомиоцитов
донорского сердца 19
1.4.3 Патологическая анатомия инфаркта миокарда 21
1.4.4 Метаболические нарушения при ишемии миокарда 23
1.5 Применение лазерного излучения в медицине 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1 Объекты исследования 39
2.2 Моделирование состояния донорского сердца перед трансплантацией 40
2.3 Гистоморфометрическое исследование
2.3.1 Исследование жизнеспособности миокарда свиньи 40
2.3.2 Исследование жизнеспособности миокарда крыс 42
2.4 Исследование интенсивности лазерно-индуцированной флюоресценции миокарда изолированного сердца 48
2.4.1 Регистрация спектров методом сканирования 48
2.4.2 Многоканальная система регистрации спектров 51
2.4.3 Измерение глубины проникновения лазерного излучения в миокард 53
2.5 Статистические методы исследования
ГЛАВА 3. Исследование динамики жизнеспособности миокарда свиньи в процессе сохранения 56
ГЛАВА 4. Исследование динамики жизнеспособности миокарда крысы в процессе сохранения 61
4.1 Исследование динамики структурных изменений миокарда изолированного сердца в процессе сохранения 61
4.2 Оценка деградации ядерного материала в процессе сохранения миокарда изолированного сердца 68
4.3 Динамика содержания ионов кальция в миокарде изолированного сердца в процессе сохранения 70
4.4 Динамика перекисного окисления липидов в миокарде изолированного сердца в ходе сохранения 73
4.5 Динамика содержания функционально активных митохондрий ткани в процессе сохранения миокарда изолированного сердца 75
4.6 Исследование состояния энергетического метаболизма миокарда изолированного сердца в процессе сохранения 79
4.7 Влияние острой ишемии на реакции специализированного и рабочего миокарда изолированного сердца 83
ГЛАВА 5. Исследование динамики интенсивности лазерно-индуцированнои флюоресценции миокарда изолированного сердца 88
5.1 Влияние лазерного излучения на миокард 88
5.2 Исследование глубины проникновения лазерного излучения в ткань миокарда 90
5.3 Исследование динамики жизнеспособности миокарда изолированного сердца свиньи с помощью лазерного излучения
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов исследования 103
выводы 113
Список литературы
- Энергетический метаболизм миокарда
- Исследование интенсивности лазерно-индуцированной флюоресценции миокарда изолированного сердца
- Динамика содержания ионов кальция в миокарде изолированного сердца в процессе сохранения
- Исследование динамики жизнеспособности миокарда изолированного сердца свиньи с помощью лазерного излучения
Энергетический метаболизм миокарда
Ткань миокарда построена из тесно связанных между собой ветвящихся и анастомозирующих волокон, составленных из отдельных мышечных клеток. Боковые поверхности этих клеток покрыты базальной мембраной, в которую вплетены тонкие ретикулярные и коллагеновые волокна. Между мышечными волокнами миокарда располагаются прослойки рыхлой соединительной ткани, сосуды и нервы [179].
Волокнам сердечной мышцы свойственна такая же поперечная исчерченность, как и у скелетных мышц, и, кроме того, в них на сравнительно небольших расстояниях друг от друга видны одиночные темноокрашивающиеся полосы, шире Z-линий, - вставочные диски. Как показало электронно-микроскопическое исследование, вставочные диски соответствуют границам клеток сердечной мышцы [247]. Таким образом, сердечная мышца состоит из отдельных клеток, прочно соединенных конец в конец, образуя единую клеточную сеть. Смежные клетки очень часто соединены между собой нерегулярным образом, и между волокнами сердечной мышцы образуются множественные анастомозы. Отдельные клетки волокон сердечной мышцы, как правило, имеют одно, иногда два ядра. Ядра крупнее и светлее, чем в скелетных мышечных волокнах, они обычно лежат ближе к центральной оси волокна. Хотя сердечная мышца поперечнополосатая, она может сокращаться, даже без какой-либо иннервации [179].
Кроме сократительных клеток, в состав миокарда входят особого рода мышечные клетки - специализированные проводящие сердечные миоциты, предназначенные больше для проведения импульса по волокну, чем для сокращения. Они содержат немного сократительных филаментов и способны формировать и проводить импульсы к сократительным клеткам миокарда [134]. Проводящие клетки активно представлены в синусно-предсердном узле, центральную часть которого занимают клетки-водители ритма (пейсмекерные клетки). Это узел первого порядка, задающий сердечный ритм. В большом количестве проводящие миоциты встречаются в предсердно-желудочковом узле, проводящем возбуждение от предсердно-желудочкового узла к предсердно-желудочковому пучку Гиса и далее к волокнам Пуркинье. Волокна Пуркинье проводят импульс к сократительным кардиомиоцитам [240].
Ультраструктурно, волокно сердечной мышцы состоит в основном из миофибрилл, между которыми находится саркоплазма с огромным множеством митохондрий. Миофибриллы сердечной мышцы объединены многочисленными анастомозами в одну непрерывную сеть. Саркомеры -сегменты миофибриллярных структур, состоят из частично перекрывающих друг друга сократительных филаментов - актина и миозина. При сокращении происходит синхронное укорочение саркомеров путем скольжения филаментов актина между филаментами миозина по направлению к центру каждого саркомера [160]. Кардиомиоциты богаты митохондриями, что отражает значительную потребность в энергии. В саркоплазме между митохондриями часто встречаются гранулы гликогена. Митохондрии и гликоген вместе с мешочками Гольджи и липидными капельками бывают сосредоточены в саркоплазме у полюсов ядра, там же часто встречаются отложения липохромного пигмента липофусцина, особенно в более позднем возрасте [136].
Вставочные диски, как уже говорилось ранее, представляют собой области контакта между концами смежных клеток, где сцеплены друг с другом многочисленные складки их мембран, скрепленные также особого рода соединительными комплексами. Во всех вставочных дисках, ступенчатых или линейных, имеются более мелкие сосочковые выступы, которые входят в углубления соответствующих размеров. По-видимому, и крупные, и мелкие выступы такого рода необходимы для того, чтобы обеспечить достаточное сцепление между концами соседних клеток, иначе многократные сокращения могли бы, в конце концов, оторвать одну клетку от другой. Вставочные диски состоят из продольных и поперечных участков. В поперечных участках встречаются межклеточные соединения двух типов: соединения типа fascia adhaerens - это подобие десмосом, эти контакты обеспечивают особенно прочное соединение клеток; и щелевые контакты — по-видимому, позволяющие импульсам, вызывающим сокращение, быстро переходить от одной клетки на другую [238].
Саркоплазматический ретикулум в клетках сердечной мышцы менее развит, чем в скелетных мышцах, и не образует больших терминальных цистерн. Он представлен нерегулярной системой узких трубчатых цистерн, окружающих каждую мио фибриллу. Т-трубочки кардиомиоцитов входят внутрь на уровне Z-пластинок, поэтому здесь число уровней соответствует числу саркомеров в миофибрилле. Т-трубочки в два с лишним раза шире, чем в скелетных волокнах, и, кроме того, отличаются тем, что выстланы базальной пластинкой - прямым продолжением базальной пластинки, лежащей снаружи от сарколеммы. Типичная картина триад отсутствует, так как цистерны саркоплазматического ретикулума, соприкасающиеся с Т-трубочками, невелики и не образуют полных колец вокруг миофибрилл. Как полагают, Т-трубочки проводят двигательные импульсы в глубину клетки, что облегчает одновременное сокращение всех миофибрилл [135].
Исследование интенсивности лазерно-индуцированной флюоресценции миокарда изолированного сердца
Во время исследований динамики интенсивности лазерно-индуцированной флюоресценции миокарда в процессе сохранения, параллельно проводились исследования тканей с помощью флюоресцирующих красителей, которые дают информацию о процессах, происходящих в ткани во время сохранения. В каждой серии измерений одновременно с ЛИФ измерениями проводили множественные биопсии ткани.
Исследование жизнеспособности миокарда свиньи Сердце свиньи помещалось в холодный физиологический раствор при +4С. В серии из 8 сердец свиньи одновременно с измерениями ЛИФ проводились множественные биопсии левого желудочка, по 4 фрагмента через 15 минут, 2 часа, 4 часа и 48 часов после изъятия сердца. Далее биоптаты замораживали в жидком азоте и изготавливали криостатные срезы 7 мкм с их витальным окрашиванием фрагментов. Затем срезы трижды отмывались в фосфатном буфере рН=7,4 по 5 минут и фиксировались в 4% нейтральном формалине. Далее препараты обезвоживались в батарее спиртов и ксилолов и заключались в полистерол. Срезы флюориметрировались на компьютеризированном ультрафиолетовом микроскопе на базе ЛЮМАМ-1И с последующей статистической обработкой — вычислением среднего значения интенсивности флюоресценции и ошибки среднего. При всех измерениях использовался кварцевый иммерсионный объектив х 60, измерение люминесценции проводилось на двух стеклах с изучением 140 «точек» на диафрагме 0,1. Появление «вуали» над диафрагмой при флюориметрии из расчетов исключалось. "Hoechst 33342", краситель, который связывается с нуклеиновыми кислотами, применяется для исследования ДНК клеток [123]. Срезы окрашивались в фосфатном буфере рН=7,4 содержащем 5,0 10 б г/л красителя "Hoechst 33342", 30 минут при +25С и далее фиксировались, проводились и заключались (см. выше). После чего проводилась флюориметрия гистологических препаратов (поглощение 347 нм, испускание 487 нм).
Флюорохром метиленовый синий использовался для изучения динамики окислительно-восстановительных процессов в клетке [94]. Срезы окрашивались в фосфатном буфере рН=7,4 содержащем 0,15 г/л метиленового синего, 5 минут при +25С и далее фиксировались, проводились и заключались (см. выше). После чего проводилась флюориметрия гистологических препаратов (поглощение 520 нм, испускание 605 нм).
Исследование жизнеспособности миокарда крыс Эксперимент проводился на 130 самцах белых беспородных крыс. В условиях экспериментальной операционной под эфирным наркозом проводилась декапитация животных. Сердце наркотизированной крысы извлекалось путем левосторонней торакотомии. При этом после вскрытия перикарда производилось выделение магистральных сосудов, наложение зажимов с последующим лигированием обеих полых вен, аорты, легочного ствола и легочных вен и выполнялось изъятие сердца.
Для гистологической оценки изолированные сердца помещалось в холодный физиологический раствор при +4С. Через 5, 30, 60,120, 240 минут (5 этапов) забирались биоптаты из левых желудочков сердца каждой крысы. Время забора выбиралось экспериментально: проводилась серия экспериментов с определением времени, в течение которого наблюдались морфологические изменения в ткани. Биоптаты замораживались в жидком азоте, на криостатном микротоме (MICROM НМ 550) выполняли резку образцов на срезы различной толщиной, в зависимости от метода окраски. Полученные срезы ткани миокарда окрашивали как с помощью ряда флюоресцирующих красителей и по методикам гистохимического выявления сукцинатдегидрогеназной и НАДН-диафоразной активности, так и с изготовлением парафиновых срезов и окраской по стандартной методике гематоксилин - эозином по Майеру (миокард сердца 10 животных).
Проводилась флюориметрия гистологических препаратов с использованием микроскопа Axioskop 40FL и камеры AxioCamHRc. При комнатной температуре +26С, выполнялись компьютерные изображения по 30 с каждого гистологического препарата, на котором обычно монтировалось по 8 срезов миокарда. Объектив Zeiss Plan-Neofluar х40. Полученные изображения обрабатывались с помощью программного обеспечения AxioVision 3.1 (Karl Zeiss). Все полученные цифровые данные обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента на специализированной компьютерной статистической программе Origin 7.0 и Excel Microsoft Office ХР Pro .
Динамика содержания ионов кальция в миокарде изолированного сердца в процессе сохранения
С целью минимизации влияния излучения на ткань необходима установка, в которой весь спектр регистрировался бы за один импульс, и при этом реализовывалась высокая чувствительность. Данным условиям удовлетворяет спектрометр с многоканальной регистрирующей системой (рис.2.2).
Общая схема аналогична описанной ранее, только вместо системы монохроматор-ФЭУ был использован спектрометр на основе электронно оптического преобразователя (ЭОП) и ПЗС камеры. На элементах 1-5 собран спектрограф с голографической дифракционной решеткой, с дисперсией 16 нм/мм, работающий в диапазоне 300-650 нм. Входная щель спектрографа устанавливалась 0.05 мм, что обеспечивало разрешающую способность порядка 1нм. На входе спектрографа также ставился фильтр БС-3. Его назначение - отсечь рассеянное лазерное излучение 248 нм, которое во втором порядке перекрывается с излучением на длине волны 496 нм. На выходе спектрографа устанавливался электронно-оптический преобразователь 6 с областью спектральной чувствительности 300-900 нм и коэффициентом усиления на длине волны 555 нм - 104, временем послесвечения порядка 1 мс.
Изображение с люминофора ЭОП с помощью зеркал 7 регистрировалось ПЗС камерой и предавалось в компьютер. Сферическое зеркало 1 располагалось так, чтобы входная щель спектрометра оказалась в ее фокусе. Таким образом, оптическая система была настроена на бесконечность и сигнал, соответственно, усреднялся по всей поверхности образца. В совокупности с высокой чувствительностью прибора данная реализация измерительной системы позволила в 10 раз снизить плотность энергии облучения образца до 1 мДж/см . Это также способствует снижению влияния излучения на ткань.
Измерение глубины проникновения лазерного излучения в миокард Для интерпретации спектров ЛИФ чрезвычайно важно знать глубину проникновения возбуждающего лазерного излучения в исследуемую ткань. Исследования проводились на миокарде свиньи. Для определения линейного коэффициента поглощения была использована установка изображенная на рис.2.3. Излучение лазера 1 (KrF или N2) с помощью полупрозрачного зеркала 4 подавалось на опорный фотодиод 8 и образец 5. Интенсивность прошедшего через образец излучения регистрировалось фотодиодом 7. Фильтром 3 излучение ослаблялось до уровня, необходимого работы диодов в линейном режиме. Фильтром 6 обеспечивалось, чтобы на фотодиод 7 попадало только излучение на длине волны лазера, то есть отсекалась флуоресценция образца. Поскольку у каждого из образцов индивидуальная форма поверхности, чтобы минимизировать влияние разнородности коэффициента отражения у разных образцов, образец зажимался между двумя кварцевыми предметными стеклами. Сигналы с фотодиодов регистрировались на цифровом осциллографе 9. Образцы необходимой толщины нарезались на замораживающем микротоме. Строился график зависимости отношения сигналов измерительного и опорного фотодиодов от толщины образца. Показатель построенной методом наименьших квадратов экспоненты принимался за глубину проникновения излучения.
Гистофлюоресцентное исследование миокарда изолированного сердца (рис.3.2, 3.3) дает информацию о процессах, происходящих в ткани во время сохранения, о степени деградации ткани.
Динамика флюоресценции хлортетрациклинового красителя (рис.3.2) показывала резкое снижение содержания суммарных ионов Са2+ миокарда (рис.3.1). Последующий рост суммарного Са наблюдался через 48 часов сохранения.
Динамика интенсивности флюоресценции различных флюоресцентных зондов в ткани миокарда в процессе сохранения в физиологическом растворе при +4С. Визуализация внутриклеточного и полного кальция осуществляется флюоресцентным зондом хлортетрациклином, тканевое дыхание - метиленовым синим.
Одномоментно с этим, изменения внутриклеточного кальция имели обратную динамику. При оценке особенностей повреждения ядерного материала (ДНК) с использованием зондов (рис.3.4), между парами оснований двуцепочечных нуклеиновых кислот (Hoechst 33342, Этидиум бромид), наблюдается резкий рост флюоресценции в течение первых двух часов (рис. 3.3). Максимальный уровень флюоресценции зондов достигается через 5 часов от забора образца. Последующее снижение интенсивности флюоресценции, скорее всего, связано с потерей ядерного материала в процессе деградации миокарда изолированного сердца.
Рис. 3.4 Миокард свиньи. 15 минут сохранения изолированного сердца в охлажденном физиологическом растворе при +4С. Окраска этидиум бромидом. Наблюдаются позитивно окрашенные (красный) ядра (1) клеток. Криостатный срез. Увеличение х 100.
Динамика включения метиленового синего (рис. 3.5), который использовался для оценки окислительно-восстановительного потенциала ткани как эффективный конкурент флавоноидов за электроны в дыхательной цепи, выявила достоверное снижение уровня флюоресценции метиленового синего через 2 часа без достоверных изменений в последующем (рис. 3.2), что может быть обусловлено возрастанием уровня свободных радикалов в ткани при блокаде электронного моста с последующей деградацией зонда. Видно, что все методы показали, что в течение первых двух часов состояние ткани претерпевало значительные изменения. Однако блокада дыхательной цепи (метиленовый синий) могла относиться к обратимым изменениям, так как возобновление дыхания возможно после коротких ишемическиих воздействий (рис.3.5).
Миокард свиньи. 15 минут сохранения трансплантата в охлажденном физиологическом растворе при +4С. Окраска метиленовым синим. Наблюдаются позитивно окрашенные (синий) митохондрии клеток. Криостатный срез. Увеличение х 100.
Исследование динамики жизнеспособности миокарда изолированного сердца свиньи с помощью лазерного излучения
Для детализации изменений выявляемых в спектрах ЛИФ, возбуждаемых эксимерным KrF лазером А,=248 нм, мы проводили серию ЛИФ измерений, через 30 мин после забоя свиньи и затем через 2, 5 и 48 часов. В каждой серии регистрировали 10 спектров на 10 участках ткани. В данных экспериментах мы не проводили измерений абсолютных изменений интенсивности флюоресценции, так как на результаты подобных измерений влияет множество неконтролируемых факторов (например, ориентация образца в каждой новой серии измерений и т.п.). Поэтому мы исследовали только изменения формы спектров: каждый спектр нормировали на максимум интенсивности (полоса ЗЗОнм).
Представленные графики - результат усреднения спектров внутри каждой серии. Ниже представлены данные измерений, проведенных на одном животном (всего 8 животных). Для остальных динамика оказывалась аналогичной, только постоянная времени варьировала.
На рис. 5.7 представлены спектры ЛИФ свиного миокарда, измеренные после указанного периода сохранения. Во всех сериях в спектре доминирует пик 330 нм. Зарегистрировано, что с течением времени интенсивность полосы 420-500 нм уменьшается. На рис. 5.7 представлен увеличенный фрагмент области 400-600 нм. На рис.5.8 показана зависимость средней интенсивности данной полосы в зависимости от времени. Показана стандартная ошибка среднего. Дисперсионный анализ показал, что с высокой достоверностью (F = 7.62, р = 4.75-10"4) фактор времени влияет на интенсивность ЛИФ полосы 420-500 нм. Из графика видно, что уже в течение первого часа под воздействием необратимых процессов в ткани происходит резкое изменение относительной интенсивности ЛИФ этой полосы, которая впоследствии приблизительно сохраняется. Этот же вывод следует и из результатов post hoc сравнений в тесте Шеффе (таблица 9). Звездочками отмечены пары серий, которые статистически различимы.
Использование эксимерного KrF лазера позволяет наблюдать перестройку спектров ЛИФ в процессе сохранения. Однако на фоне мощного триптофанового пика наблюдение упомянутой полосы 450 нм затруднено, поэтому целесообразно было исследовать флюоресценцию в данной области, вызванную излучением не возбуждающим триптофан, то есть с длиной волны больше 310 нм.
На рис. 5.9 показаны спектры ЛИФ возбуждаемые азотным лазером с длиной волны 337 нм ткани миокарда в начале и в конце эксперимента. В спектрах присутствует два выраженных пика: с максимумами на 380 и 470 нм. Первый пик может быть обусловлен наличием в ткани соединительных структур - коллагена и эластина [257]. Второй может быть вызван флюоресценцией НАДН - звена в дыхательной цепи реакций в митохондриях [166]. Поскольку форма спектра в процессе сохранения изменяется не сильно, в данной серии экспериментов интенсивность ЛИФ нормирована только на энергию импульса возбуждающего излучения. При этом образец все время неподвижно находился на измерительном столике. Поскольку начальные и конечные интенсивности основного пика сильно различаются, состояние ткани можно попытаться охарактеризовать высотой пика на 470 нм.
На рис. 5.10 показана зависимость средней интенсивности этой полосы в зависимости от времени сохранения ткани. Для сравнения были также исследованы ткани, сохранившиеся при комнатной температуре. В силу наличия случайных факторов, таких как форма поверхности, размер образца ткани и прочее, влияющих на общую интенсивность флюоресценции, сравнение абсолютных значений величины пика для разных образцов не представляется возможным. Поэтому на всех графиках начальная высота пика принята за 1.
При любых условиях хранения образцов тканей происходило падение со временем интенсивности пика на 470 нм. Причем, первые три часа характеризовались большим разбросом темпов спада, вне зависимости от температуры. В последующем, у образцов ткани, сохранявшихся при комнатной температуре, имел место более быстрый спад интенсивности флюоресценции, нежели у образцов ткани, хранившихся при 4С. Зависимость кривых от условий сохранения говорит о том, что данные изменения в спектрах продиктованы происходящими в процессе сохранения биохимическими изменениями в ткани, а не другими особенностями эксперимента. Поведение интенсивности флюоресценции в первые часы эксперимента, скорее всего, определяется начальным состоянием ткани, и лишь когда ткань придет в равновесие с окружающим раствором, характер кривой начинает зависеть в большей степени от температуры сохранения.
Описанные выше измерения показали, что в процессе сохранения по мере снижения жизнеспособности миокарда изолированного сердца свиньи, спектры ЛИФ претерпевают изменения. Спектры ЛИФ миокарда свиньи достаточно повторяемы, изменения в процессе сохранения прослеживаются достаточно четко. При этом, основные спектральные преобразования происходят в течение первых часов после взятия миокарда.
При возбуждении лазером с длиной волны Ая=248нм показано, что по мере уменьшения жизнеспособности миокарда изолированного сердца спектр ЛИФ претерпевает изменения. Зарегистрированное ослабление интенсивности ЛИФ полосы 450-470 нм миокарда изолированного сердца в процессе сохранения. Существенное в 1.5-2 раза изменение интенсивности ЛИФ миокарда в полосе 450-470 нм может использоваться для оперативной (т.е. фактически за доли секунды) диагностики состояния жизнеспособности миокарда изолированного сердца свиньи. Изменения спектров ЛИФ и процессы, выявляемые морфологически, близки по временным характеристикам. Это соответствие дает основание считать, что спектр ЛИФ может давать информацию о жизнеспособности миокарда.
