Содержание к диссертации
Стр.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1. Место микобактерий в систематике микроорганизмов
(таксономия микрорганизмов) 14
Исторические сведения о классификации
микобактерий 14
Классификация микобактерий 15
2. Биологические свойства микобактерий 18
Морфология и физиология микобактерий 18
Теоретические вопросы развития устойчивости
микобактерий к воздействию факторов окружающей
среды 21
Устойчивость микобактерий
к воздействию факторов окружающей среды 24
3. Микобактерий как возбудители нозокомиального
туберкулеза и микобакетриозов и методы
предупреждения их распространения 25
Нозокомиальная туберкулезная инфекция 25
Характеристика дезинфицирующих средств,
применяемых в противотуберкулезных учреждениях.... 27
Проблемы подбора дезинфектанта
для уничтожения микобактерий в окружающей среде... 36
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалы исследований 40
Биологический материал 40
Плотные питательные среды 41
Дезинфицирующие средства 41
Нейтрализаторы 43
Бязевые тест-объекты 43
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Стандартные методы исследований 44
Оригинальная методика 45
Статистическая обработка результатов исследований... 50
ГЛАВА III ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ
УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ К
ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКИХ
ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ 51
Методика приготовления стандартных по биологической
концентрации суспензий штаммов микобактерий 51
Методика приготовления стандартных по обсемененности
живыми микобактериями бязевых тест-объектов 55
Выбор оптимальной питательной среды для контроля
жизнеспособности микобактерий при оценке их
устойчивости к дезинфектантам 58
ГЛАВА IV ПОДБОР ЭФФЕКТИВНЫХ НЕЙТРАЛИЗАТОРОВ
ДЛЯ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ РАЗНЫХ ХИМИЧЕСКИХ 66
ГРУПП И ОТРАБОТКА РЕЖИМОВ
НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ОСТАТОЧНОГО ДЕЙСТВИЯ
ДЕЗСРЕДСТВ НА МИКОБАКТЕРИИИ
ГЛАВА V СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ
МИКОБАКТЕРИЙ К ВОЗДЕЙСТВИЮ
ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ РАЗНЫХ
ХИМИЧЕСКИХ ГРУПП 84
Сравнительная оценка устойчивости микобактерий
разных видов
к воздействию хлорсодержащих дезсредств 84
Сравнительная оценка устойчивости микобактерий
разных видов к воздействию кислородсодержащих
дезсредств 87
Сравнительная оценка устойчивости микобактерий
разных видов к воздействию альдегидов и
альдегидсодержащих композиционных дезсредств 89
Сравнительная оценка устойчивости микобактерий
разных видов к воздействию дезсредств на основе КЛАВ.. 92
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 104
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 108
ПРИЛОЖЕНИЯ 125
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
Г - гуанидин;
ДВ - действующие вещества дезинфицирующих средств;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ДС - дезинфицирующие средства;
ИМН — инструменты медицинского назначения;
КОЕ — колониеобразующая единица;
КПАВ — катионные поверхностно-активные вещества;
ЛПУ — лечебно-профилактические учреждения;
МБ - микобактерии;
МБТ — микобактерии туберкулеза;
МЛУ (MDR) — множественная лекарственная устойчивость;
м.т./мл — микробные тела в 1 мл;
НТМБ — нетуберкулезные микобактерии;
НИИД — Научно-исследовательский институт дезинфектологии;
НУК - надуксусная кислота;
ПАВ — поверхностно- активные вещества;
ПВ - перекись водорода;
УНИИФ — Уральский научно-исследовательский институт
фтизиопульмонологии;
Ц - цитозин;
ЧАС — четвертично-аммониевые соединения.
Введение к работе
Актуальность проблемы
Микобактерии туберкулеза являются одними из наиболее устойчивых микроорганизмов к воздействию факторов окружающей среды [18]. В связи с высокой резистентностью возбудителя, борьба с туберкулезной инфекцией в противотуберкулезных учреждениях чрезвычайно затруднена. Зачастую незнание свойств микобактерии, путей и факторов передачи инфекции, и как следствие, - несоблюдение противоэпидемических мероприятий способствует распространению резистентных штаммов микобактерии туберкулеза и приводит к возникновению внутрибольничной туберкулезной инфекции. Так, в ряде стран зарегистрированы внутрибольничные эпидемические вспышки лекарственно устойчивого туберкулеза в стационарах среди больных и медицинских работников [108, 118]. Заболеваемость медицинских работников противотуберкулезной службы в 2006 г. в разных регионах нашей страны составляла от 189,1 до 428,5 на 100 тыс. данной профессиональной группы, данные показатели существенно превышают заболеваемость туберкулезом населения РФ, которая в 2007 году составила 83,2 на 100 тыс. населения [13, 14, 121].
Кроме того, отмечается увеличение частоты случаев заболеваний, вызываемых нетуберкулезными видами микобактерии (НТМБ), которые наиболее опасны для больных с иммунодефицитными состояниями (от 10 до 53% больных СПИДом страдают микобактериозами, существенно сокращающими их жизнь) [22, 82].
Больные туберкулезом и микобактериозами выделяют в окружающую среду большое количество микобактерии, часть из которых оседает из воздуха в составе аэрозольных частиц или попадает в виде выделений на различные объекты, на которых они могут длительно сохраняться в жизнеспособном состоянии и снова попадать в воздух
окружающей человека среды. Поэтому, как воздух, так и различные объекты являются потенциальным фактором внутрибольничного распространения туберкулезной инфекции [12, 29, 36, 59, 79, 87, 122].
Предотвратить распространение туберкулезной нозокомиальной воздушно-капельной инфекции возможно при использовании вентиляции, которая должна быть спроектирована и смонтирована с учетом особенностей конкретного ЛПУ. Как известно, такая вентиляция отсутствует в подавляющем большинстве противотуберкулезных ЛПУ. В сложившейся неблагоприятной эпидемиологической ситуации по туберкулезу и микобактериозам важнейшим, если не единственным, способом предотвращения распространения нозокомиальных воздушно-капельных инфекций становится химическая дезинфекция поверхностей и предметов, находящихся в окружении больного [6, 81, 88, 111, 123, 151].
В настоящее время перечень используемых для этих целей в ЛПУ химических дезинфицирующих средств достаточно велик и включает несколько сотен наименований, которые зарегистрированы и разрешены к применению в РФ (86,2% дезсредств разрешены как туберкулоцидные) [30,112].
К сожалению, туберкулоцидные режимы применения химических дезсредств, заявленные в Инструкциях по их применению, в реальной практике не всегда являются эффективными. Особенно это относится к средствам на основе ЧАС, низкая туберкулоцидная активность которых отмечена многими авторами [37, 61, 83, 94, 119]. Одной из причин этого может быть, на наш взгляд, использование в качестве тест-микобактерий для отработки этих режимов в РФ сапрофитного вида микобактерий Mycobacterium В-5.
Mycobacterium В-5 первоначально был рекомендован только для контроля качества проведения термической дезинфекции в очагах туберкулеза, поскольку обладает естественной устойчивостью к
температурному фактору. Экспериментальные данные о сравнительной оценке чувствительности разных видов микобактерий к физическим и химическим факторам относятся к концу 60-х годов прошлого столетия. В единственной найденной нами публикации М.И. Алексеевой с соавторами отмечено отсутствие корреляции между устойчивостью штаммов микобактерий к нагреванию и действию химических соединений [1].
Таким образом, в настоящее время нет экспериментально обоснованных рекомендаций по использованию микобактерий В-5 для испытания химических дезинфицирующих средств в качестве микроорганизма, адекватного по устойчивости возбудителю туберкулеза [49]. Вместе с тем, в соответствии с Руководством «Методы оценки дезсредств с целью определения их эффективности и безопасности», 1998 г., с использованием культуры именно этого вида микобактерий оценивают туберкулоцидные свойства новых дезинфицирующих средств [76].
В зарубежной дезинфекционной практике для оценки мико бактерицидной или туберкулоцидной активности химических дезинфектантов, в соответствии со стандартом Европейского комитета по стандартизации DIN-EN 14348:2005, используют 2 вида микобактерий: Mycobacterium terrae и Mycobacterium avium [105]. Насколько устойчивость всех этих тест-микроорганизмов адекватна клиническим штаммам, сказать трудно, поскольку таких данных в литературе не найдено.
С учетом вышеизложенного представлялось актуальной научно-практической задачей для дезинфектологической и фтизиатрической практики проведение исследований по сравнительной оценке устойчивости музейных тест-штаммов и клинических (выделенных от больных) штаммов микобактерий разных видов к воздействию дезинфицирующих средств разных химических групп.
Цель исследований. Изучить устойчивость различных видов микобактерий к дезинфицирующим средствам основных химических групп, обосновать и разработать технологию клинического тестирования туберкулоцидной активности дезсредств.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Усовершенствовать методику определения количества жизнеспособных микобактерий в суспензии и на тест-объекте: подобрать оптимальную питательную среду для культивирования микобактерий при испытании туберкулоцидной активности дезинфектантов.
Отработать методику эффективной нейтрализации остаточного действия дезинфектантов при проведении экспериментальных исследований по оценке чувствительности к ним тест-микобактерий.
Экспериментально изучить чувствительность разных видов микобактерий к воздействию дезинфицирующих средств различных химических групп.
На основании полученных данных разработать методику оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств.
Научная новизна
Экспериментально выявлено, что Mycobacterium В-5 обладают значительно меньшей устойчивостью к химическим дезинфицирующим средствам, чем музейные и клинические штаммы возбудителей туберкулеза и микобактериозов, и, в этой связи, не являются адекватной моделью для отработки туберкулоцидных режимов применения химических дезинфектантов.
Экспериментально установлено, что М. terrae по устойчивости к дезинфектантам наиболее близки возбудителям туберкулеза и микобактериозов и, следовательно, они являются более адекватными тест-
микроорганизмами, чем Mycobacterium В-5, при разработке туберкулоцидных режимов.
Показано, что нейтрализующий бульон Ди-Ингли является
эффективным нейтрализатором остаточного действия
альдегидсодержащих и композиционных дезсредств (в состав которых входят КЛАВ) на микобактерии и перспективен для использования как стандартный продукт при испытании дезсредств.
Экспериментально показано преимущество использования питательных сред на яичной основе («Новая» и Левенштейна-Иенсена) для культивирования тест-микобактерий при оценке туберкулоцидных и микобактерицидных свойств дезинфицирующих средств. Практическая значимость
Результаты экспериментальных исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, позволили выявить и обосновать необходимость использования в отечественной практике при испытании и отработке туберкулоцидных режимов применения дезинфектантов тест-микобактерий более адекватных по устойчивости возбудителю туберкулеза к дезсредствам, чем Mycobacterium В-5, и усовершенствовать технологию бактериологического контроля туберкулоцидной активности дезсредств.
Базирующиеся на экспериментальных данных диссертационной
работы рекомендации по использованию М. terrae в качестве тест-
микроорганизма и питательных сред на яичной основе для выявления
жизнеспособных микобактерии позволили усовершенствовать и
предложить для практического использования более эффективную методику проведения лабораторных исследований по разработке и испытанию туберкулоцидных режимов применения новых дезсредств.
Применение в ЛПУ фтизиатрического профиля разработанной методики тестирования активности дезсредств с использованием
вирулентных клинических штаммов микобактерий, позволит обеспечить объективный выбор дезинфектантов, оптимальных для конкретного ЛПУ, повысить эффективность проводимых дезинфекционных мероприятий и снизить риск нозокомиального распространения туберкулеза. Положения диссертации, выносимые на защиту
Сравнительная оценка чувствительности/резистентности микобактерий к воздействию дезинфицирующих средств как критерий выбора дезинфектантов показала, что регламентированный сапрофитный вид Mycobacterium В-5 является неадекватной моделью.
Усовершенствованная медицинская технология «Методы оценки эффективности дезинфицирующих средств, применяемых в противотуберкулезных учреждениях» может служить методической базой для проведения тестирования дезсредств на туберкулоцидную активность.
Внедрение в практику Результаты исследований внедрены:
На уровне Государственной системы санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации в виде раздела «Методы изучения и оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств» Методических указаний «3.1.3.5. Профилактика инфекционных заболеваний. Дезинфектология» // Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Москва, 2008 г.
В виде усовершенствованной медицинской технологии «Методы оценки эффективности дезинфицирующих средств, применяемых в противотуберкулезных учреждениях» для противотуберкулезных учреждений территории курации Уральского НИИ фтизиопульмонологии.
Материалы исследований внедрены в практическую деятельность УНИИФ.
Материалы исследований используются в УНИИФ в программах последипломной подготовки врачей-фтизиатров и бактериологов.
Апробация диссертации
Основные результаты работы доложены на международной научно-практической конференции «Приоритетные направления в обеспечении результативности системы противотуберкулезных мероприятий в современных социально-эпидемиологических условиях» (г. Екатеринбург, 2006 г.); Российской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом (г. Москва, 2007 г.); VIII Российском съезде дезинфектологов (г. Москва, 2007 г.); Свердловской областной конференции «Биотехнологические методы в ветеринарной медицине» (г. Екатеринбург, 2007 г.); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, 2 из них - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований. Получена приоритетная справка ФИПС РФ от 9.01.2008 № 2008101184/13(001308) на изобретение «Способ определения эффективности дезинфицирующих средств, применяемых в противотуберкулезных учреждениях». Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и выводов, списка литературы, приложения. Объем диссертации — 136 страниц печатного текста. Диссертация содержит 16 таблиц, 12 диаграмм, 1 схему и
1 рисунок. Список литературы включает 132 отечественных и 25 иностранных источников. Благодарность
Автор бесконечно благодарен всем, кто непосредственно или косвенно способствовал написанию рукописи диссертации.
Автор сердечно благодарит д.м.н. профессора В.В Канищева, который еще несколько лет назад высказал идею о неодинаковой устойчивости микобактерий разных видов к воздействию дезсредств, без его участия данная работа была бы неосуществима.
Автор искренне благодарит директора ФГУ «УНИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий» д.м.н. профессора Д.Н. Голубева за живой интерес к работе и активную поддержку. Автор выражает признательность зам. директора УНИИФ по НИР д.м.н. С.Н. Скорнякову за полезные советы и заботу о данной работе. Автор выражает глубокую искреннюю благодарность за неоценимую помощь в работе над диссертацией к.б.н., зав. лабораторией микробиологии и ПЦР диагностики УНИИФ М.А.Кравченко. Автор выражает искреннюю благодарность к.б.н. с.н.с. Д.В.Вахрушевой, отдавшей много своего времени и знаний для обсуждения результатов исследований, потратившей много усилий во время подготовки глав диссертации и редакции ее в целом.
Автор благодарит И.А.Черняева, который оказал неоценимую разъяснительную помощь по статистической обработке результатов исследований.
Диссертационная работа была бы неосуществима без постоянной технической поддержки исследований всех сотрудников Лаборатории микробиологии и ПЦР диагностики ФГУ «УНИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий», за что автор выражает свою благодарность и глубокую признательность.
