Введение к работе
Актуальность темы
Туберкулез представляет постоянную угрозу здоровью людей во всем мире и является причиной высокой смертности у взрослого населения. По данным ВОЗ в 2011 году зарегистрировано около 8,7 млн. новых случаев этого заболевания и 1,4 млн. летальных исходов [ВОЗ, 2012].
Напряженная эпидемическая ситуация по туберкулезу как в мире, так и в Российской Федерации, прежде всего, связана с увеличением числа случаев заболевания, вызываемых M. tuberculosis (МБТ) с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ/ШЛУ) [CDC, 2006; ВОЗ, 2012].
Повышение эффективности этиотропного лечения больных туберкулезом с МЛУ/ШЛУ возбудителя может быть достигнуто за счет введения в стандарт-ные режимы химиотерапии антибактериальных препаратов, входящих в число резервных лекарственных средств, – фторхинолонов третьего и четвертого поколений. Однако вероятность выздоровления пациентов во многом будет зависеть от своевременно назначенного адекватного лечения, от уровня и скорости формирования устойчивости МБТ к препаратам [Борисов С.Е. и др., 2011; Bryskier A. et al., 2002; Ginsburg A. et al., 2003; Conde M. et al., 2009; Devasia R. et al., 2009]. В связи с этим необходимо быстро и качественно проводить определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) возбудителя.
В последние годы разработаны молекулярно-генетические методы, позволяющие в короткие сроки (до 48 часов) определить лекарственную чувствительность МБТ к фторхинолонам [Мороз А.М. и др., 2008; Носова Е.Ю. и др., 2011]. Необходимо отметить, что результатом молекулярно-генетического анализа являются экспресс-данные о наличии или отсутствии устойчивости возбудителя ко всей группе фторхинолонов в целом. В то же время появились работы, в которых показано, что не все мутации, индуцирующие устойчивость МБТ к фторхинолонам, связаны с перекрестной устойчивостью [Malik S. et al., 2012]. Кроме того, все чаще обнаруживают мутации, роль которых в возникновении лекарственной устойчивости до конца не изучена [Pantel A. et al., 2011]. Следовательно, для определения лекарственной чувствительности МБТ к препаратам группы фторхинолонов применение только молекулярно-генетических методов не может обеспечить необходимую достоверность результатов. Именно поэтому исключительно высока роль использования микробиологических методов, которые в комплексе с молекулярно-генетическими позволят получить наиболее точные и адекватные результаты для проведения больным своевременного эффективного лечения.
Чтобы определить лекарственную чувствительность возбудителя туберкулеза культуральными методами необходимо знать критическую концентрацию (КК) препарата, с помощью которой возможно разделение микобактерий на чувствительные и устойчивые [Приказ №109 МЗ РФ, 2003; Canetti G. et al., 1963; CLSI, 2011]. В настоящее время единых критических концентраций резервных препаратов, в том числе и фторхинолонов не предложено. В этой связи вопрос выбора оценочных критериев для качественного и надежного определения лекарственной чувствительности МБТ к препаратам группы фторхинолонов при использовании культуральных методов приобрел особую актуальность.
Цель работы
Определение критериев оценки лекарственной чувствительности M. tuberculosis к препаратам группы фторхинолонов культуральными методами для повышения эффективности микробиологической диагностики туберкулеза, вызванного лекарственно-устойчивым возбудителем.
Задачи исследования
-
Создание лабораторной коллекции чувствительных и устойчивых к фторхинолонам клинических штаммов M. tuberculosis, охарактеризованных культуральными и молекулярно-генетическими методами.
-
Определение критических концентраций левофлоксацина, моксифлоксацина и гатифлоксацина для оценки лекарственной чувствительности M. tuberculosis в жидкой питательной среде Middlebrook 7H9 с помощью автоматизированной системы Bactec MGIT 960 и на плотной среде Левенштейна-Йенсена методом абсолютных концентраций.
-
Выявление устойчивости M. tuberculosis к офлоксацину и моксифлоксацину в жидкой среде Middlebrook 7H9 с помощью тест-системы Sensititre MycoTB.
-
Сравнительное изучение лекарственной чувствительности клинических штаммов M. tuberculosis к фторхинолонам разными культуральными методами с использованием установленных оценочных критериев.
Научная новизна
Впервые с использованием единой стандартной панели штаммов M. tuber-culosis установлены критические концентрации наиболее активных препаратов группы фторхинолонов для оценки лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза в жидкой Middlebrook 7H9 и на плотной Левенштейна-Йенсена питательных средах.
Впервые установлено значение критической концентрации гатифлоксацина 0,25 мкг/мл; обоснованы критические концентрации левофлоксацина 1,0 мкг/мл и моксифлоксацина 0,25 мкг/мл для оценки лекарственной чувствительности M. tuberculosis в автоматизированной системе Bactec MGIT 960.
Впервые определены значения критических концентраций левофлок-сацина – 2,0 мкг/мл, моксифлоксацина и гатифлоксацина – 0,75 мкг/мл для оценки лекарственной чувствительности M. tuberculosis методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена.
Установлены значения минимальных ингибирующих концентраций офлоксацина – 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина – 1,0 мкг/мл, указывающие на устойчивость M. tuberculosis к данным препаратам в тест-системе Sensititre MycoTB (количественный метод).
Впервые проведено сравнительное исследование лекарственной чувствительности клинических штаммов M. tuberculosis к препаратам фторхинолонового ряда в тест-системе Sensititre MycoTB, системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена с использованием для анализа результатов установленных оценочных критериев. Выявлен высокий уровень корреляции результатов.
Практическая значимость
Для раннего выявления устойчивости M. tuberculosis целесообразно применять систему Bactec MGIT 960 или тест-систему Sensititre MycoTB, которые, в отличие от метода абсолютных концентраций с длительностью выполнения исследования 21-28 дней, позволяют получить результат на 5-14 день от начала инкубации, а также провести быструю коррекцию химиотерапии больных туберкулезом.
С помощью установленных в тест-системе Sensititre MycoTB минималь-ных ингибирующих концентраций офлоксацина и моксифлоксацина можно выявить степень относительной устойчивости к ним (низкая или высокая) M. tuberculosis, что необходимо клиницисту для выбора препарата из группы фтор-хинолонов, корректировки дозировки и схемы лечения пациента.
Созданная лабораторная коллекция клинических штаммов M. tuberculosis, охарактеризованных микробиологическими и молекулярно-генетическими методами и обладающих различным спектром лекарственной устойчивости к препаратам фторхинолонового ряда, позволит в дальнейшем проводить сравнительные исследования лекарственной чувствительности возбудителя к вновь синтезированным препаратам данной группы, а также апробировать новые методы микробиологической диагностики туберкулеза.
Положения, выносимые на защиту
-
Для оценки лекарственной чувствительности M. tuberculosis установлены критические концентрации препаратов группы фторхинолонов. Для автоматизированной системы Bactec MGIT 960 с использованием жидкой питательной среды Middlebrook 7H9 и метода абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена критические концентрации левофлоксацина составили 1,0 и 2,0 мкг/мл, соответственно, моксифлоксацина и гатифлоксацина – 0,25 и 0,75 мкг/мл, соответственно.
-
Установленные в тест-системе Sensititre MycoTB минимальные инги-бирующие концентрации офлоксацина 4,0 мкг/мл и моксифлоксацина 1,0 мкг/мл, указывают на устойчивость M. tuberculosis к этим препаратам.
-
Сравнительное изучение лекарственной чувствительности клини-ческих штаммов M. tuberculosis в системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена при использовании установленных критических концентраций препаратов выявило высокий процент корреляции полученных результатов: для левофлоксацина 99,0%, для моксифлоксацина 97,1% и для гатифлоксацина 96,1% случаев.
-
Данные, полученные в результате определения лекарственной чувствительности клинических штаммов M. tuberculosis тремя культуральными методами (в тест-системе Sensititre MycoTB, в системе Bactec MGIT 960 и методом абсолютных концентраций на плотной среде Левенштейна-Йенсена), сопоставимы в 89,3% случаев для офлоксацина и в 94,6% для моксифлоксацина.
Апробация работы и публикации
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, протокол №1 от 5 марта 2013 года. Материалы диссертации доложены на: научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2009; научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2011; Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом», Санкт-Петербург, 2011; X Московской ассамблее «Здоровье столицы», Москва, 2011; XI Московской ассамблее «Здоровье столицы», Москва, 2012; Российской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей», Москва, 2013; V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2013.
Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных работах, включая 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
