Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1.Эпидемическая ситуация по заболеваемости туберкулёзом за рубежом и в России 9
1.2. Молекулярно-генетические методы, применяемые при исследованиях эпидемиологии туберкулёза 18
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Бактериальные штаммы 32
2.2. Микробиологические методы 32
2.2.1. Бактериоскопический метод 32
2.2.2. Культуральный метод 32
2.2.3. Рост на среде с салицилово-кислым натрием 34
2.3. Биохимические методы 33
2.3.1. Ниациновый тест 33
2.3.2. Определение каталазной активности 33
2.3.3. Определение термостабильности каталазы 34
2.4. Определение чувствительности к противотуберкулёзным препаратам методом абсолютных концентраций на плотных средах 34
2.5. Молекулярно-генетические методы типирования 35
2.5.1. Метод WLF-ШПО 35
2.5.2. Метод RFLP-PGRS 37
2.5.3. Метод сполиготипирования 38
2.5.4. Метод VNTR 39
2.5.5 Статистические методы 40
Глава 3. CLASS Результат CLASS ы 41
3.1. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от заключённых больных туберкулёзом в тюрьме г. Серпухова (Московская область) 41
3.2. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от заключённых больных туберкулёзом в тюрьме пос. Озерки (Тульская область) 50
3.3. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г. Тула 56
3.4. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г.Калуга 61
3.5. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г. Нижний Новгород 63
3.6. Характеристика штаммов М. tuberculosis RFLP- IS6110 семейства AI 70
Глава 4. Обсуждение результатов 75
4.1. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных заключённых тюрем г. Серпухов и пос. Озерки (Тульская область) 75
4.2. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных Тулы и заключённых тюрьмы пос. Озерки 78
4.3. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных Тулы, Калуги и Нижнего Новгорода 79
4.4. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных Дзержинского и Павловского районов Нижнего Новгорода 89
Список литературы 83
- Молекулярно-генетические методы, применяемые при исследованиях эпидемиологии туберкулёза
- Определение чувствительности к противотуберкулёзным препаратам методом абсолютных концентраций на плотных средах
- Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г. Тула
- Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных заключённых тюрем г. Серпухов и пос. Озерки (Тульская область)
Введение к работе
Туберкулёз остаётся одним из наиболее распространённых и опасных заболеваний человека. Возбудителем туберкулёза инфицировано около трети (2 млрд.) населения земного шара [16]. Тяжёлое положение, связанное с ростом заболеваемости туберкулёзом, наблюдается в последние годы и в России. По данным литературы, заболеваемость им возросла с 34 в 1991 г. до 48,7 случаев в 1998 г. на 100 000 населения и ситуация продолжает ухудшаться [11, 186].
В сложившейся ситуации для эффективного осуществления эпидемического анализа необходимы данные по идентификации и дифференциации клинических штаммов М. tuberculosis. Они позволяют быстро установить источник инфекции, пути передачи возбудителя инфекции и ареал его распространения [16]. К настоящему времени по рекомендации ВОЗ за рубежом на основании результатов, полученных с применением молекулярно-генетических методов типирования клинических штаммов микобактерий, создаётся база данных, содержащих результаты RFLP-IS6110 и сполиготипирования [231].
На данный момент опубликовано большое количество работ по молекулярно-генетическому типированию штаммов М. tuberculosis, проводимому в большинстве развитых стран и во многих развивающихся странах. В то же время в России такие работы только начинаются. Данные по молекулярно-генетическому типированию штаммов М. tuberculosis получены лишь для некоторых регионов РФ [7, 19, 208]. Кроме этих исследований было проведено совместное исследование Центральным НИИ туберкулёза РАМН с PHRI (New-York, U.S.A.) по генотипированию микобактерий, выделенных на отдельных территориях России [19]. Для такой большой по территории и численности населения страны как Россия этого явно недостаточно.
Таким образом, молекулярно-генетические исследования штаммов М. tuberculosis в России находятся на начальных этапах развития. Это обусловлено как экономическими
7 причинами, так и отсутствием нормативной базы для проведения исследований с
использованием молекулярно-генетических методов, что и определяет актуальность
проведённого нами исследования.
Цель исследования. Определить спектр клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих среди больных туберкулёзом в средней полосе Европейской части России.
Задачи исследования:
Охарактеризовать штаммы М. tuberculosis с использованием микробиологических и молекулярно-генетических методов (сполиготипирования, RFLP-IS&//0, RFLP-PGRS и VNTR).
Определить генетические различия между штаммами М. tuberculosis, выделенными от больных из городов Тулы, Калуги, Нижнего Новгорода и от заключённых больных тюрем г. Серпухова (Московская область) и пос. Озерки (Тульская область).
Создать коллекцию клинических штаммов М. tuberculosis. Научная новизна.
С помощью современных методов выявлен спектр штаммов М. tuberculosis, циркулирующих среди больных в городах Тула, Калуга, Нижний Новгород и среди заключённых больных в тюрьмах г. Серпухова и пос. Озерки.
Охарактеризован новый генотип клинических штаммов М. tuberculosis - AI. Показано его широкое распространение среди больных, проживающих на изученных территориях. Выяснено, что среди изолятов генотипа AI преобладают штаммы, устойчивые к лекарственным препаратам.
Выявлена низкая степень кластеризации штаммов М. tuberculosis. Это свидетельствует о том, что в исследованных группах больных имеет место реактивация эндогенной инфекции.
8 Практическое значение работы.
Сформирована коллекция, состоящая из 527 штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом с 1999 по 2001 год. Создана компьютерная база данных, содержащая информацию о микробиологических свойствах, лекарственной устойчивости и принадлежности штаммов М. tuberculosis к разным генетическим группам. Получен акт №16 от 19 декабря 2003г. о внедрении результатов диссертации в научно-исследовательскую работу Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» Минздрава Российской Федерации.
Генотипирование штаммов М. tuberculosis по всем молекулярно-генетическим маркерам с 2002 года внедрено в работу отдела белковой инженерии №38 Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр прикладной микробиологии» Минздрава Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту:
Среди больных туберкулёзом городов Тулы, Калуги, Нижнего Новгорода и среди заключённых больных г. Серпухова и пос. Озерки преобладают штаммы М. tuberculosis генотипов W и AI.
Штаммы генотипа AI обладают следующими характеристиками: сполиготип LAM, RFLP-IS6770 профиль содержит характерный набор из 11 рестрикционных фрагментов молекулярной массой от 6010 до 920 пар нуклеотидных оснований, и ETR - локусы А, В, С, D, Е и F содержат по 2 тандемных повтора.
Лекарственной устойчивостью к пяти (STR, RIF, INH, KAN, ЕМВ) противотуберкулёзным препаратам первого ряда обладают 93,0 % клинических штаммов охарактеризованного генотипа AI. Множественную лекарственную устойчивость проявляют 66,0 % клинических штаммов этого генотипа.
Молекулярно-генетические методы, применяемые при исследованиях эпидемиологии туберкулёза
Ухудшение эпидемической ситуации в мире вызвало необходимость разработки новых, эффективных методов идентификации штаммов возбудителя туберкулёза, позволяющих устанавливать источник инфекции, изучить механизмы и пути передачи. Использование классических методик типирования возбудителя туберкулёза, основанных на выявлении фенотипических признаков, часто неэффективно. Микробиологические и биохимические методы типирования микобактерий туберкулёза не позволяют дать объективную характеристику циркулирующим штаммам М. tuberculosis. Как правило, этих методов недостаточно, чтобы установить источник инфекции, пути передачи возбудителя и его возможные резервуары. Их недостатком является так же длительность получения результатов [6,12,13,20,21].
Как известно, в последнее десятилетие исследования геномного полиморфизма позволили решить ряд фундаментальных и прикладных проблем генетики человека, популяционной генетики, осуществлять анализ родословной, идентификации личности, определение чистоты линий и т.п. Изучение фундаментальных основ геномного полиморфизма явились предпосылкой для разработки молекулярно-генетических подходов в микробиологии и эпидемиологии бактериальных инфекций. Использование молекулярно-генетических методов позволяет выяснять генетическую структуру популяций возбудителей бактериальных инфекций, выявлять генетическое родство между эпидемическими и неэпидемическими вариантами возбудителя, расшифровать механизмы появления, формирования и распространения эпидемических штаммов, маркировать и определять ареалы распространения штаммов, наиболее значимых в патологии человека. Результаты такого рода исследований важны для разработки научно-обоснованных противоэпидемических мероприятий в борьбе с бактериальными инфекциями [20]. Для изучения микобактерий, за последние 20 лет, было разработано много новых методов анализа, основанных на особенностях бактериальных геномов [37, 51, 56, 57, 58, 64, 76, 80, 86,87,103,184].
Одним из новых методов штаммового типирования микобактерий туберкулёзного комплекса, стал метод рестрикционного анализа. Однако этот метод не получил широкого распространения из-за трудностей при фракционировании большого числа фрагментов. Новые варианты метода с использованием пульс-электрофореза, или расщепления микобактериальной ДНК мелкощепящими рестриктазами так же не нашли широкого применения [3, 78,156,180,203,241]. При исследовании структурных особенностей ДНК было обнаружено, что определённые фрагменты ДНК генетически и структурно чётко детерминированы и способны транслоцироваться в пределах геномов бактерий и фагов. Они получили название инсерционные элементы [4]. Инсерционные элементы - это маленькие, менее 2,5 тысяч п.н.о., сегменты ДНК, которые могут встраиваться во множество сайтов молекулы-мишени. Реакция встраивания осуществляется кодируемыми в инсерционном элементе ферментами транспозазами [4]. Инсерционные элементы способствуют осуществлению гесА независимых рекомбинантных событий, не требующих наличия гомологичных последовательностей [4]. Гены, связанные непосредственно с функцией внедрения, ограничены по краям прямыми и инвертированными повторами. Так, например, хромосомная ДНК М. tuberculosis содержит инсерционный элемент - IS6110, размером 1355 п.н.о., который относится к семейству IS3 элементов, впервые обнаруженных в энтеробактериях [97]. Число его копий в хромосоме может варьировать от 0 до 25 [16, 198]. Наиболее широко в современных исследованиях применяется метод RFLP [25, 37,46, 50, 52, 56, 57, 62, 65, 76,101-104, 113,148, 151-154, 157, 160,164, 166, 169, 178, 207,212, 217, 222, 232, 234, 237]. Этот метод основан на определении в геноме микобактерий ряда повторяющихся нуклеотидных последовательностей и анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции и имеет множество модификаций, в основу которых положена гибридизация с разными собственными инсерционными элементами и повторяющимися последовательностями: IS67/0, IS1081, IS986, IS987, DR, PGRS, MPTR, пентамерный триплет (GTG)5 и т.п. [108,226]. Одним из его разновидностей является метод «риботипирования» [21, 115, 131]. После расщепления ДНК ферментами рестрикции PvuII, EcoRI или BstI, гибридизация происходила с фрагментом хромосомной ДНК одинаковой молекулярной массы даже в тех случаях, когда анализировались М. tuberculosis и М. bovis. Следовательно, рРНК гены в хромосоме возбудителей представлены только одной копией. Таким образом, метод «риботипирования» не репрезентативен для анализа геномного полиморфизма микобактерий [21,115,131]. В другом методе, применяемом для типирования штаммов, в качестве зонда, используется ДНК фага М13 и некоторых других [116, 137, 197, 198, 205]. Исследования показали, что с помощью зонда ДНК фага М13 можно типировать близкородственные по фенотипу штаммы М. tuberculosis на несколько генотипических вариантов. При этом гипервариабельные последовательности, детектируемые с помощью зонда ДНК фага М13, обнаруживаются в 7-12 фрагментах различной молекулярной массы. Однако есть два существенных ограничения этого метода: малая специфичность и большая трудоёмкость [14, 18,21, 31,34,35, 98,99,116, 137,197,198,205, 221]. Остальные молекулярно-генетические методы типирования микобактерий туберкулёзного комплекса можно разделить на две группы: методы, основанные на гибридизации, и методы, в которых при помощи ПЦР выявляются инсерционные элементы и повторяющиеся последовательности. Геномная дактилоскопия М. tuberculosis с использованием зонда, выявляющего собственный инсерционный элемент IS6770 - одна из основных методик, признанная во всём мире. Она является «золотым стандартом» в эпидемиологических и популяционных исследованиях М. tuberculosis [25, 26, 38, 77, 82, 92, 127, 130, 133, 65, 143, 148, 151-154, 157, 158, 106, 160, 177, 182, 189, 195, 204, 207, 222, 233, 234]. Из-за различного числа копий и вариабельности сайтов интеграции IS б/70 в хромосому, эпидемиологически не родственные штаммы проявляют высокую степень полиморфизма длин фрагментов рестрикции. Так как в течение длительного по времени культивирования in vitro или роста in vivo, транспозиции IS6110 не наблюдалось, то было высказано предположение о том, что частота транспозиции является низкой. Поэтому IS 67 7 0 является хорошим генетическим маркером для слежения за отдельными штаммами туберкулёза во время микроэпидемий, внутрибольничной инфекции и клонального распространения штаммов с МЛУ-устойчивостью [151, 152, 153, 215, 235]. С помощью данной методики в 1992-1993 гг. были впервые получены генотипические характеристики штаммов, циркулирующих в ряде регионов мира [56]. Помимо исследований штаммов М. tuberculosis данная методика применяется, наряду с методиками RFLP-PGRS, RFLP-DR и сполиготипирования, для исследования эпидемиологии штаммов М. bovis, выделяемых от домашних и диких животных [62, 86, 108, 116, 217, 219,242]. В зависимости от штамма число фрагментов, гибридизующихся с зондом, может варьировать от 0 до 25, а размеры фрагментов от 1-1,5 до 15-20 тысяч п.н.о. [16, 194]. Микобактериальная ДНК расщепляется эндонуклеазой PvuII на фрагменты различной длины, которые затем разделяют электрофорезом в агарозном геле. После Саузерн-блоттинга проводится гибридизация с меченым зондом, который комплементарен правому плечу инсерционного элемента IS 67/0. Принято, для стандартизации получаемых результатов в различных лабораториях, использовать генетический маркер к правому плечу IS6110, так как этот инсерционный элемент присутствует только в хромосомах микобактерий туберкулёзного комплекса [106, 167]. Описаны случаи, когда штаммы не содержали ни одной копии инсерционного элемента IS6110 [3, 5, 26]. Штамм IN4, выделенный в Индии, не содержал ни одной копии IS67/0. Он был подвергнут другим анализам на принадлежность к М. tuberculosis. Все они, в том числе и классическое бактериологическое исследование, показали, что этот штамм действительно относится к М. tuberculosis [3]. В дальнейшем штаммы М. tuberculosis без инсерционного элемента 1S6110 были обнаружены среди изолятов, полученных из Южной Индии и Вьетнама [3, 177, 238]. В настоящее время достигнута международная договорённость об использовании эндонуклеазы PvuII при получении фингерпринтингов с применением IS6770 [3, 157, 212, 216]. Однако, после того как неожиданно обнаружилось, что у 80% проверенных штаммов М. tuberculosis часть сайтов PvuII модифицирована, был поднят вопрос о воспроизводимости результатов, полученных при использовании этой рестриктазы [160, 212, 216]. Изучение процесса расщепления хромосомной ДНК этой рестриктазой показало, что существует несколько типов модифицированных сайтов рестрикции. Они отличаются по количеству фермента, необходимого для расщепления модифицированного сайта. В стандартных условиях при получении IS61J0 фингерпринтингов используется 10 ед. рестриктазы PvuII для расщепления 4 микрограмм хромосомной ДНК в течение 1 часа. Модифицированные сайты можно расщепить, используя, в зависимости от типа модификации, от 40 до 80 ед. фермента в течение 1 часа. Таким образом, в стандартных условиях модифицированные сайты рестрикции PvuII не расщепляются. После этих исследований методика была стандартизована и её воспроизводимость была определена как 100% [127,151,152,218].
Определение чувствительности к противотуберкулёзным препаратам методом абсолютных концентраций на плотных средах
Выросшую на плотной питательной среде культуру снимали платиновой лопаточкой и растирали стеклянной палочкой в толстостенной пробирке в течение 5 минут, постепенно добавляя стерильный физиологический раствор. Суспензию культуры стандартизовали по бактериальному стандарту мутности №5 - 500 млн. микробных тел в 1 мл. (5 единиц) (ГИСК им. Л. А. Тарасевича), затем разводили физиологическим раствором 1:10.
В яичную среду Левенштейна-Йенсена, не содержащую крахмала, до свёртывания добавляли различные разведения противотуберкулёзных препаратов. Разведения препаратов готовили из порошкообразных лекарственных форм непосредственно перед использованием. В соответствии с критериями чувствительности, при постановке опытов на плотных питательных средах использовали следующие концентрации туберкулостатических препаратов: стрептомицин - 5,10, 50 мкг/мл; изониазид - 1, 5,25 мкг/мл; канамицин - 30, 50 мкг/мл; рифампицин - 20, 50 мкг/мл; этамбутол - 2, 5 мкг/мл. Расчёт препаратов производился на 100 мл среды. Питательную среду с различными концентрациями противотуберкулёзных препаратов разливали в пробирки по 5 мл и свёртывали в наклонном положении в течение 45 минут при температуре 85С, не допуская перегрева среды. Готовую среду хранили в холодильнике при температуре 2-4С. Пробирки с приготовленными средами, содержащими противотуберкулёзные препараты, и одну контрольную пробирку со средой, не содержащей препаратов, засевали приготовленной взвесью культуры, по 0,2 мл в каждую пробирку. Пробирки закрывали силиконовыми пробками и помещали в наклонном положении в термостат при 37С. Через 3-4 недели после посева пробирки вынимали и регистрировали полученные результаты. Культуру считали чувствительной, если в пробирке со средой, содержащий препарат, выростало менее 20 колоний при обильном росте в контроле. Каждую серию приготовленной питательной среды с препаратами проверяли, засевая чувствительным штаммом М. tuberculosis H37Rv [6,12,123]. Глава 2.5. Молекулярно-генетические методы типирования. 2.5.1. Метод RFLP-IS67/0. Выделение хромосомной ДНК. Для выделения хромосомной ДНК культуры клинических штаммов М. tuberculosis выращивали на косяках с плотной средой Левенштейна-Йенсена при 37 С в течение 4-6 недель. Биомассу смывали лизирующим буфером ТЕ (0,01 М Трис-НС1, 0,001 М ЭДТА, рН 8,0), содержащим лизоцим в конечной концентрации 10 мг/мл и добавляли SDS до конечной концентрации - 3 %, и проназу до 50 мкг/мл. Суспензию прогревали при температуре 68 С в течение 1 часа. Далее депротеинизацию хромосомной ДНК осуществляли последовательными обработками равным объёмом фенола, насыщенного ТЕ; смесью фенола с хлороформом (1:1) и хлороформом. Затем ДНК осаждали этанолом, содержащим 0,3 М NaCl. ДНК трижды промывали 70% спиртом, высушивали и растворяли в стерильной деионизованной воде [212]. Концентрацию и чистоту образцов ДНК определяли при помощи прибора GeneQuant pro DNA/RNA Calculator («Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England) .
ПЦР-амплификация IS6110 элемента. В качестве праймеров к правой части 1S6JJ0 элемента использованы последовательности: прямой праймер INS1 5 -cgt gag ggc ate gag gtg gc-3 и обратный праймер INS2 5 -gcg tag gcg teg gtg аса aa-3 («SYNTOL», Москва) [161]. Реакцию амплификации проводили в смеси, содержащей 10 нг. хромосомной ДНК, 1,5 тМ MgCb, смесь dNTP - по 2,5 тМ каждого («MBI Fermentas», Lithuania), по 10 рМ прямого и обратного праймеров и 1 единицу Taq-полимеразы («MBI Fermentas», Lithuania). Реакцию амплификации проводили на амплификаторе РТС-200 («MJ Research Inc.», U.S.A.) в следующем режиме: 95 С -5 мин; (95 С - 1 мин.; 65 С - 1 мин.; 72 С - 1 мин.) - 30 циклов; 72 С - 10 мин.; 4 С - 5 мин. Анализ амплификата проводили методом электрофоретического разделения в 1% агарозном геле (Agarose NA, «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England) при окрашивании бромистым этидием. В качестве стандарта молекулярных масс использовали 100 п.н.о. метчики фирмы «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England. Положительным контролем служила ПЦР-смесь, где матрицей была хромосомная ДНК, выделенная из референс-штамма М. tuberculosis H37R.V АТСС. В качестве отрицательного контроля использовали ПЦР-смесь без матрицы. При наличии IS6JJ0 элемента образовывался ПЦР-продукт размером 245 п.н.о. [97,106, 204,212].
1-1,5 мкг хромосомной ДНК, выделенной, как было описано выше, расщепляли эндонуклеазой рестрикции PvuII («MBI Fermentas», Lithuania) в течение 4-х часов при 37С. Продукты гидролиза анализировали методом электрофоретического разделения в 1% агарозном геле (Agarose NA, «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England) 1,0 V/см В течение 17 час. О длине разгона образцов судили по длине пробега бромфенолового синего, который составлял 17-18 см. ДНК-фрагменты после окрашивания геля бромистым этидием переносили на нейлоновую мембрану (Hybond N+; «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England) с помощью вакуумного блоттера (model 785, «BioRad», U.S.A.) в течение 3-х часов при давлении 15 cm/Hg (сантиметров ртутного столба). Гибридизацию и хемилюминесцентную детекцию проводили согласно рекомендации фирмы «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England. В качестве зонда использовали амплификат правого плеча инсерционного элемента 6110 размером 245 п.н.о., [161]. Его выделяли из геля при помощи DNA Extraction Kit («MBI Fermentas», Lithuania). Мечение зонда с помощью ECL системы («Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England) и гибридизацию, проводили согласно рекомендациям фирмы «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England [212]. RFLP-IS 57/0 данные сканировали при разрешении 200 dpi и анализировали с помощью программы GelCompar II (Windows 98, version 2,5; Applied Maths, Belgium). Размеры фрагментов рестрикции определялись по 25 внешним маркерам молекулярных масс с размерами от 700 до 15100 п.н.о. RFLP профили обрабатывались по UPGMA (коэффициент подобия Жаккара, погрешность определения молекулярных масс ±1,0%). В тех случаях, когда качество изображения на фотопленке не позволяло однозначно судить о наличии или отсутствии рестрикционного фрагмента на фоне помех, или различить два рестрикцикционных фрагмента с близкими размерами, исходное изображение подвергалось предварительной одномерной линейной фильтрации. Фильтрация сигнала осуществлялась с помощью специальной программы. Преимуществами такой фильтрации являются её линейность и отсутствие необходимости установления каких-либо субъективных априорных ограничений на амплитуду и форму сигнала [23]. 2.5.2. Метод RFLP-PGRS. 1-1,5 мкг хромосомной ДНК, выделенной, как было описано в разделе 2.5.1., расщепляли эндонуклеазой рестрикции Smal («MBI Fermentas», Lithuania) в течение 4-х часов при 37С. Продукты гидролиза анализировали методом электрофоретического разделения в 1% агарозном геле (Agarose NA, «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England) 1,0 V/см В течение 17 часов. О длине разгона образцов судили по длине пробега бромфенолового синего, который составлял 17 см. ДНК-фрагменты после окрашивания геля бромистым этидием переносили на нейлоновую мембрану («Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England) с помощью вакуумного блоттера (model 785, «Bio-Rad, U.S.A.») в течение 3-х часов при давлении 15 cm/Hg. Гибридизацию и хемилюминесцентную детекцию проводили согласно рекомендации фирмы к ECL системе («Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England). В качестве зонда использовали олигонуклеотид PGRS размером 48 п.н.о. - 5 сдд сдд саа сдд сдд саа сдд сдд сдд сдд саа сдд сдд саа сдд сдд 3 («SYNTOL», Moscow) [175, 218]. Его метили с помощью ECL системе («Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England), согласно рекомендациям фирмы производителя «Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd», England. [175,218].
Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от населения больного туберкулёзом г. Тула
Исследованы штаммы М. tuberculosis, выделенные из образцов мокроты, полученных от больных туберкулёзом из г. Калуга за период 2000-2001 гг. От 50 пациентов выделено по одному и от 6 пациентов - по два штамма с интервалом около трёх месяцев. Всего методом RFLP-IS6770 исследовано 62 штамма. Полученные данные представлены в виде дендрограммы на рисунке 5.
Из данных, представленных на рисунке 5, видно наличие 8 кластеров, содержащих 27 (47,4±12,0 %) штаммов. Четыре из них содержат по два штамма, что составляет 14± 8 % от общего количества исследованных штаммов. Два кластера содержат по три штамма, что составляет 10,5±6,9% от общего количества штаммов. Один кластер - 4 штамма, или 7,0±5,7 % от общего количества штаммов и один кластер - 15 штаммов, или 15,8±10,5 % от общего количества штаммов. Остальные 52,6±12,6 % (п=30) штаммов имеют уникальные RFLP-паттерны.
Из данных, представленных на рисунке 5, видно наличие двух больших групп штаммов. Штаммы одной группы имеют характерные для генотипа AIRFLP-IS6//0 профили. К нему принадлежат 43,8±11,9% (п=20) исследованных штаммов, 30,0±17,0% из которых кластеризованы (рис. 5).
Характерные наборы рестрикционных фрагментов штаммов другой группы указывают на их принадлежность генотипу W. К нему принадлежат 35,1±11,4 % (п=25) исследованных штаммов, 68,0±15,3 % из которых кластеризованы (рис. 5). Штаммы, не относящиеся ни к одному из двух генотипов, составляют 21,1 ±9,5 % (п=12).
Таким образом, в г. Калуга среди населения больного туберкулёзом превалировали штаммы, относящиеся к W (43,8 ±11,9 %) и AI (35,1 ±11,4 %) генотипам. Характеристика штаммов М. tuberculosis, выделенных из образцов мокроты, полученных от больного туберкулёзом населения г. Нижний Новгород.
Исследованы штаммы М. tuberculosis, выделенные из образцов мокроты, полученных от 33 пациентов, больных туберкулёзом Павловского и 38 пациентов - Дзержинского районов г. Нижний Новгород в 2001 году. Всего был выделен 71 штамм. Все они исследованы методом RFLP-IS67/0.
Из представленных на рисунке 6 данных, видно наличие 9 кластеров содержащих 62,0±10,0% (п=44) штаммов. Из них, 4 кластера содержат по два штамма, что составляет 11,3±6,5 % от общего количества исследованных штаммов. Два кластера содержат по 4 штамма (11,3±6,5%), один кластер - 5 штаммов (7,0±5,1 %), один кластер - 8 штаммов (11,3±6,5%) и один кластер - 15 штаммов, или 21,1±8,7% от общего количества штаммов. Остальные 27 штаммов или 38,0±11,0 % имеют уникальные RFLP-IS6770 паттерны.
Из представленных на рисунке 6 данных видно также наличие трёх групп штаммов. Штаммы одной группы имеют характерный набор и среднее арифметическое количество рестрикционных фрагментов на один штамм, равное 11, что указывает на принадлежность их генотипу AI. К нему принадлежат 7 или 9,9±6,1 % исследованных штаммов.
Сорок штаммов другой группы имеют RFLP профили, характерные для генотипа W. К этому генотипу принадлежат сорок штаммов (56,3±10,8 %), из которых 67,5±13,2% кластеризовано (рис. 6).
Штаммы третьей подгруппы имеют коэффициент подобия Sk=0,9 и характерный набор рестрикционных фрагментов ДНК 13000, 6010, 5090, 3230, 2750, 2620, 2180, 1380, 1240, 1150 и 1090 п.о. Среднее арифметическое количество фрагментов на один штамм равно 11. Они были предварительно выделены как Нижне-Новгородская группа (NN-группа) (рис. 6,11).
Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных заключённых тюрем г. Серпухов и пос. Озерки (Тульская область)
Проблема заболеваемости туберкулёзом лиц, отбывающих наказание в местах лишения свободы, продолжает сохранять свою актуальность [48, 60, 61, 71,139, 150, 171]. В России заболеваемость в пенитенциарных учреждениях более чем в 40 раз превышает заболеваемость населения страны [19].
Согласно результатам, полученным методом RFLP-IS6770, из 124 клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от заключённых больных в г. Серпухов, 47,0% относятся к генотипу W. Это согласуется с данными для пенитенциарных учреждений Ивановской области, приводимыми в работе Черноусовой и др. [19]. Однако среди заключённых больных Озерковской тюрьмы наблюдается совсем иная картина. 40,8 % штаммов относятся к генотипу AI и только 39,8 % штаммов имеют генотип W. Сравнивая данные, полученные для двух тюрем с данными для пенитенциарных учреждений Ивановской области, можно отметить уменьшение доли штаммов генотипа W и увеличение доли штаммов с генотипом AI. В Иваново - 62,5 % штаммов от общего числа относится к W генотипу и 25 % - к AI генотипу, в Серпуховской тюрьме - 47,0 % и 27,0 % и в Озерковской тюрьме - 39,8 % и 40,8 %, соответственно [19]. Данные, полученные для Озерковской тюрьмы, позволяют высказать сомнение в очевидности того, что среди контингента больных, находящихся в длительном контакте в ограниченном пространстве, резко возрастает количество штаммов W генотипа [19]. Число штаммов, не принадлежащих к AI и W генотипам для Серпуховской и Озерковской тюрем одинаково и составляет 21,8 % и 19,4 %, соответственно. Это возможно связано с ротацией заключённых, так как при длительном изолированном содержании больных более вероятно ожидать уменьшение разнообразия и превалирование одного или нескольких штаммов возбудителя. Результаты сполиготипирования штаммов полученных от больных из двух тюрем показали, что от каждого второго заключённого больного в Серпуховской и Озерковской тюрьме выделены штаммы, имеющие сполиготип или Beijing или LAM. По литературным данным, высокая частота встречаемости штаммов относящихся к сполиготипу Beijing наблюдается среди заключённых больных туберкулёзом в Бакинской тюрьме (Азербайджан) [61, 163]. В ней штаммы, относящиеся к сполиготипу Beijing, составляют более 70 % от всей выборки. Похожая картина наблюдалась при анализе встречаемости разных сполиготипов клинических штаммов, проведённого в пенитенциарном учреждении г. Иваново, для Северозападного региона России и в Эстонии [7, 8, 9, 19, 128, 185]. Согласно литературным данным, этот генетически высоко консервативный сполиготип впервые был описан в Китае. Он в основном доминирует в Азиатско-Тихоокеанском регионе, на территории Китая и в соседних с ним странах Юго-Восточной Азии, а так же в США [190, 188]. В странах Европы и Карибского бассейна штаммы с этим сполиготипом редки [190, 188, 216]. Кроме того, известно, что к сполиготипу Beijing принадлежат высоко трансмиссивные штаммы генотипа W, обнаруженного в Нью-Йорке в 90-х гг. прошлого века, получившего клональное распространение на территории и за пределами США [28, 41]. Причиной эпидемий туберкулёза на Кубе, в Эстонии и во Вьетнаме, так же были штаммы этого генотипа, и большинство из них обладало множественной лекарственной устойчивостью [128, 148, 185, 238]. Нами также обнаружены два редко встречающихся сполиготипа 000000000003371 и 000000000003731, относящихся к Beijing сполиготипу. Эти сполиготипы ранее описаны у микобактерий, выделенных от больных туберкулёзом на Кубе, в США [190, 191] и в Северозападном Регионе России [8, 9, 146]. Причин доминирования в тюрьмах штаммов сполиготипа Beijing, по всей видимости, может быть несколько. Одна группа причин это социально-экономические: высокая плотность людей в камерах, плохое питание, антисанитарные условия и целый ряд других причин [171]. Другая группа причин связана с биологическими особенностями возбудителя туберкулёза и в частности с особенностями конкретной группы - высокая трансмиссивность штаммов сполиготипа Beijing, а соответственно и W генотипа [33,216].
Второе место, после сполиготипа Beijing, в Серпуховской и Озерковской тюрьмах, занимает сполиготип 777477607760771 или LAM1 (Latino-American and Mediterranean) [81, 183]. В Озерковской тюрьме к нему относится 34% от всех полученных штаммов, а для Серпуховской тюрьмы - 17,8 %. Этот сполиготип распространён в странах Латинской Америки и Средиземного моря [190, 191, 193]. Он так же был обнаружен и описан как специфичный для территории России в г. Санкт-Петербург [9].
Третье место по распространенности среди заключённых больных в Серпуховской и Озерковской тюрьмах занимают штаммы, обладающие сполиготипом LAM9e (777777607760771) [81, 183]. В Серпуховской тюрьме количество вьщеленных штаммов имеющих сполиготип Lam9e составляет 5,6 %, а в Озерковской тюрьме - 13,6 %. Сполиготип Lam9e имеет не установленное происхождение и характерен для стран Южной Америки, где его встречаемость среди больных составляет 9 % [81,190,191].
От заключённых больных тюрьмы г. Серпухов получены штаммы обладающие сполиготипами Haarlem, Haarlem 1 и 2, Т и X. Сполиготип Т часто встречается у штаммов, вьщеленных от больных из стран Африки, Центральной и Южной Америки, штаммы, имеющие сполиготип Haarlem2, встречаются среди больных из стран Центральной Америки и сполиготип Haarleml - из стран Европы [81, 191, 193, 216]. Штаммы с Haarlem сполиготипом впервые были выделены от пациентов, проживающих в г. Гарлем, Голландия [216].
Присутствие штаммов с этими сполиготипами на территории Росссии является подтверждением тому, что туберкулёз — международная проблема и для её решения требуется усилие специалистов разных стран. 4.2. Сравнительный анализ частоты встречаемости штаммов М. tuberculosis разных генотипов, полученных от больных Тулы и заключённых тюрьмы пос. Озерки.
Частоты встречаемости штаммов с генотипом AI, выделенных из образцов мокроты полученных от заключённых больных Озерковской тюрьмы и от больных проживающих в Туле, различны (р 0,01). Это позволяет говорить о различном спектре штаммов возбудителя туберкулёза среди больных Тулы и заключённых больных Озерковской тюрьмы. Причин такой разницы спектра возбудителя среди населения и заключённых больных может быть несколько. Условия жизни граждан и заключённых отличаются. Такие факторы как высокая плотность людей в камерах, плохое питание, антисанитарные условия, специфическая социальная структура, отношение к лечению и т.д. совсем иные в тюрьме, чем на свободе. Миграционные процессы населения отличаются от ротации заключённых в тюрьме [19, 48, 60,61,71,139,150,171].
Кроме того, такая разница состава возбудителя туберкулёза среди населения и заключённых больных может быть объяснена и тем, что штаммы генотипа W с эволюционной точки зрения молодая группа [49, 190, 191]. Они обладают достаточно большой пластичностью, что, по-видимому, в немалой степени способствует их широкому распространению благодаря способности быстро адаптироваться к меняющимся условиям. Помимо этого, хорошо известна устойчивость штаммов этой группы к ряду лекарственных препаратов, что сильно усложняет процесс лечения больных туберкулёзом, вызванной штаммами этой группы [27, 40, 41]. Исследованиями зарубежных учёных показано, что широкое распространение штаммов данного генотипа в ряде стран ассоциировано с массовой вакцинацией населения против туберкулёза, лекарственной устойчивостью А/. tuberculosis и принадлежностью пациентов к определённой возрастной группе до 25 лет, что свидетельствует об активной трансмиссии возбудителя [33, 216]. Вместе с тем существует противоположное мнение о причинах доминирования данного генотипа. Некоторые авторы высказывают предположение о существовании у штаммов W селективных преимуществ, обусловленных их способностью к уклонению от действия факторов иммунной защиты организма, индуцированной BCG, а также пониженной чувствительностью к противотуберкулёзным препаратам [33,216]. Эти и другие причины оказывают влияние на встречаемость штаммов разных генотипов, прямо или косвенно. Поэтому следует ожидать того, что частота встречаемости штаммов возбудителя туберкулёза с разными генотипами среди населения и среди заключённых больных может отличаться [139,171].
Таким образом, нами выявлена разная частота встречаемости штаммов возбудителя туберкулёза с разными генотипами среди больных Тулы и заключённых больных Озерков и высказаны предположения о причинах этих различий.
