Введение к работе
Актуальность проблемы
Туберкулез остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Возбудителем туберкулеза инфицировано около трети населения планеты [Bloom B.R., 2002, Никитин А.В., 2006]. Ежегодно от туберкулеза умирает 3 млн. человек. В Российской Федерации показатель заболеваемости населения туберкулезом составляет около 86 случаев на 100 000 населения [Вартанян Ф.Е. и др., 2007; Цыбикова Э.Б. и др., 2007]. Примерно третья часть от общего числа больных являются бактериовыделителями, т.е. существует огромный резервуар распространителей инфекции [Дмитриев В.А., 2008].
Одной из причин сохранения сложной эпидемической ситуации по туберкулезу является увеличение количества штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к специфическим химиопрепаратам. Особую тревогу вызывает рост числа штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (т.е. одновременно устойчивых к наиболее активным противотуберкулезным препаратам – изониазиду и рифампицину). Туберкулезный процесс, вызванный микобактериями, устойчивыми к данным препаратам, трудно поддается лечению и приводит к развитию хронических форм заболевания [Хоменко А.Г. и др., 1996].
Повсеместное распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза требует пересмотра стандартных схем противотуберкулезной терапии. Для лечения больных туберкулезом наряду с препаратами первой линии (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол, пиразинамид), все чаще применяют новые режимы химиотерапии с использованием препаратов второй линии (протионамид, канамицин, амикацин, капреомицин, циклосерин, рифабутин, ПАСК, офлоксацин). Для достижения эффективных результатов лечения необходимо знание спектра и уровня лекарственной устойчивости клинических штаммов M. tuberculosis к этим препаратам.
При оценке лекарственной устойчивости микобактерий учитывают критические концентрации противотуберкулезных препаратов. Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же лекарственного препарата может быть различна. Значения критических концентраций существенно отличаются и при использовании разных методов определения лекарственной устойчивости [Kim S.J., 2005]. В России для тестирования устойчивости микобактерий к химиопрепаратам традиционно используют метод абсолютных концентраций и плотную яичную питательную среду Левенштейна-Йенсена. В настоящее время используемые в данном методе критические концентрации противотуберкулезных препаратов первой линии определены, тогда как критические концентрации лекарственных препаратов второй линии для M. tuberculosis носят лишь рекомендательный характер и требуют дополнительных исследований с использованием современных клинических штаммов [Приказ № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" М., 2003 г.].
Известно, что при неадекватной химиотерапии в очаге поражения у больного туберкулезом создаются условия для селекции лекарственно-устойчивых микобактерий, что в значительной степени снижает эффективность лечения, увеличивает его стоимость, повышает риск смертельного исхода заболевания. Помимо этого, пациенты, страдающие лекарственно-устойчивым туберкулезом, являются потенциально опасными для окружающих. Поэтому определение спектра и степени устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет большое значение для оптимизации тактики химиотерапии больных туберкулезом, контроля эффективности лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий.
Цель работы
Анализ устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением заболевания, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации.
Задачи исследования
-
Создать панель современных клинических штаммов M. tuberculosis, “предположительно” чувствительных и “предположительно” устойчивых к противотуберкулезным препаратам второй линии: канамицину, капреомицину и офлоксацину.
-
Определить критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемые для оценки лекарственной устойчивости M. tuberculosis методами абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена и пропорций на среде Middlebrook 7Н10.
-
Провести мониторинг штаммов M. tuberculosis, полученных от больных с хронической формой туберкулёза легких, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации, обратившихся за медицинской помощью в течение 2003-2005 гг., для определения устойчивости их к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии.
Научная новизна работы
-
Впервые определены критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода абсолютных концентраций с использованием охарактеризованной микробиологическими и молекулярно-биологическими методами панели современных клинических штаммов M. tuberculosis.
-
Проведен мониторинг устойчивости штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных хронической формой туберкулеза (Центральный и Приволжский регионы, 2003-2005 гг.), к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии.
-
Методом ПЦР-секвенирования в гене pncA выявлены ранее не описанные мутации, детерминирующие устойчивость M. tuberculosis к пиразинамиду.
Практическое значение работы
Разработаны методические рекомендации "Определение критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемых для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций на питательной среде Левенштейна-Йенсена". Данные рекомендации предназначены для использования в научно-исследовательских институтах, проводящих работы по определению лекарственной устойчивости микроорганизмов и разрабатывающих новые методы ее тестирования; в бактериологических лабораториях фармацевтических производственных учреждений, выполняющих работы по определению противотуберкулезной активности лекарственных препаратов.
Разработан универсальный алгоритм, который может быть использован при определении критических концентраций других противотуберкулезных химиопрепаратов. Это особенно важно, так как существуют резервные препараты и ряд препаратов второй линии, для которых показатели критических концентраций остаются пока неизвестными, что ограничивает возможность их использования в клинической практике.
Проведена оценка вклада отдельных мутаций в формировании устойчивости клинических штаммов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии. Полученные данные имеют существенное значение при разработке молекулярно-биологических диагностических систем. Информация о впервые выявленных мутациях в гене pncA внесена в базу данных генетических последовательностей (GenBank).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Критические концентрации канамицина и капреомицина, определенные для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов
M. tuberculosis, равны 50 мкг/мл.
-
Критическая концентрация офлоксацина, определенная для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов M. tuberculosis, равна 3 мкг/мл, для метода пропорций – 2 мкг/мл.
-
Выявлено 15 новых мутаций в гене pncA детерминирующих устойчивость клинических штаммов M. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31ACC, 49CAC, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-A-9, Ins 64-A-65, Ins 86GA-GA-C, Ins 176-ACCG-177, Del 40-45_TG, Del 151-153TT_CC.
-
Среди штаммов M. tuberculosis, выделенных из мокроты больных с хронической формой туберкулеза легких (n=325), проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации в течение 2003-2005 гг., 62,5% штаммов устойчивы к изониазиду, 54,2% – к рифампицину, 61,8% – к стрептомицину, 37,2% – к этамбутолу, 30,5% – к пиразинамиду, 32,3% – к канамицину, 24,0% – к капреомицину и 7,7% – к офлоксацину.
-
Установлено, что устойчивость штаммов M. tuberculosis к изониазиду в 92,1% случаев обусловлена мутациями в гене katG, к рифампицину в 89,2% случаев – в гене rpoB, к стрептомицину в 52,7% случаев – в гене 16SrRNA и в 22,4% – в гене rpsL, к этамбутолу в 75,2% случаев – в гене embB, к пиразинамиду в 100% случаев – в гене pncA, к канамицину в 87,6% случаев – в гене 16SrRNA, к капреомицину в 1,3% случаев – в гене tlyA, к офлоксацину в 96,0% случаев – в гене gyrA.
Апробация работы Результаты работы доложены на: 36-й Международной конференции "Здоровье легких" Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Париж, 2005), II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" (Москва, 2007), Проблемном симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии "Патогенез и контроль распространения лекарственно-устойчивых организмов" (Бангкок, 2008), 5-м конгрессе Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Дубровник, 2009).
Публикации По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе три работы в изданиях, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, включающего 100 работ отечественных и 119 работ зарубежных авторов. Работа содержит 14 рисунков и 15 таблиц.
