Введение к работе
Актуальность работы
В настоящее время туберкулез (ТБ) считается одной из самых опасных инфекционных болезней» распространенных повсеместно» и остается важной причиной гибели людей во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения каждый год в мире регистрируется около 9 млн. новых случаев ТБ, а смертность от ТБ в среднем составляет 1,5-2 млн. человек в год. Около 80% случаев приходятся на Африку (южнее Сахары), Юго-Восточігую Азию и Полинезию, однако ситуация остается сложной и в других частях Земного шара (Ацт А.С., Кондратьева Т.К., 2008). Россия относится к странам с высоким уровнем заболеваемости ТБ.
Единственной разрешенной в настоящее время вакциной от ТБ является вакцина BCG (Bacillus Calmettc-Guerin), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она относительно безопасна, недорога, достаточно эффективно защищает детей от диссеминированного (милиарното) ТБ (Rook G.A.W., 2001), однако не защищает взрослых от легочного ТБ, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и сохранению тяжелой эпидемической ситуации. Кроме того, использование BCG вызывает различные поствакцинальные осложнения.
Один из предлагаемых подходов повышения эффективности вакцинации -схема так называемой «prime-boost» (от англ. поддержка главного) вакцинации, когда для первичной иммунизации («prime») используется вакцина BCG, а для последующих ревакцинаций («boost»), разрабатываемые препараты нового поколения (Bersford В., 2011). Субъединичные генно-инженерные препараты, содержащие протективные антигены микобактерий, представляют большой интерес. Они обладают такими существенными преимуществами как низкая реактогенность, высокая чистота получаемого продукта, а также безопасность для людей с нарушенным иммунитетом. Однако при иммунизации отдельными антигенами для индукции достаточного иммунного ответа необходимы сильные адьюванты, большая часть из которых используется только в
экспериментальных моделях на животных, и пе разрешена для клинического применения.
Mycobacterium tuberculosis - это внутриклеточный патоген, и основная роль в адаптивном иммунитете к ТБ принадлежит клеточным, а не гуморальным факторам защиты (North R.J., 2004). По мнению многих авторов, основными мишенями (иммунодоминатными антигенами) протективного иммунитета являются секреторные белки, присутствующие в культуральном фильтрате М tuberculosis. Среди них наиболее полно охарактеризованы близкородственные белки комплекса Ag85 (Ag85A, В и С), ESAT-6 (Early Secret Antigen Target) и CFP-10 (Culture-Filtrate Protein) (Mustafa A.S., 2002).
Эти белки в настоящее время проходят разные стадии испытаний в качестве кандидатных (Andersen Р., 2005). Однако получение отдельных рекомбннантных антигенов осложнено гетерологичной экспрессией, проблемами с выделением и очисткой. Поэтому разработка подхода, направленного на преодоление перечисленных сложностей при получении компонентов кандидатных субъединичных препаратов, индуцирующих сильный иммунный ответ, представляет научный и практический интерес.
Цель работы: разработка технологии получения рекомбннантных антигенов М. tuberculosis и создание на их основе препаратов, сохраняющих антигенные, иммуногенные и протективные свойства белков. Задачи:
-
Получить рекомбинантные плазмиды, кодирующие последовательности полноразмерных белков CFP-10, ESAT-6, Ag85A М. tuberculosis, и создать штаммы-продуценты на основе Escherichia coli, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых продуктов.
-
Разработать методику выделения, очистки и концентрирования рекомбинантных белков шікобактерий на полисахаридном носителе.
-
Исследовать антигенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков in vitro.
-
Изучить иммуногенные свойства полученных препаратов рекомбинантных белков на полисахаридном носителе у вакцинированных мышей.
-
Оценить протективные свойства полученных препаратов в моделях экспериментального туберкулеза при разных способах заражения.
-
Исследовать эффективность рекомбинантных антигенов в тестировании туберкулезного инфицирования на основе индукции интерферона гамма. Научная новизна
Созданы рекомбинантные плазмиды, кодирующие химерные белки, включающие полноразмерные антигены CFP-10, ESAT-6, Ag85A М, tuberculosis и целлюлозосвязывающий домен (CBD) эндо-1,4-(3-глюканазы CelD микроорганизма Anaerocellum thermophilum. На основе плазмидных конструкций получены эффективные штаммы-продуценты полноразмеркых микобакгериальных антїігенов в составе химерных белков с высоким уровнем синтеза а клетках Е, coli.
Разработана эффективная система выделения, очистки и формулирования препаратов рекомбинантных антигенов на целлюлозной матрице.
Исследованы антигенные свойства химерных белков и подтверждено сохранение ими нативной конформации. Проведено оригинальное многокомпонетное исследование сывороток с препаратами рекомбинантных микобактериаяьных белков.
Получены белково-полисахаридные композиции при иммобилизации химерных белков на аморфной целлюлозе. Изучены их иммуногенные и протективные свойства на инбредкых мышах двух линий: генетически устойчивой к туберкулезной инфекции - C57BI/6 и чувствительных - I/St. Подтверждено сохранение иммуногенных свойств микобактериальных белков в составе исследуемых препаратов. Протективные свойства препаратов не уступали таковым у вакцины BCG.
Практическая значимость работы
Охарактеризованные препараты рекомбинантных микобактериальных
антигенов и полученных иммуногенных белково-полисахаридных комплексов
могут быть использованы при разработке субъединичных препаратов для профилактики ТБ.
При использовании смеси рекомбинантных микобактериальных антигенов ESAT-6 и CFP-10 разработана тест-система определения туберкулезного инфицирования на основе индукции in vitro интерферона гамма (ИФН-у).
Оформлены 4 заявки на патенты на созданные рекомбинантные плазмиды, штаммы продуценты и химерные белки; на способ иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантных белков на целлюлозе; на способ иммобилизации рекомбинантных белков на полистирольных носителях.
Положения, выносимые на защиту
1, Технология аффинных целлюлозосвязывающих доменов, позволяет повысить
устойчивость антигенов М. tuberculosis (CFP-IQ, ESAT-6, Ag85A) к
протеазам, существенно увеличить выход целевого белка, одновременно
осуществлять очистку, концентрирование, иммобилизацию и рефолдинг
целевых белков на поверхности целлюлозосодержащего сорбента.
2. Препараты, полученные на основе рекомбинантных антигенов ЛІ tuberculosis,
сохраняют антигенные, иммуногенные и протективные свойства (в моделях
экспериментального туберкулеза на мышах) при иммобилизации на
полисахаридных носителях и могут быть использованы при разработке
вакцины для профилактики туберкулеза.
Апробация работы
Результаты работы доложены на международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологии в рамках Международного форума по нанотехнологиям в г, Москве 1-3 ноября 2010г.
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий и медицинской микробиологии ФГБУ «НИЙЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 18 февраля 2011г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ; 1 - в сборниках научных ірудов; 1 - в материалах конференции; 4 - патента и заявок на изобретение.
Объем н структура диссертации
Диссертационная работа изложена на // Ґ страницах машинописного текста и включает Введение и 4 главы, Выводы и Список используемой литературы 7у'- источников, из которых $1% отечественных и -ил) иностранных. Работа содержит 21 рисунок, 7 таблиц.
