Введение к работе
Актуальность проблемы. Иммунобиологические препараты — это лекарственные средства, предназначенные для иммунопрофилактики, иммунотерапии и диаітюстики инфекционных и неинфекционных болезней и аллергических состояний. К этим препаратам относятся вакцины, анатоксины, бактериофаги, зубиотики, иммуноглобулины, сыворотки, диагностические препараты, аллергены и др. Для получения таких препаратов могут быть использованы различные способы и методики: химический синтез, выделение из природных источников, синтез при помощи линий эукариотических клеток или клеток микроорганизмов. Перспективным направлением для создания белковых компонентов иммунобиологических препаратов является их синтез с помощью клеток микроорганизмов, в частности - Escherichia coli. Благодаря применению микробиологического синтеза возможно сократить срок разработки и получения нового препарата и значительно снизить его себестоимость. Синтез гетеро логичных белков в клетках бактерий связан с рядом трудностей, основные из которых - это низкий уровень продукции чужеродного белка, нестабильность и сложность его очистки. Решение этих проблем является важной микробиологической и биотехнологической задачей. Одним из подходов, применяемых для повышения уровня продукции целевого белка, его стабилизации и возможности быстрой и эффективной очистки, является технология аффинных доменов [Лунин В.Г., 2006]. Основной принцип данной технологии заключается в получении двухдоменных белков, содержащих в своем составе целевой белок, обладающий биологической активностью, и различные аффинные домены, способные влиять на уровень продукции, растворимость и стабильность целевого белка. Кроме того, технология аффинных доменов позволяет решить другую важную задачу — упростить систему очистки целевого белка и, таким образом, снизить его стоимость [Тегре К., 2003].
В настоящее время с помощью микробиологического синтеза в клетках бактерий возможно получать химерные белки, содержащие аффинные домены и биологически активные пептиды (эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, р-интерферон, костный морфогенетический белок 2).
Основным источником аффинных доменов являются различные микроорганизмы (Anaerocellum thermophilum, Clostridium cellulovorans, Staphylococcus
aureus, Streptococcus mutans, Leuconostoc mesenteroides и др.) Они населяют практически все биологические ниши и способны связывать или синтезировать различные вещества: белки, полисахариды, металлы, нуклеиновые кислоты и т.д. Благодаря широкому разнообразию встречающихся в природе аффинных доменов, полученных из различных микроорганизмов и соответствующих матриц, можно создавать препараты, имеющие важное биологическое значение. Химерный белок будет проявлять специфическую биологическую активность, а носитель, на котором он иммобилизован, может стимулировать иммунный ответ, защищать белок от действия ферментов и биологических жидкостей организма, обеспечивать пролонгированное действие иммобилизованного белка и т.д.
Большой интерес представляет создание рекомбинантных факторов роста, способствующих росту и заживлению тканей. В настоящее время в различных странах, в т.ч. и в России, широко применяются раневые покрытия, содержащие рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека. Такие покрытия показали свою эффективность в клинике. Благодаря их использованию, повреждения кожи заживают путем первичного натяжения без образования рубцов и скорость полного восстановления ткани сокращается в 2-3 раза [Komarcevic А., 2000].
Также рекомбинантные ростовые факторы могут применяться для улучшения существующих и разработки новых систем культивирования клеток млекопитающих. Для этих целей используются эпидермальный ростовой фактор и фактор роста фибробластов, т.к. известна способность этих белков стимулировать рост клеток эукариот in vitro.
Препараты рекомбинантного Р-интерферона в настоящее время применяются в медицине для лечения широкого спектра патологий: различных вирусных инфекций, аутоиммунных заболеваний и злокачественных опухолей [Meager А., 2006].
Для производства рекомбинантного р-интерферона сегодня используются различные системы экспрессии. Получение интерферона с помощью клеток млекопитающих позволяет получить белок, идентичный натуральному, но накопление, выделение и очистка такого белка являются сложным и дорогостоящим процессом. Более того, интерферон является токсичным для клеток-продуцентов, что дополнительно снижает эффективность технологии и повышает стоимость конечного продукта. В свою очередь, рекомбинантный Р-интерферон, синтезированный в
бактериальных клетках, может быть загрязнен токсичными белками и пирогенами клетки-продуцента [Попов В.Ф., 2002]. Благодаря использованию технологии аффинных доменов возможно очистить химерный белок, содержащий р-интерферон, на специфическом сорбенте и получить препарат белка с чистотой более 95%.
Одним из наиболее эффективных методов лечения травм и переломов костей является использование различных биокомпозитов, ускоряющих рост костной ткани. Для улучшения приживаемости металлоконструкций, имплантируемых в организм, их также покрывают композиционными препаратами. Однако не все материалы достаточно биосовместимы, и актуальной проблемой сейчас является создание новых поколений биодеградируемых и биосовместимых покрытий и матриксов, в которые введены биологически активные соединения, обеспечивающие благоприятную среду для восстановления поврежденных тканей.
Новое поколение композиционных препаратов, кроме широко используемых материалов - коллагена и гидроксиапатита, содержит биологически активные белки -факторы роста. Одним из основных факторов роста костной ткани является костный морфогенетический белок 2. Его функции в организме чрезвычайно разнообразны, но основная задача во взрослом организме - поддержание и восстановление костной ткани [Reddi А.Н., 1998]. Введение в состав композиционных препаратов рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 способно сократить время заживления переломов в 2-3 раза, а при обработке металлических имплантатов биосовместимыми покрытиями, содержащими этот белок, снизить вероятность отторжения имплантатов в 3-5 раз [Gautschi О.Р., 2007].
Цель работы: разработка подходов для получения, очистки и иммобилизации биологически активных белков на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов.
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие задачи:
1. Клонирование в клетках Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих ряд аффинных доменов: коллаген-связывающий домен из адгезина микроорганизма Staphylococcus aureus (SAu), коллаген-связывающие декапептиды из фактора фон Виллебранда быка (vWFB) и человека (vWFHi и vWFH2), коллаген-связывающий домен из остеонектина человека (CollBD),
декстран-связывающий домен (DBD) из декстрансахаразы микроорганизма Leuconosioc mesenteroides subsp. Mesenteroides и гены биологически активных белков - цитокинов из организма человека: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), интерферон-р (IFN-P) и костный морфогенетический белок человека 2 (ВМР-2). Выбор оптимальных аффинных доменов для создания химерных конструкций с биологически активными белками.
Создание штаммов Е. coli - продуцентов химерных рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-0 и CollBD-BMP-2.
Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2.
Отработка методов очистки и иммобилизации химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-P и CollBD-BMP-2 на соответствующих сорбентах -желатин-сефарозе для белков, несущих в своем составе коллаген-связывагощий дсмгп к Ссфадсксс для белков, содержащих декстран-связывающий домен.
Разработка методики оценки биологической активности препаратов химерных белков DBD-EGF и CollBD-FGF при культивировании эукариотических клеток in vitro.
Изучение биологической активности in vitro препарата белка DBD-IFN-p, иммобилизованного на Сефадексе.
Изучение биологической активности препарата белка CollBD-BMP-2 in vitro.
Разработка методик изучения и оценки биологической активности препаратов, содержащих рекомбинантный белок CollBD-BMP-2 in vivo.
Часть работы, связанная с получением рекомбинантного белка ВМР-2 и
композиционных препаратов на его основе, выполнялась в рамках государственного
контракта № 02.522.12.2007 от 30 апреля 2008 года, по теме: «Разработка опытно-
промышленных технологий получения гидроксиапатит/коллагеновых
композиционных препаратов/покрытий имплантируемых материалов».
Научная новизна. В результате выполнения работы были впервые получены бактериальные штаммы-продуценты химерных белков, содержащие".
эпидермальный фактор роста человека, соединенный с декстран-связывающим доменом микроорганизма L. mesenteroides; 6
фактор роста фибробластов человека, соединенный с коллаген-
связывающим доменом;
интерфсрон-р человека, соединенный с декстран-связывающим доменом
микроорганизма L. mesenteroides;
костный морфогенетический белок 2, соединенный с коллаген-
связывающим доменом.
При этом достигнут высокий уровень продукции всех перечисленных химерных белков при микробиологическом синтезе, и созданы высокоэффективные системы выделения, очистки и иммобилизации белков на соответствующих сорбентах, основанные на способности аффинных доменов специфически связываться со своим сорбентом. Степень чистоты полученных таким образом белковых препаратов составила более 95%.
Впервые была разработана методика культивирования эукариотических клеток в объеме питательной среды на поверхности Сефадексов, покрытых препаратом рекомбинантного белка DBD-EGF.
Была разработана методика повышения эффективности культивирования эукариотических клеток на поверхности, покрытой коллагеном и обработанной препаратом рекомбинантного белка CollBD-FGF.
Путем микробиологического синтеза была получена биологически активная форма рекомбинантного р-интерферона, по своей противовирусной активности не уступающая доступным коммерческим аналогам.
Впервые в России были получены препараты, содержащие рекомбикантный белок CollBD-BMP-2. Эффективность препаратов на основе данного белка была продемонстрирована в опытах на лабораторных животных и заключалась в ускорении заживления костного дефекта и повышении прочности врастания титановых имплантатов, покрытых химерных белком. Также была показана способность химерного белка CollBD-BMP-2 снижать пейротоксическое действие титановых имплантатов, установленных в череп лабораторным животным.
Практическое значение работы. Полученные в работе аффинные домены могут быть использованы для создания химерных белков, несущих в своем составе различные биологически активные компоненты: цитокины из организма человека, биологическиценные и экономическизначимые белки из различных макро- и
микроорганизмов, бактериальные и вирусные антигены, токсины и т.д. При этом аффинной матрицей для полученных доменов, являются хорошо изученные и разрешенные к медицинскому применению вещества - коллаген и декстран.
На полученные в ходе работы рекомбинантный белок CollBD-CBD, рекомбинантную плазмиду pCollBD-CBD, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка Collbd-CBD и способ получения рекомбинантного белка Collbd-CBD было получено положительное решение о выдаче патента РФ (заявка № 2009144489 от 02.12.2009).
Полученные с помощью микробиологического синтеза в клетках бактерий химерные белки DBD-EGF и CollBD-FGF могут применяться в научной и биотехнологической практике для интенсификации процесса выращивания эукариотических клеток.
Полученный с помощью микробиологического синтеза в клетках Е. coli химерный белок DBD-IFN-P может применяться в медицине и биотехнологии в качестве компонента лекарственных препаратов.
Полученный с помощью микробиологического синтеза в клетках Е. coli химерный белок CollBD-BMP-2 может применяться в научной практике для исследования процессов остеогенеза, а также в медицинской промышленности для создания нового поколения препаратов для восстановления и заживления костной ткани.
На полученные в ходе работы рекомбинантный белок CollBD-BMP-2, рекомбинантную плазмиду pCollBD-BMP-2, штамм Escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 и способ получения рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 было получено положительное решение о выдаче патента РФ (заявка №2009144490 от 02.12.2009).
Положения, выносимые на защиту.
Показана возможность получения химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-P и CollBD-BMP-2 с помощью микробиологического синтеза в клетках Е. coli.
Подобраны оптимальный состав питательной среды, температура и время культивирования микробиологических штаммов-продуцентов химерных
;>: белков, благодаря чему накопление биомассы и выход целевых белков был увеличен в 2-3 раза по сравнению с начальным уровнем.
Применение химерного белка, содержащего эпидермальный фактор роста или фактор роста фибробластов, стимулирует рост клеток эукариот in vitro.
Химерный белок, содержащий в своем составе декстран-связывающий домен и р-интерферон способен защищать эукариотические клетки от инфицирования модельным вирусом in vitro.
Химерный белок, содержащий коллаген-связывающий домен и костный морфогенетический белок 2, индуцирует синтез щелочной фосфатазы в линиях эукариотических клеток С2С12 и СЗШО и стимулирует рост костной ткани у лабораторных животных.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 6-8, октября, 2009), где работа была удостоена I премии. Результаты работы были отмечены медалью конкурса работ молодых ученых, проводимого в рамках пятого международного конгресса Биотехнология 2009: Состояние и перспективы развития (Москва, 16-20, марта, 2009). Кроме этого, результаты работы были представлены на 4-х международных и всероссийских конференциях: Первый международный форум по нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря 2008; Международная конференция «Нанотехнологий в онкологии», Москва, 6 декабря 2008; Всероссийское совещание лБиоматериалы в медицине»; Всероссийская научно-практическая конференция «Применение искусственных кальций-фосфатных биоматериалов в травматологии и ортопедии». Москва, 11-12 февраля 2010.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 4 работы в сборниках тезисов всероссийских и международных конференций. На разработки, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, поданы 2 заявки на патенты РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и
