Введение к работе
Актуальность проблемы. Раскрытие молекулярных механизмов регуляции нейродегенеративных/нейрорегенеративных процессов при травмах головного и спинного мозга, а также различных повреждениях периферических нервов – одна из важнейших проблем современных нейронаук, решение которой связано с разработкой новейших подходов к лечению этих тяжелых состояний. Одним из важных направлений исследований в этой области остается изучение клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе регенерации периферического нерва, понимание которых поможет решить фундаментальные проблемы регенерации нервной ткани.
Выживание нейронов является ведущим фактором, обеспечивающим успешную регенерацию периферического нерва и восстановление функций иннервируемой ткани после его повреждения (Рагинов, Челышев, 2003). Известно, что выживание нейронов зависит от снабжения их нейротрофическими факторами, поставляемыми в том числе иннервируемой тканью. Зрелые чувствительные нейроны проявляют способность выживать после аксотомии и потери связи с иннервируемой тканью. Более того, эти клетки могут находиться in vitro при полном отсутствии в питательной среде нейротрофических факторов (Lindsay et al., 1994), в отличие от эмбриональных чувствительных нейронов, которым нейротрофическая поддержка необходима для выживания (Davies, 2000; Middleton et al., 2000), как и активация ядерного транскрипционного фактора NF-B.
Многочисленные молекулярные и клеточные изменения в спинномозговых ганглиях после повреждения периферического нерва изучены достаточно глубоко (Baldwin, 1996; Koliatsos, Price, et al., 1996). Особое внимание в настоящее время уделяется исследованию процессов, происходящих в клетках на молекулярном уровне и включающих индукцию транскрипционных факторов, регулирующих последующую активацию и транскрипцию специфических генов регенерации.
Было обнаружено, что стимулирующим фактором при регенерации периферического нерва может служить развитие воспалительной реакции вокруг перикарионов нейронов спинномозговых узлов (Lu, Richardson, 1991), молекулярные механизмы которой связаны в том числе с индукцией цитокинов, таких, как интерлейкин-6 (Murphy et al., 1999), фактор некроза опухоли альфа (TNF-) (Schafers et al., 2003) и др. Ядерный транскрипционный фактор NF-B является классическим мессенджером, регулирующим каскады реакций, связанные с различными цитокинами и клеточной гибелью.
Со времени открытия NF-B (Sen and Baltimore, 1986) и его роли медиатора апоптоза в клетках иммунной системы (Beg et al., 1995) ученые активно изучали его функции и в нервной системе. В последние годы наблюдается стремительный рост числа работ, посвященных его участию в процессах развития, пластичности, нейродегенерации и травмы (Mattson, Camandola, 2001). Однако его роль в выживании зрелых нейронов ЦНС оказалась противоречивой. Так, было обнаружено, что ингибирование NF-B в нейронах переднего мозга приводит к их апоптозу в результате нейротоксического поражения (Fridmacher et al., 2003), а в кортикальных нейронах может предотвратить апоптоз при экспериментальной ишемии мозга (Herrmann et al., 2005).
В нейронах спинномозговых ганглиев NF-B исследовали для выявления его потенциальной нейропротекторной роли после травмы периферического нерва (Doyle, Hunt, 1997; Fernyhough et al., 2005). Зрелые чувствительные нейроны по своей природе относительно устойчивы к апоптозу, вызванному перерезкой периферического нерва (Koliatsos, Price, 1996). В противоположность этому гибель нейронов происходит гораздо быстрее после травмы в эмбриональном или раннем постнатальном периоде (Whiteside et al., 1998). Нейропротекторная роль NF-B в зрелых чувствительных нейронах описана в экспериментах на культуре спинномозговых нейронов in vitro (Fernyhough et al., 2005). Однако сложность этого фактора обусловливает противоречивость заключений о сигнальных путях NF-B в поврежденных нейронах.
До настоящего времени все еще дискутируется (Memet, 2006) вопрос о роли NF-B в процессах контроля выживаемости и гибели нейронов после травмы периферического нерва в условиях in vivo. Это отчасти связано с тем, что сложно четко разграничить in vivo два не исключающих друг друга потенциальных механизма действия NF-B: непрямое влияние на нейроны, опосредованное активацией NF-B в глиальных клетках, или непосредственное участие этого фактора в регуляции активности нейрональных генов. В существующих генетических линиях нокаутных мышей не происходит инактивации гена NF-B в каком-то одном типе клеток, что делает невозможным разделение дейстия NF-B в глиальных клетках и нейронах (Pasparakis et al., 2006). В связи с этим возникла необходимость генерировать трансгенную линию мышей, в которых активность NF-B ингибирована исключительно в зрелых нейронах, для дальнейшего изучения функциональной роли нейрональной NF-B.
Цели исследования. Цель настоящей работы – изучить биологическую роль ядерного транскрипционного фактора NF-B и молекулярных механизмов, регулирующих его активность в зрелых нейронах спинальных ганглиев после травмы периферического нерва.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач.
1. Выяснить, повышается ли посттравматическая экспрессия NF-B-зависимых генов MCP-1 (monosyte chemoattractant protein-1) и IB (inhibitor of NF-B) в зрелых нейронах спинальных ганглиев in vivo и при стимуляции культуры чувствительных нейронов провоспалительными цитокинами (TNF-) in vitrо.
2. Провести анализ ДНК-связывающей активности NF-B в посттравматических нейронах in vivo и при стимуляции культуры чувствительных нейронов TNF- in vitro.
3. Создать трансгенную линию мышей с модифицированной активностью транскрипционного фактора NF-B in vivo специфически в зрелых нейронах и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий.
4. Изучить на трансгенной модели животных биологический эффект ингибирования нейрональной активности NF-B, оказываемый на основные физиологические параметры и посттравматическую выживаемость зрелых чувствительных нейронов.
5. Выявить транскрипционную активность NF-B в зрелых чувствительных нейронах in vivo и in vitro с использованием трансгенной линии репортерных мышей NF-B/LacZ.
6. Определить регуляторное влияние процессов ацетилирования на активацию сигнальных путей NF-B в нейронах спинальных ганглиев трансгенных мышей репортерной линии NF-B/LacZ in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Посттравматические молекулярные изменения зрелых чувствительных нейронов крыс породы Вистар включают в себя изменения уровня экспрессии ряда NF-B –зависимых генов и ДНК –связывающей активности NF-B in vivo и in vitro.
2. Созданная генетически модифицированная линия мышей Thy*IB-SI проявляет специфическую нейрональную экспрессию суперингибитора NF-B.
3. Травма седалищного нерва in vivo и стимуляция культуры чувствительных нейронов TNF- in vitro вызывает транслокацию р65 иммунореактивности в ядро нейронов у мышей дикого типа, в то время как трансгенная линия Thy*IB-SI мышей проявляет пониженную способность NF-B к перемещению в ядро при повреждении периферического нерва in vivo и активации цитокинами in vitro.
4. Трансгенное ингибирование активности NF-B в зрелых нейронах модифицированных мышей не влияет на основные физиологические параметры и посттравматическую выживаемость зрелых чувствительных нейронов in vivo.
5. Мониторинг экспрессии репортерного гена в NF-B/LacZ трансгенной линии мышей, отражающей реальную транскрипционную активность NF-B, показывает ее отсутствие как в интактных, так и в посттравматических нейронах спинномозговых ганглиев in vivo, в отличие от нейронов ЦНС.
6. Активность сигнальных путей NF-B в чувствительных нейронах регулируется процессами ацетилирования/деацетилирования, и отсутствие влияния NF-B в зрелых нейронах спинальных ганглиев объясняется процессами деацетилирования, подавляющими транскрипционную активность ядерного фактора.
Научная новизна. Несмотря на обилие в мировой литературе данных, показывающих важную роль ядерного транскрипционного фактора B (NF-B) в процессах нейродегенеративных состояний нервной системы, публикации, посвященные практическим вопросам создания и экспериментального применения моделей животных с генетически модифицированной активностью NF-B специфически в зрелых нейронах, единичны. До настоящего времени это единственная трансгенная модель, в которой целенаправленно ингибируется активность NF-B в зрелых нервных клетках in vivo. Для создания модели Thy*IB-SI была использована мутантная форма ингибитора NF-B – IB-SI, которая не подвержена деградации и поэтому действует как супер-репрессор NF-B активности, удерживая и изолируя в цитоплазме каждый NF-B/RelA комплекс, предотвращая связывание с ДНК и активацию транскрипции. Результаты анализа показали, что ген мутантной формы ингибитора NF-B успешно экспрессируется исключительно в нейронах трансгенных мышей. Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что Thy-1.2-промотор, под регуляторным действием которого находится ген суперингибитора NF-B, активируется строго специфически в зрелых нейронах трансгенных мышей на 8 день постнатального развития и не затрагивает механизмы нейронального развития.
С помощью созданной нами модели впервые показано, что трансгенное репрессирование NF-B не влияет на основные физиологические свойства чувствительных нейронов in vivo, а также на их количество в спинномозговых ганглиях в норме и не ведет к изменениям выживаемости нейронов после травмы периферического нерва in vivo.
В данной работе предлагается также новый подход к регистрации транскрипционной активности NF-B in vivo с использованием трансгенной репортерной линии мышей NF-B/LacZ. Полученные данные впервые показывают, что даже при активации NF-B-ДНК-связывающей активности в чувствительных нейронах, реальная транскрипционная активность может быть репрессирована действием гистоновых деацетилаз.
Практическое и теоретическое значение работы. Важность данной работы для фундаментальной науки и практической медицины обусловлена необходимостью понимания молекулярных и генетических программ, контролирующих процессы выживаемости нейронов и нейрональной регенерации. Результаты исследования позволяют расширить представления о сложноорганизованной системе регуляции транскрипционного фактора NF-B в чувствительных нейронах. Выявленный молекулярный механизм, опосредованный гистоновыми деацетилазами объясняет транскрипционную репрессию NF-kB в нейронах спинномозговых ганглиев, что позволяет говорить об ограничении функций NF-kB in vivo в зрелой ПНС в отличие от таковых в ЦНС.
Результаты наших исследований указывают на необходимость дальнейших изысканий в области раскрытия роли транскрипционных механизмов в нейрональной репарации. Так, необходимо более детально изучить процессы ацетилирования/деацетилирования гистонов в чувствительных нейронах, в частности их участие в регенерации.
Использование созданной линии мышей Thy*IB-SI в экспериментальных моделях травмы, стресса и др. дает широкую возможность для изучения биологической роли NF-B в зрелых нейронах как центральной, так и периферической нервной системы.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры гистологии и эмбриологии педиатрического факультета Российского государственного медицинского университета, кафедры гистологии Московской медицинской академии им. Сеченова, и служат обоснованием для продолжения исследования молекулярных механизмов регуляции нейродегенеративных/нейрорегенеративных процессов при травмах периферического нерва, а также головного и спинного мозга.
Апробация работы. Материалы работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях, в том числе на William Harvey Day Conference (Queen Mary’s School of Medicine and Dentistry, University of London (Великобритания, Лондон, 2003, 2004, 2005), международной конференции Society for Neuroscience, 34th Annual Meeting San Diego (США, Сан-Диего, 2004), Всероссийской конференции «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (Самара, 2008), международной конференции «Проблемы современной морфологии человека» (Москва, 2008), VI съезде ВНОАГЭ (Саратов, 2009)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ в отечественной и зарубежной печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы, включающего 345 источников. Работа иллюстрирована 45 рисунками и 5 таблицами.
