Введение к работе
Актуальность проблемы
Индуцируемые транскрипционные факторы ответственны за изменение профиля экспрессии генов, приводящее к оптимальному по силе и продолжительности клеточному ответу. Одним из ключевых факторов такого рода является NF-kB, участвующий в регуляции множества физиологических реакций. Сложная роль факторов NF-kB в иммунитете часто описывается в рамках двух сигнальных путей, т.н. классического и альтернативного, в которые вовлечены димеры NF-kB различного субъединичного состава и которые активируют различные наборы генов. Классический (или канонический) сигнальный путь активируется разнообразными рецепторами врожденного и адаптивного иммунитета, включая Toll-подобные рецепторы, антигенные рецепторы лимфоцитов и рецепторы провоспалительных цитокинов, и ведет к транскрипционной активации и продукции цитокинов, хемокинов, адгезионных молекул и ряда ферментов, участвующих в воспалительных реакциях. Альтернативный NF-kB путь, прежде всего, активируется рецепторами, принадлежащими суперсемейству TNFR. Лиганды к ряду рецепторов TNFR1 семейства способны активировать оба сигнальных каскада, однако именно альтернативный NF-kB путь в первую очередь отвечает за развитие и поддержание структуры лимфоидных органов и за ответ приобретенного иммунитета. Трудно переоценить важность получения научных знаний в данной области для медицины, так как система NF-kB задействована абсолютно во всех процессах, связанных с активацией иммунитета (как врожденного, так и приобретенного). Кроме того, NF-kB является важнейшим антиапоптотическим фактором клеток млекопитающих, что обусловливает интенсивное изучение системы NF-kB в онкологическом контексте. Альтернативный NF-kB путь был открыт недавно и еще не изучен подробно, в частности, на данный момент не известно, что определяет специфичность его действия, т.е. активацию определенного набора генов, отличающегося от такового, характерного для активации классического пути. Простым и изящным объяснением такого рода специфичности могло бы стать дифференциальное связывание различных ДНК-последовательностей димерами NF-kB разного субъединичного состава. Ключевыми исполнительными транскрипционными факторами в классическом и альтернативном сигнальных NF-kB каскадах являются гетеродимерные комплексы RelA/p50 и RelB/p52, соответственно, причем для
последнего не описан консенсус сайта связывания. Поэтому актуально определение консенсусной последовательности связывания транскрипционного фактора RelB/p52 и ее сравнение с таковой для комплекса RelA/p50. Кроме того, гены-мишени альтернативного NF-kB пути выявлены в основном исходя из анализа генетических моделей, и молекулярные аспекты регуляции их транскрипции практически не известны. Поэтому актуально изучение структуры регуляторных областей таких генов, в частности, гена хемокина CXCL13 (также известного как BLC).
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение таких аспектов транскрипционной регуляции через альтернативный NF-kB путь, как вклад узнавания ДНК гетеродимерами NF-kB различного состава в определение специфичности действия альтернативного NF-kB пути по сравнению с классическим, и потенциальные кофакторы и/или белки-партнеры, участвующие в регуляции генов-мишеней альтернативного NF-kB пути. Были поставлены следующие задачи:
Разработать систему получения функциональных комплексов полноразмерных зрелых белков группы NF-kB с возможными модификациями, свойственными эукариотическим клеткам.
Провести отбор последовательностей, специфически связывающих RelB/p52 in vitro, из пула случайных последовательностей (Random Site Selection). Использовать полученные последовательности для определения консенсуса связывания гетеродимерного фактора ReIB/p52.
Оценить способность комплексов RelB/p52 и RelA/p50 к дифференциальному узнаванию последовательностей, полученных при выполнении предыдущей задачи.
Методом последовательного дробления перекрывающихся фрагментов ДНК и тестирования данных фрагментов на способность к связыванию белковых факторов in vitro локализовать потенциальные регуляторные области в проксимальной области промотора гена схсІІЗ. Оценить функциональную активность обнаруженных потенциальных регуляторных элементов in vivo (в системе с геном-репортером).
Научная новизна
Подобраны условия получения функциональных комплексов полноразмерных зрелых белков семейства NF-kB путем гиперэкспрессии в эукариотических клетках. Полученные данным способом гетеродимерные функциональные комплексы белков были использованы для отбора из пула случайных последовательностей молекул ДНК, связывающих с высокой аффинностью транскрипционный фактор RelB/p52, который является «исполнительным» фактором при активации альтернативного NF-kB пути. Это позволило впервые установить консенсус связывания RelB/p52 in vitro. Консенсусная последовательность 5'-GGGRVWTTYY (где R = А или G; Y = С или T; W = T или А; V = А, С или G) оказалась близка к классическому консенсусу Rel/NF-kB, и в наибольшей степени схожа с известным консенсусом связывания гомодимерного фактора RelA/RelA. Кроме того, все последовательности, отобранные по своей способности связывать комплекс RelB/p52, со сравнимой аффинностью узнавали также RelA/p50. Таким образом, впервые установлено, что гетеродимерные комплексы RelA/p50 и RelB/p52 in vitro не демонстрируют значимых различий в предпочтениях к последовательности ДНК в участке связывания. При исследовании структуры проксимальной области промотора гена-мишени альтернативного NF-kB пути хемокина CXCL13 мыши обнаружены два новых потенциальных регуляторных сайта: сайт связывания факторов группы NF-kB и Spl. Впервые показано, что в регуляции базальной транскрипции гена хемокина CXCL13 может принимать участие транскрипционный фактор Spl.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на 7-й Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии, Суздаль, 31 ноября - 2 декабря 2004 г.; на конференции Keystone Symposia, "NF-kappaB: 20 Years on the Road from Biochemistry to Pathology" (D3) Fairmont Banff Springs, Banff, Alberta, March 23-28, 2006; на конференции "11* internetional TNF conference", May 13-16, 2007, Asilomar, CA, USA. Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах группы «Онкоиммунология» ИМБ РАН.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано три статьи и три тезиса конференций.
Структура и объем диссертации
![Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена](/i/i/4712/570538.png "Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена Чанышев Михаил Дамирович")