Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Гены бактерий, участвующие в клубенькообразовании 12
1.2. Основные подходы изучения генетического контроля развития и функционирования симбиоза у растений 13
1.3. Основные этапы развития симбиоза 14
1.4. Функционирование клубенька 18
1.5. Организация азотфиксирующих клубеньков 22
1.5.1. Морфология и организация азотфиксирующих клубеньков... 22
1.5.2. Строение недетерминированного клубенька 23
1.5.3. Эффективные и неэффективные клубеньки 27
1.6. Генетический контроль симбиотических признаков у бобовых 29
1.6.1. Межвидовой и межсортовой полиморфизм по клубенькообразованию и азотфиксации 29
1.6.2. Получение индуцированных мутантов бобовых 31
1.6.3. Особенности проявления симбиотических генов 32
1.6.4. Индуцированные мутанты бобовых 33
1.6.5. Мутанты гороха 34
1.7. Основные регуляторные системы, контролирующие формирование бобово-ризобиального симбиоза 37
1.7.1. Эволюция специфичности образования бобово-ризобиального симбиоза 37
1.7.2. Нитратное ингибирование клубенькообразования у бобовых 38
1.8. Заключение 42
Глава 2. Материал и методы 45
2.1. Материал 45
2.2. Методы 48
2.2.1. Приготовление электронно-микроскопических препаратов... 48
2.2.2. Статистическая обработка данных электронной микроскопии 49
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани сортов гороха 52
3.1.1. Сорт Рондо 52
3.1.2. Сорт Рамонский 77 57
3.1.3. СортТорсдаг 60
3.1.4. Межсортовые различия ультраструктурной организации бактероидсодержащей ткани 62
3.2. Ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани у мутантов с отсутствием и пониженным уровнем азотфиксации 64
3.2.1. Мутант К287 64
3.2.2. Мутант К15а 68
3.2.3. Структурный анализ формирования бактероидсодержащей ткани у мутантов с отсутствием и пониженным уровнем азотфиксации 72
3.3. Ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани у суперклубеньковых мутантов 76
3.3.1. Влияние суперклубеньковых мутаций на организацию бактероидсодержащей ткани 83
3.4. Действие полных доз нитратов на формирование клубеньковой бактероидсодержащей ткани 87
3.5. Сравнение организации бактероидсодержащей ткани у суперклубеньковых мутантов и сорта Торсдаг, имеющих разный генетический контроль регуляции нодуляции 88
3.6. Морфометрический анализ ультраструктурной организации бактероидсодержащей ткани 91
3.7. Связь ультраструктурной организации азотфиксирующей ткани с эффективностью азотфиксации 94
Заключение 99
Выводы 102
Список литературы 103
- Основные подходы изучения генетического контроля развития и функционирования симбиоза у растений
- Генетический контроль симбиотических признаков у бобовых
- Ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани у мутантов с отсутствием и пониженным уровнем азотфиксации
- Действие полных доз нитратов на формирование клубеньковой бактероидсодержащей ткани
Введение к работе
Актуальность проблемы. Биологическая азотфиксация является одним из глобальных процессов, обеспечивающих возможность существования современных форм жизни на Земле. Усвоение значительной части атмосферного азота обеспечивается симбиозами бактерий рода Rhizobium с высшими растениями из семейства Fabaceae Lindl. (Newton, 1994). Возникновение и последующее развитие такого бобово-ризобиального симбиоза является результатом
І) сопряженной эволюции клубеньковых бактерий и бобовых растений (Проворов,
19966). Формирование бобово-ризобиального симбиоза тесно связано со многими
фундаментальными процессами жизнедеятельности растений
цитодифференцировкой и органогенезом, азотным и углеродным обменом, защитой от патогенов и регуляцией развития. В настоящее время показано, что формирование симбиоза, определяющее азотфиксирующую активность, контролируется генами обоих партнеров, в отношении которых обнаружены
v сложные регуляторные взаимодействия (Проворов, 1996а, 19966; Gresshoff, 1985).
Это позволяет рассматривать симбиоз бактерий рода Rhizobium с высшими растениями из семейства Fabaceae Lindl. как биологическое сообщество, обладающее единой системой регуляции на генном уровне (Тихонович, Проворов, 1998; Gresshoff, Caetano-Anolles, 1992). Однако до недавнего времени при изучении симбиотической азотфиксации основное внимание исследователей уделялось
микросимбионту, т.е. клубеньковым бактериям (Fisher, 1994). Если результаты
молекулярно-генетического анализа открыли возможности генно-инженерного
конструирования перспективных штаммов бактерий, то роль бобового растения в
формировании симбиоза остается относительно слабо изученной. Установлено, что
гены растения оказывают воздействие на основные события в процессе
формирования и функционирования симбиоза, определяют способность к
образованию клубеньков, их число на растение, клеточную и внутриклеточную
%) организацию азотфиксирующей ткани (Caetano-Anolles, Gresshoff, 1991).
Ч/tf
[
Эффективное изучение образования и функционирования симбиоза требует проведения комплексных исследований, затрагивающих самые разные стороны
формирования симбиоза, включая биохимические, молекулярно-биологические, генетические и морфологические аспекты. Проведение таких исследований возможно лишь при использовании широкого набора современных методов анализа и создании модельных систем для изучения особенностей формирования и функционирования эффективного симбиоза. В настоящее время получена коллекция мутантов гороха, характеризующихся измененным типом формирования симбиоза с клубеньковыми бактериями (Tsyganov, et al., 1998). Эти мутанты были успешно использованы для идентификации генов растений, ответственных за формирование и развитие симбиоза. Показано, что развитие симбиоза представляет собой многоступенчатый процесс, во время которого у растения происходит сложная цепь морфогенетических и биохимических изменений. Изучение эффекта симбиотических мутаций позволило разделить процесс развития симбиоза на несколько отдельных этапов, каждый из которых контролируется одним или несколькими генами растения (Tikhonovich et al., 1995). Создана классификация мутантов, основанная на структурном анализе процесса формирования симбиоза (Борисов и др., 1998; Morzhina et al., 2000).
Однако, несмотря на то, что бобово-ризобиальный симбиоз является удобной моделью для изучения процесса азотфиксации, генетики симбиоза, механизмов взаимодействия высших растений с микроорганизмами (Werner, 1992; Тихонович, Проворов, 1998), особенности морфогенеза азотфиксирующей ткани и генетический контроль этого процесса до настоящего времени остаются еще недостаточно изученными. Неполной остается классификация симбиотических мутантов, для части мутаций слабо изучены их фенотипические проявления, точно не выявлены симбиотические стадии, которые они модифицируют (Борисов и др., 1998). Следовательно, получение индуцированных мутантов и изучение фенотипического проявления мутаций и в настоящее время остается актуальной задачей.
Следует отметить, что изучение бобово-ризобиального симбиоза имеет и большое практическое значение, т.к. ряд бобовых, например, соя, люцерна, горох, арахис, относятся к числу важных сельскохозяйственных культур. Повышение эффективности азотфиксации у растений ряда сельскохозяйственных культур
существенно для обогащения почв "биологическим" азотом. Одним из путей повышения такой эффективности является создание и использование доноров для проведения селекции бобовых по этому признаку (Werner, 1995; Сидорова и др., 20016). Некоторые симбиотические мутанты гороха могут рассматриваться в качестве таких потенциальных доноров. Однако, полноценная оценка перспективности их использования возможна только при выяснении механизмов проявления конкретных мутаций с учетом плейотропных эффектов, которые могут проявляться на разных уровнях и этапах формирования растений. Нередко они
Р- приводят к изменению морфологии растений, структуры клубенька (количество
зараженных клеток в клубеньке), ультраструктуры азотфиксирующей ткани (Борисов и др., 1998; Сидорова, Шумный, 19996).
В ИЦиГ СО РАН создана уникальная коллекция симбиотических мутантов гороха (Сидорова, Шумный, 19996). Логичным и актуальным продолжением этих исследований является детальное изучение влияния мутаций на формирование азотфиксирующей ткани в корневых клубеньках симбиотических мутантов гороха
} и изучение влияния морфологических особенностей формирования
бактероидсодержащей ткани на эффективность азотфиксации.
Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования было изучение взаимосвязи между ультраструктурной организацией клубеньков и эффективностью азотфиксации. Для достижения этой цели использовали электронно-микроскопический и морфометрический анализ азотфиксирующей ткани клубеньков различных сортов и симбиотических мутантов гороха.
Задачи настоящего исследования состояли в следующем:
1. Изучить ультраструктуру бактероидсодержащей ткани из разных зон клубенька
у мутантов гороха, различающихся по активности азотфиксации: К287 с
неэффективными клубеньками, К15а со слабой азотфиксацией,
суперклубеньковых мутантов nod3, Kl la, К22а, К301.
2. Провести сравнительный анализ ультраструктурной организации
| бактероидсодержащей ткани у суперклубеньковых мутантов и исходных сортов
гороха, а также бактероидсодержащей ткани устойчивых к нитратам
суперклубеньковых мутантов (nod3, nod4, nod6) и сорта Торсдаг {Nod5),
* имеющих разный генетический контроль регуляции клубенькообразования.
Сравнить изменения морфологической организации бактероидсо держащей ткани у сортов гороха и их мутантов под действием полных норм азота.
Провести статистический анализ участков ткани из средней части зоны азотфиксации у сортов и симбиотических мутантов и оценить различия между эффективным и неэффективным симбиозом.
Научная новизна и практическая ценность. Полученные результаты
! вносят существенный вклад в понимание взаимосвязи между эффективностью
азотфиксации и ультраструктурной организацией клубенька. В результате
проведенных исследований было показано, что у сортов и их мутантов,
образовавших эффективные клубеньки, развитие и ультраструктурная организация
бактероидсодержащей ткани не имели структурных нарушений. С помощью
структурного анализа процесса развития симбиоза у сортов и мутантов,
образовавших неэффективные клубеньки и клубеньки с пониженным уровнем
У азотфиксации, были выявлены стадии модификации формирования
бактероидсодержащей ткани и структурные отклонения в организации зрелой азотфиксирующей ткани. У мутанта с неэффективными клубеньками была нарушена стадия Bad (дифференцировка бактероидов), у мутанта со слабоэффективными клубеньками структурные изменения организации ткани выявлены на стадии Nop (поддержание структурно-функциональной стабильности клубеньков). Впервые показано сходство в организации ультраструктуры клубеньков у форм с разным генетическим контролем нодуляции, но одинаково устойчивых к нитратам (сорт Торсдаг (Nod5) и суперклубеньковые мутанты (nod3, nod4, nod6).
Изучение влияния ультраструктурной организации бактероидсодержащей
ткани клубенька на эффективность азотфиксации имеет важное значение для
оценки и повышения азотфиксирующей способности бобовых культур. На основе
І изученных симбиотических мутантов была предложена модель для определения
эффективности бобово-ризобиального симбиоза в полевых и вегетационных
опытах (Сидорова и др., 2001а). Изучение симбиотических мутантов играет важную роль в создании доноров для селекции.
Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на: Отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 1999),
XVIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000).
Основные материалы опубликованы в бі-ти печатных работах в отечественных журналах и сборниках.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, полученных результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 149 источников, в том числе 114 на иностранных языках. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, иллюстрирована 13 сводными рисунками.
Основные подходы изучения генетического контроля развития и функционирования симбиоза у растений
Участие растений в клубенькообразовании) и функционирований] симбиоза изучается с помощью разных подходов. Генетический подход основан на изучении мутантов, дефектных по способности формировать клубеньки и фиксировать азот. Симбиотические мутанты выделяют путем анализа генетического полиморфизма дикорастущих и сортовых популяции (спонтанная изменчивость) и путем экспериментального мутагенеза (Борисов и др., 1998). Изучение спонтанных и индуцированных симбиотических мутантов позволяет выявить разные спектры симбиотических генов растений. Спонтанные мутации, как правило, приводят не к полной инактивации генов, их фенотипическое проявление может быть супрессировано при изменении генотипа микросимбионта или внешних условий. Индуцированные мутанты обычно возникают в результате полной инактивации генов. К настоящему времени у ряда видов бобовых растений выявлено более 80 генов, участвующих в становлении и функционировании симбиоза (Борисов и др., 1998). Наибольшее число симбиотических мутантов получено у гороха {Pisum sativum L.). Молекулярно-генетический подход анализа дифференциальной экспрессии растительных симбиотических генов включает сравнение белковых спектров в корнях и клубеньках, идентификацию корневых и клубеньковых мРНК и продуктов их трансляции в системе in vitro, создание и сравнение библиотек клонов кДНК (полученных при обратной транскрипции мРНК) из корней и клубеньков.
Белки, обнаруживаемые в клубеньках и корнях бобовых, могут быть ) разделены на несколько групп: клубенек-специфичные белки; белки, присутствующие как в корнях, так и в клубеньках, однако в последних их синтез значительно усилен; белки, конститутивно синтезируемые как в корнях, так и в клубеньках (Кравченко и др., 1998, Fedorova et al., 2002). Белки, синтезируемые только в клубеньках и отсутствующие в корнях, были названы нодулинами (van Kammen, 1984). Проведенный анализ состава белков у некоторых бобовых, например, горох, соя, фасоль, люцерна, показал, что при ) образовании и работе симбиоза синтезируется 20-30 новых полипептидов с молекулярной массой 15-120 кДа (Кравченко и др., 1998). Нодулины разделили на ранние и поздние в зависимости от времени экспрессии в клубеньке (Nap, Bisseling, 1990). К ранним относят белки, синтезируемые с момента заражения растений ризобиями до окончания формирования клубенька. Синтез поздних нодулинов индуцируется в сформировавшихся клубеньках при начале азотфиксации. . Основные этапы развития симбиоза Преинфекционная стадия. Для того чтобы растения и бактерии вступили во взаимодействие, они должны "узнать" друг друга. Корни растений выделяют определенные вещества, действующие на бактерии. К таким веществам относятся аминокислоты, полисахариды, органические кислоты, флавоноиды (Lugtenberg et al., 1995; Long, 2001). Органические кислоты, аминокислоты и сахара привлекают ризобий к корням растения. Далее идет обмен опознавательными сигналами.
Сигнальными молекулами бобовых являются специфичные для каждого вида ризобий флавоноиды, индуцирующие переход бактерий из свободного в симбиотическое состояние. Ризобий синтезируют ответные сигнальные молекулы, названные Nod-факторами, которые участвуют в индукции начальных стадий клубенькообразования. Nod-факторы являются продуктом экспрессии бактериальных nod-генов. Nod-факторы представляют собой модифицированные липоолигосахариды, несущие различные группы, определяющие хозяйскую специфичность молекул, т.е. узнавание бактерий растением. Обычно каждый вид ризобий заражает ограниченное число видов растений (Mylona et al., 1995; Perret et al., 2000; Hirsch, 2001). ?) С помощью растительных лектинов и бактериальных полисахаридов бактерии прикрепляются к дистальным концам корневых волосков, вызывая их деформацию (Long, 2001; van Rhijn et al., 2001). Одновременно бактериальные Nod-факторы индуцируют начальные стадии образования клубеньков. У многих видов ризобий Nod-факторы были выделены и определена их структура. Использование Nod-факторов позволило подробно изучить самые ранние стадии клубенькообразования (Mylona et al., 1995; Schultze, Kondorosi, 1998). Ь У Vicia sativa L. (вика) охарактеризовали в деталях процесс деформации корневого волоска, обрабатывая корни растения очищенными Nod-факторами. Деформация корневых волосков происходит только в маленькой зоне корня, затрагивая молодые корневые волоски, только что достигшие взрослого размера (Heidstra et al., 1994). Процесс деформации начинается с набухания кончиков волосков, далее происходит новый рост набухших кончиков, оканчивающийся видимой деформацией волосков в интервале трех часов. Морфологическим изменениям предшествуют деполяризация плазматической мембраны, изменения в распределении кальция, перестройка актиновых филаментов (Ehrhardt et al., 1992; Wais et al., 2002). Инфекционная стадия.
После присоединения бактерий к кончикам корневых волосков, кончики плотно завиваются, и бактерии оказываются заключенными в витки. В месте скручивания происходит локальный гидролиз растительной стенки, инвагинация плазматической мембраны в клетку корневого волоска и образование вокруг мембраны новой растительной стенки (Kijne, 1992). Все эти события приводят к формированию трубчатой структуры внутри волоска, называемой инфекционной нитью, с помощью которой бактерии проникают в растение (Newcomb, 1981). Ультраструктура стенки инфекционной нити очень похожа на таковую нормальной стенки растительной клетки, но включение определенных белков растений может придавать ей уникальные свойства (Scheres et al., 1990). Инфекционная нить растет к основанию волоска и достигает слоя внешних кортикальных клеток (Mylona et al., 1995). Одновременно с формированием инфекционной нити корневые кортикальные клетки, расположенные напротив нити, начинают делиться, формируя клубеньковый примордий. Инфекционные нити растут к примордию и, доходя до него, высвобождают бактерии в цитоплазму клеток примордия. У бобовых, происходящих из умеренных широт, таких как горох, клевер, люцерна, примордиальные клубеньки возникают из внутренних кортикальных клеток, и, следовательно, при формировании клубеньков инфекционные нити должны пересечь внешний кортикальный слой (Mylona et al., 1995). До проникновения инфекционной нити клетки внешнего кортикального слоя подвергаются морфологическим изменениям: ядро движется к центру клетки, микротрубочки и цитоплазма перестраиваются, образуя радиально-ориентированную коническую структуру, цитоплазматический мостик. Инфекционные нити пересекают кортикальные клетки через радиально направленные цитоплазматические мостики (van Brussel et al., 1992). Проходя через внешние кортикальные клетки, инфекционные нити ветвятся, а бактерии внутри нитей активно делятся. В то время как инфекционные нити движутся внутрь корня, продолжается рост клубенькового примордия. Несколько клеточных слоев в дистальной части примордия составляют меристему недетерминированного клубенька. Из меристемы образуются разные ткани клубенька. Инфекционные нити проникают в клетки меристематического центра и инфицируют их бактериями. Часть клеток остаются незараженными, они, предположительно, участвуют в процессах переноса веществ внутри клубенька (Postma, 1990). В местах выхода бактерий стенка инфекционной нити разрушается с помощью ферментов, выделяемых и растением, и бактериями (Basset et al., 1977).
Генетический контроль симбиотических признаков у бобовых
Высокий уровень межсортового полиморфизма бобовых по симбиотическим признакам происходит из-за большого полиморфизма по симбиотическим признакам природных популяций и видов бобовых (Проворов, 19966). Приобретение способности к симбиотрофному питанию азотом само по себе не приводит к общему увеличению экологической пластичности растений, так как в этом случае возрастает их зависимость от наличия в почве комплементарных штаммов ризобий, а также от условий, необходимых для формирования эффективного симбиоза. Вследствие этого наиболее жизнеспособными являются І популяции бобовых, полиморфные по способности использовать различные источники азота. Кроме того, в природных условиях бобовые должны взаимодействовать с генетически гетерогенными, быстро меняющими свою структуру популяциями ризобий, что могло приводить к выработке специальных Ч механизмов поддержания полиморфизма растительных популяций по генам, контролирующим формирование симбиоза (Проворов, 19966). В последнее десятилетие наметилась четкая тенденция перехода от изучения межсортового полиморфизма к выявлению у бобовых симбиотических генов, контролирующих нодуляцию и азотфиксацию. JJ Удобным объектом для изучения генетики симбиотических признаков у бобовых растений, особенно у самоопыляющихся видов, являются индуцированные мутанты. Для получения индуцированных мутантов семена обрабатываются физическими (например, гамма-излучение) или химическими мутагенами (Postma, 1990).
При химической обработке наиболее часто используется алкилирующий агент этилметансульфонат (EMS). Отбор симбиотических мутантов обычно проводится во втором поколении, где ! ) выявляются и доминантные, и рецессивные генотипы. Растения выращиваются на двух фонах минерального питания: с азотом и без азота. Это обусловливается тем, что минеральный азот, особенно в нитратной форме, угнетающе действует на образование и функционирование клубеньков. Выращивание растений на разных фонах минерального питания позволяет идентифицировать как чувствительные, так и устойчивые к нитратам формы. На основе отобранных мутантов получают изогенные линии, отличающиеся одной мутацией от родительского типа (Сидорова, Шумный, 1999а). Отбор бесклубеньковых мутантов или мутантов с измененным количеством клубеньков проводится визуально по числу клубеньков. Отбор мутантов с ! нарушенной азотфиксацией проводится первично по цвету клубеньков (белые или почти белые клубеньки). Далее клубеньки растений проверяются на способность ! редуцировать ацетилен. Редукция ацетилена (С2Н2) в этилен (С2Н4) катализируется нитрогеназой и является часто используемым методом для определения активности нитрогеназы (Postma, 1990). Симбиотические мутанты являются хорошим объектом для морфологического, физиологического и биохимического изучения симбиоза. На основе полученных мутантов создаются коллекции форм растений с нарушениями различных этапов развития симбиоза. Для определения места экспрессии мутантных генов в растении обычно используется метод реципрокных прививок: корни (или стебли) от мутанта соединяются с нормальными стеблями (или корнями) в химерном растении. Генетический анализ на наследование и тесты на аллелизм позволяют D, идентифицировать мутацию. Проведенное к настоящему времени картирование симбиотических генов гороха показало, что они присутствуют в каждой хромосоме этого вида (Weeden et al., 1996). 1.6.3. Особенности проявления симбиотических генов При анализе симбиотических мутантов исследователи сталкиваются с некоторыми особенностями в проявлении симбиотических признаков. Изучение ) симбиотических мутантов в разных условиях выращивания показало, что для многих из них характерны варьирующая пенентрантность и экспрессивность. На проявление и степень выражения мутантных признаков влияют генетический фон, факторы внешней среды, такие как наличие в субстрате азота, главным образом в нитратной форме, температура и др. (Сидорова, Ужинцева, 1992; Lie, Timmermans, 1983; Takahashi et al., 1995). Результаты гибридологического анализа разных типов симбиотических мутантов показали, что большинство симбиотических мутаций являются моногенными, рецессивными, с плейотропным эффектом (Сидорова, Ужинцева, 1992; Gresshoff et al., 1985; Sagan et al., 1994). Плейотропия часто затрагивает форму стебля или корня, а иногда и то и другое одновременно. Генетический контроль бобово-ризобиального симбиоза со стороны растения сложен и многообразен. Кроме основных генов, детерминирующих к) симбиоз, у растения много генов, влияющих на количественную сторону процесса азотфиксации. К таковым, например, относятся гены, контролирующие фотосинтез, длину вегетационного периода, реакцию растения на фотопериод и минеральный азот и так далее. Поэтому, для изучения генетического контроля симбиотических признаков у бобовых в качестве объекта могут быть использованы многие морфологические мутанты (Сидорова, Шумный, 19996). индуцированные мутанты бобовых разделили на несколько групп (Sagan et al., 1994). Бесклубеньковые мутанты (nod") возникают чаще остальных мутантов. У nod" мутантов нарушение образования клубеньков может происходить на разных стадиях пред- и раннего инфекционного процесса.
Есть мутанты, которые вообще не реагируют на присутствие клубеньковых бактерий, у других мутантов в присутствии клубеньковых бактерий происходит набухание корневых волосков, но нет закручивания и инфекции. Есть мутанты, которые только в определенных условиях формируют малочисленные клубеньки, а также есть температуро- и штамм-специфичние мутанты бобовых (Сидорова, Шумный, 1999а). К настоящему времени найдено 14 генов, контролирующих f) бесклубеньковость. Некоторые из них влияют на строение корня и корневого волоска (Postma, 1990; Schneider et al., 2002). Мутанты с неэффективными клубеньками (fix") встречаются реже, чем бесклубеньковые. У таких мутантов нодуляция обычно такая же, как у исходного сорта, но клубеньки белого цвета и отсутствует азотфиксация. Электронномикроскопические исследования показали, что в ультраструктуре тканей неэффективных клубеньков есть существенные изменения по сравнению с І] исходным сортом (Моржина и др., 1991). Суперклубеньковые мутанты (nod44-) являются наиболее редкими. У этих мутантов число клубеньков в несколько раз превышает число исходного сорта. Клубеньки мелкие и расположены по всей корневой системе. Отличительной чертой суперклубеньковых мутантов является их устойчивость к нитратам (Carroll, Mathews, 1990). Суперклубеньковые мутанты получены у разных бобовых культур: гороха (Jacobsen, Nijdam, 1983; Сидорова, Шумный, 1998), сои (Day et al., 1986), фасоли (Park, Buttery, 1989), люцерны (Penmetsa, Cook, 1997). В целом суперклубеньковые мутанты имеют более низкие уровни специфичной нитрогеназной активности (на единицу массы клубеньков) и более низкий сухой вес растений по сравнению с исходными сортами (Day, et al., 1986). Суперклубеньковые мутанты гороха и сои также характеризуются повышенным формированием боковых корней, что говорит о плейотропном эффекте этих мутаций и возможном гормональном дисбалансе этих растений (Carroll, Mathews, 1990). К настоящему времени у гороха посевного (Pisum sativum L.) получено более 200 симбиотических мутантов, идентифицировано более 30 симбиотических генов (Morzhina et al., 2000). У части мутантов проведено детальное изучение фенотипического проявления мутаций и выявлены стадии развития симбиоза, которые нарушаются мутациями.
В результате появляется возможность разделить развитие симбиоза на элементарные этапы, каждый из которых контролируется определенными генами растения. Бесклубеньковые мутанты (nod"). Бесклубеньковые мутанты делят на мутанты, которые никогда не образуют клубеньки, и мутанты, которые при определенных условиях среды могут образовывать клубеньки (температурозависимые, штаммспецифичные). Иранская форма гороха не образует клубеньки при температуре 20С, но при 26С клубеньки образуются нормально. Доминатный ген, ответственный за температурозависимую устойчивость к нодуляции гороха был назван Syml (Lie, 1971). Между некоторыми формами гороха и определенными штаммами Rhizobium существует природная устойчивость к образованию клубеньков. Афганская форма гороха не образовывает клубеньков при инокуляции штаммами клубеньковых бактерий, выделенными из европейских сортов гороха. Ген, ответственный за штамм-специфичность, был назван syml (Holl, 1975; Young, 1985). У афганской формы гороха были выявлены другие гены, определяющие штамм-специфичную бесклубеньковость: sym4, sym6 (Lie, Timmermans, 1983). У мутантов, не способных ни при каких условиях образовывать клубеньки, могут быть нарушены разные стадии инфекционного процесса: деформации
Ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани у мутантов с отсутствием и пониженным уровнем азотфиксации
Зона заражения состоит из мелких клеток, содержащих инфекционные нити (рис. 6, А). Инфекционные нити заполнены бактериями, содержащими хорошо видимый фибриллярный нуклеоид, темные и светлые гранулы мелкого и среднего размера. Вышедшие из инфекционных нитей бактерии окружены плазмалеммой группами по несколько штук. В цитоплазме клетки видны пластиды, митохондрии, пластинковидный ретикулум четко не выражен. В зоне дифференцировки зараженные клетки средней величины содержат бактероиды величиной с бактерию, лежащие группами по несколько штук в ПБП (рис. 6, Б). Бактероиды имеют структуру матрикса, похожую на структру матрикса у бактерий. Большая часть бактероидов содержат включения среднего размера -гранулы запасного вещества ПОМ, вакуоли. Симбиосомы лежат среди тяжей электронно-плотной цитоплазмы. В верхней части зоны азотфиксации крупные зараженные клетки заполнены мелкими бактероидами, лежащими группами по несколько штук в ПБМ (структура ткани такая же, как на рис. 6, Б). Часть бактероидов содержат включения среднего размера. Симбиосомы лежат среди тяжей электронно-плотной цитоплазмы. В средней части зоны крупные зараженные клетки заполнены мелкими бактероидами, лежащими большими группами в ПБП (рис. 6, В). ПБП сильно расширенные. Часть бактероидов содержат включения среднего и крупного размера - гранулы запасного вещества ПОМ, вакуоли. Некоторые ПБМ разрушаются. Среди симбиосом располагаются маленькие участки электронно-плотной цитоплазмы. У мутанта существуют ультраструктурные отличия бактероид со держащей ткани по сравнению с исходной линией. В зоне заражения вышедшие из нитей бактерии лежат по несколько штук в каждом перибактероидном пространстве, в цитоплазме клубеньковой клетки не выражен характерный пластинковидный ЭР.
В зоне дифференцировки не происходит увеличения размеров бактероидов и изменения структуры их матрикса. В течение всего процесса формирования ткани бактероиды накапливают запасное вещество ПОМ. В зоне азотфиксации происходит разрушение перибактероидных мембран, расхождение внутренних и внешних бактериальных оболочек у бактероидов. В зоне заражения клетки содержат инфекционные нити, заполненые бактериями с четно выраженным фибриллярным нуклеоидом и мелкими темными и более крупными светлыми гранулярными включениями (рис. 7, А). Вышедшие из нитей бактерии лежат группами по несколько штук в ПБП. Некоторые бактерии содержат светлые гранулы среднего размера, предположительно запасное вещество ПОМ. Цитоплазма клубеньковой клетки выражена плохо. В зоне дифференцировки зараженные клетки средней величины содержат мелкие бактероиды (рис. 7, Б). Часть бактероидов лежат группами в ПБП, окруженные ПБМ, другая часть бактероидов лежат без ПБМ. Некоторые бактероиды содержат включения среднего размера - гранулы запасного вещества ПОМ, вакуоли. Цитоплазма клеток имеет фибриллярную структуру, содержит обрывки ПБМ. В верхней и в средней части зоны азотфиксации крупные зараженные клетки содержат мелкие бактероиды, лежащие по отдельности в цитозоле растительной клетки (рис. 7, В). Бактероиды не имеют ПБМ, часть бактероидов содержат включения среднего и крупного размера - гранулы запасного вещества ПОМ, вакуоли. У бактероидов видно расхождение внутренней и внешней бактериальных мембран. Цитоплазма клетки содержит остатки ПБМ, не содержит клеточных органелл. В данном варианте структурные нарушения формирования бактероид со держащей ткани такие же, как и в варианте без нитратов. Но в варианте с нитратами в зоне азотфиксации произошло быстрое разрушение перибактероидных мембран, и уже в средней части зоны бактероиды лежат без перибактероидных мембран, а в варианте без нитратов в средней части зоны азотфиксации перибактероидные мембраны еще не разрушены. В результате проведенного анализа можно сделать вывод, что нарушение формирования симбиоза у мутанта К287 произошло на стадии выхода бактерий из инфекционных нитей и дифференцировки бактероидов. Нитратное питание ускорило процесс деградации симбиосом в зараженных клетках в зонах дифференцировки и азотфиксации. В зоне заражения клетки содержат инфекционные нити, заполненные бактериями, имеющими матрикс повышенной электронной плотности (рис. 8, А). Вышедшие из нитей бактерии лежат в цитоплазме клеток, по отдельности окруженные ПБМ. Цитоплазма клубеньковой клетки содержит рибосомы, пластинковидный эндоплазматический ретикулум, митохондрии, пластиды. В зоне дифференцировки зараженные клетки средней величины содержат бактероиды удлиненной неправильной формы, по размеру крупнее бактерий (рис. 8, Б). Каждый бактероид окружен ПБМ. Бактероиды имеют диффузный хроматиноподобный матрикс. Симбиосомы лежат в цитоплазме клетки, имеющей грануллярно-фибриллярную структуру, содержащей ЭР, пластиды, митохондрии. В верхней части зоны азотфиксации крупные зараженные клетки содержат округлые бактероиды (рис. 8, В). Каждый бактероид окружен ПБМ. Бактероиды имеют диффузный хроматиноподобный матрикс, некоторые содержат светлые округлые включения. В средней части зоны крупные зараженные клетки содержат округлые бактероиды, по размерам крупнее бактерий (рис. 8, Г). Каждый бактероид Л окружен ПБМ. Бактероиды имеют диффузный, хроматиноподобный матрикс.
Большая часть бактероидов содержат светлые округлые крупные включения, предположительно вакуоли или гранулы запасного вещества ПОМ Симбиосомы лежат довольно разреженно в цитоплазме, имеющей фибриллярную структуру. У мутанта в зоне дифференцировки бактероиды увеличиваются в размере и в процессе размножения и роста постепенно приобретают округлую форму. Зона клеток, заполненных крупными удлиненными бактероидами неправильной формы, отсутствует. Зараженные клетки зоны азотфиксации содержат бактероиды округлой формы. Уже в верхней части зоны азотфиксации часть бактероидов содержат гранулы запасного вещества ПОМ или вакуоли, а к середине зоны большая часть бактероидов имеют гранулы запасного вещества ПОМ или вакуоли. Формирование бактероидсодержащей ткани мутанта К 15а, выращенного на среде с полной нормой нитратов ) Зона заражения состоит из мелких клеток, содержащих инфекционные нити (рис. 9, А). Инфекционные нити заполнены бактериями, содержащими фибриллярный нуклеоид, темные и светлые мелкие гранулы. При выходе из инфекционных нитей бактерии окружаются плазмалеммой по 1-2 штуки. Цитоплазма клубеньковой клетки содержит рибосомы, митохондрии, пластиды, пластинковидный ЭР четко не выражен. В зоне дифференцировки зараженные клетки средней величины содержат бактероиды, величиной с бактерию, лежащие по 1-4 штуки в ПБП (рис. 9, Б). Матрикс бактероидов напоминает матрикс бактерий, часть бактероидов содержат включения - гранулы запасного вещества ПОМ, вакуоли. Цитоплазма клубеньковой клетки представлена в виде электронно-плотных тяжей. В верхней части зоны азотфиксации крупные зараженные клетки содержат мелкие бактероиды, лежащие группами по несколько штук в ПБМ (рис. 9, В). Часть I бактероидов содержат крупные включения. Симбиосомы имеют расширенные ПБП. Часть ПБМ имеет нарушенную структуру. В средней части зоны крупные
Действие полных доз нитратов на формирование клубеньковой бактероидсодержащей ткани
Действие полных доз нитратов на формирование клубеньковой бактероидсодержащей ткани Нитратное ингибирование нодуляции является общим явлением у бобовых. Наличие отчетливых различий между видами бобовых, между сортами и линиями внутри видов по чувствительности к нитратам и отсутствие отчетливых закономерностей показывают, что механизм нитратного ингибирования нодуляции может быть многогранным. Нитраты влияют на все изученные стадии развития симбиоза: на начальных стадиях развития симбиоза уменьшается число образующихся клубеньков, на поздних стадиях происходит нарушение процесса азотфиксации и быстрое старение клубеньков (Carrol, Mathews, 1990). В нашем эксперименте растения были выращены на двух вариантах питания - со стартовой дозой и с полным нитратным питанием. Мы имеем возможность сравнить влияние полных доз нитратов на формирование бактероидсодержащей ткани у изучаемых сортов и мутантов. У исходных сортов
Рондо и Рамонский 77 в варианте с нитратами образовались неэффективные клубеньки, нарушения формирования бактероидсодержащей ткани произошли на стадии дифференцировки бактероидов, т.е. на ранней стадии развития симбиоза. В средней части зоны азотфиксации большинство перибактероидных мембран уже были разрушены, т.е. наблюдалась быстрая деградация бактероидсодержащей ткани. У мутанта со сниженным уровнем азотфиксации К 15а в варианте с нитратами нарушения формирования бактероидсодержащей ткани произошли на той же стадий, что у сортов Рамонский77 и Рондо, стадии дифференцировки бактероидов. У мутанта с I неэффективными клубеньками К287 действие мутации проявилось на более ранней стадии развития симбиоза (выхода бактерий из инфекционных нитей), чем действие нитратов у исходного сорта Рамонский 77 (стадии дифференцировки бактероидов). Небольшое различие развития бактероидсодержащей ткани у мутанта К287 в разных вариантах выращивания заключалось в том, что при выращивании растений на среде с нитратами в средней части зоны азотфиксации ъ большинство перибактероидных мембран уже было разрушено, а в варианте без нитратов, большая часть ПБМ еще сохранилась (рис. 6, 7). Та же особенность наблюдалась и в белых клубеньках у мутанта К301 (рис. 12). Полученные результаты позволяют сделать вывод, что эффект нитратов на формирование бактероидсодержащей ткани у чувствительных к азоту линий и мутантов проявился на стадии дифференцировки бактероидов, нитраты ускорили процесс деградации бактероидсодержащей ткани даже в неэффективных симбиозах. і) 3.5.
Сравнение организации бактероидсодержащей ткани у суперклубеньковых мутантов и сорта Торсдаг, имеющих разный генетический контроль регуляции нодуляции У всех суперклубеньковых мутантов, выращенных на среде с нитратами, ультраструктура бактероидсодержащей ткани не отличалась от растений, выращенных на среде без нитратов, и соответствовала ультраструктуре эффективного симбиоза. Следовательно, у изучаемых в данной работе суперклубеньковых мутантов, так же как и у описанных ранее суперклубеньковых мутантов гороха нарушены два ранних регуляторных механизма - авторегуляции клубенькообразования и нитратного ингибирования азотфиксации. Все известные суперклубеньковые мутации являются моногенными рецессивными мутациями, следовательно, нарушение обоих механизмов произошло в результате единственного мутационного события. Проявление эффекта суперклубеньковых мутаций является свидетельством координированной регуляции у мутантов двух механизмов: саморегуляции и нитратного ингибирования нодуляции. Недавно был идентифицирован и локализован на хромосомной карте новый ген, названный nod5, доминантная аллель которого контролирует обильную нодуляцию и высокую азотфиксацию (Сидорова и др., 1999). Сорт Торсдаг является гомозиготным по гену Nod5. Сорт Рамонский 77 несет рецессивную аллель гена nod5. Сорта Торсдаг и Рамонский77 контрастно различаются по устойчивости к нитратам. При выращивании Рамонский 77 на среде с нитратами образовались неэффективные клубеньки. Доминантная аллель гена nod5 определяет нитрат-устойчивость сорта Торсдаг, у которого, следовательно, нарушен лишь один регуляторный механизм, механизм нитратного ингибирования азотфиксации. У сорта Торсдаг образуется среднее количество крупных клубеньков в верхней части корня (система авторегулирующего контроля нодуляции работает с высокой эффективностью). У суперклубеньковых мутантов образуется большое количество мелких клубеньков по всему корню (система авторегулирующего контроля нодуляции работает с низкой эффективностью). В специально проведенных опытах было показано, что в одном организме эти генетические системы функционируют независимо одна от другой (Сидорова, Шумный, 19996).
Для этого суперклубеньковые мутанты, несущие мутантные аллели nod3 и nod4, скрестили с сортом Торсдаг (Nod5). При анализе расщепления в гибридах F2 были выделены растения, на корнях которых образовались клубеньки двух типов - очень мелкие, равномерно расположенные по всей корневой системе, как у мутантов, и более крупные, расположенные в верхней части корней, как у сорта Торсдаг. На основе генетических исследований, был сделан вывод, что у сорта Торсдаг и суперклубеньковых мутантов nod3 и К301 inod4) функционируют две независимые регуляторные системы, контролирующие нодуляцию. Следовательно, суперклубеньковые мутанты и сорт Торсдаг могут использоваться, как две разные модели для изучения ранних регуляторных механизмов клубенькообразования. Разные системы могут по-разному влиять на формирование азотфиксирующей ткани в клубеньке. Показатель азотфиксации на один клубенек у сорта Торсдаг превышает примерно в 3-4 раза аналогичные показатели сортов Рамонский 77 и Рондо и суперклубеньковых мутантов (Сидорова, Шумный, 1999а; Сидорова и др., 20016). При выращивании Торсдаг на среде с нитратами и без нитратов ультраструктура бактероидсодержащей ткани образовавшихся клубеньков была сходной и соответствовала ультраструктуре, характерной для эффективных клубеньков гороха. В клубеньках были хорошо выражены слои клеток с обеими формами дифференцированных бактероидов.
Клетки с бактероидами удлиненной неправильной формы занимали верхнюю часть зоны азотфиксации, а клетки с округлыми бактероидами занимали среднюю и нижнюю часть зоны. И у суперклубеньковых мутантов, и у сорта Торсдаг сформировалась эффективная бактероидсодержащая ткань при выращивании на среде с нитратами и без, но в строении зоны азотфиксации клубенька были различия. У сорта Торсдаг были хорошо выражены клеточные слои с обеими формами дифференцированных бактероидов. У суперклубеньковых мутантов слои клеток с одной из форм бактероидов были редуцированы. Так как клубеньки у сорта Торсдаг крупнее, чем у суперклубеньковых мутантов, можно предположить, что различия в показателе азотфиксации могут быть следствием и структурных различий клубеньков, и различий в строении зоны азотфиксации. Следовательно, различия в ранних регуляторных системах, контролирующих клубенькообразование, не повлияли на формирование симбиоза, но, определили структурные различия клубеньков, в том числе, предположительно, строение зоны азотфиксации в клубеньке (Болоболова и др., 2000а; Болоболова, Байбородин, 2000).
