Введение к работе
Актуальность. Онкологические заболевания занимают третью строку в списке заболеваний человека, имеющих неблагоприятный прогноз. Стандартный подход к лечению рака представляет собой физическое удаление опухолевой массы и многократные курсы циторедуцирующей терапии. При этом часто остаточные опухолевые клетки рассредоточиваются по организму и формируют новые очаги опухолевой ткани. Одной из основных характеристик опухоли является ее способность подавлять активность иммунной системы, и тем самым создавать условия для беспрепятственного распространения по организму. В этой связи перспективным в борьбе с раком на разных этапах его развития является возможность активировать противоопухолевый иммунитет.
Важнейшим направлением в современной хлинической практике лечения онкологических заболеваний является постредукционная иммунотерапия опухолей, связанная с активацией противоракового иммунитета. Существует два основных подхода к индукции противораковой активности иммунной системы: 1) in vivo адьювантная терапия с использованием пептидов, содержащих известные раковые антигены; 2) ex vivo активация профессиональных свойств антигенпрезентирующих дендритных клеток (ДК) с одновременным введением рахового антигепа и последующей реинфузией пульсированных дендритных клеток в организм онкологического больного. Оба подхода связаны с активацией дендритных клеток и либо с индукцией иммунного ответа непосредственно в организме больного, либо с получением высокоспецифических дендритноклеточных вакцчн.
В современной мировой практике описано несколько препаратов, стимулирующих дендритные клетки и влияющих на формирование противоракового адаптивного иммунитета. К хорошо известным препаратам относятся липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий (Cowdery et al., 1996; Hartmann, Krieg, 1999) и препараты ДНК на основе CpG-олигонуклеотидов (Hartmann, Krieg, 1999; Krieg et al, 1995; Pulendran, 2005). В последнее время установлено, что двуцепочечная ДНК (дцДНК) также приводит к созреванию дендритных клеток и индуцирует гуморальный и клеточный иммунитет (Barber, 2011; Kawai, Akira, 2011). При этом охарактеризованы сигнальные пути, запускающие иммунный ответ клетки на появление в цитоплазме фрагментов дцДНК (Barber, 2011; Vilaysane, Muruve, 2009).
Настоящая работа посвящена исследованию противоракового действия препарата на основе дцДНК человека в сочетании с химиотерапевтическими цитостатнческими препаратами на мышиные опухоли и его влияния на антигенпрезентирующие дендритные клетки.
Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение роли фрагментированной экзогенной двуцепочечной ДНК в индукции
противоракового иммунитета в экспериментальных условиях. Основными задачами, которые необходимо было решить в рамках настоящего исследования, были следующие:
-
Определить влияние препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в сочетании с кросслинкирующим цитостатическим препаратом циклофосфаном на рост экспериментальных опухолей мыши и на иммунную систему экспериментальных животных, в частности, на дендритные клетки.
-
Исследовать влияние препарата фрагментированной ДНК человека на активацию аптигенпрезентирующих свойств дендритных клеток на примере экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток человека.
-
Подобрать условия использования препарата геномной ДНК человека в сочетании с клиническими цитостатическими препаратами доксорубицином и циклофосфаном, оптимальные для проведения успешной противораковой терапии экспериментальных опухолей.
Научная новизна. 1) Впервые установлено, что обработка мышей с привитыми оіг/холями цитостатиком циклофосфаном в сочетатга с препаратом фрагментированной геномной двуцепочечной ДНК человека размером 200-6000 и.о. приводит к достоверному торможению роста экспериментальных опухолей мыши. При этом совместное введение цитостатиков доксорубицина и циклофосфана в сочетании с препаратом ДНК подавляет рост сформированной опухоли достигшей размера более 1 см3, а в случаях недавно перевитых онухолевых клеток в количестве до 300 тыс. полностью прекращает рост опухолевого графта. Обнаружено, что развивающийся противораковый эффект сопровождается увеличением содержания во фракции мононуклеаров периферической крови экспериментальных животных цитотоксических клеток, обладающих специфической активностью против клеток оігухоли-графта.
2) Добавление фрагментов двуцепочечной ДНК человека в культуру экстракорпорально сгенерированных дендритных клеток приводит к активации их профессиональных свойств. При этом происходит конечное созревание дендритпых клеток, индуцируется продукция ими цитокинов ТЫ пути, увеличивается аллостимуляторная активності, дендритных клеток, приводящая к пролиферации Т-лимфоцитов в смешанной культуре лимфоцитов.
Положения, выносимые на защиту. 1) Инъекции экзогенной двуцепочечной ДНК человека на фоне инъекций цитостатиков циклофосфана и доксорубицина приводят к достоверному усилению регрессирующего действия цитостатиков на рост экспериментальных опухолей мыши.
2) Вакцинация мышей зрелыми дендритными клетками, стимулированными к созреванию препаратом фрагментированной ДНК человека, приводит к достоверному торможению роста прививаемого опухолевого трансплантата.
3) Препарат фрагментировапной геномной ДНК человека индуцирует усиление аллостимуляторной активности культуры дендритных клеток человека, что приводит к увеличению доли цитотоксическігх перфорин-содержащих Т-лимфоцитов в смешаїшой культуре лимфоцитов.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований явились базой для разработки стратегии лечения рака молочной железы и ее применения в исследованиях второй фазы клинических испытаний препарата па основе двуцепочечлой ДНК человека («Панаген»), основанных на совместном применении программной полихимиотерапии по схемам FAC (циклофосфан+доксорубиции+фторурацил) и АС (циклофосфан+доксорубицип).
Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летаю со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (21-27 июня 2009 года, Москва), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (10-14 апреля 2010 года, Новосибирск), международной конференции Annual Main Meeting of Society for experimental Biology (1-4 июля 2011 года, Глазго, Великобритания), международной конференции 7th European Course and 11th Euroconference of ISAC-ICCS-ICyS-ESCCA Joint Meeting (13-17 сентября 2011 года, Дублин, Ирландия).
Публикации. Всего - 24, по теме диссертации - 10, из них 5 статей в рецензируемых зарубежных журналах, 5 тезисов на российских и международных конференциях.
Вклад автора. Основные результаты были получены автором самостоятельно. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством К.М.Н. Николина В.П. и к.б.н. Поповой Н.А. (ИЦяГ СО РАН). Работы с дендритными клетками человека проводились при участии д.м.н. Леплиной О.Ю. и к.м.п. Сахно Л.В. (НИИКИ СО РАМН), с дендритными клетками мыши - Ефремова Я.Р. (ИЦиГ СО РАН) и Решетниковой Е.С. (ИМКБСОРАН).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глаз (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 31 рисунок и 8 таблиц.
