Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблемы морфологии и патофизиологии заживления хронических кожных ран интенсивно изучаются в современных исследованиях по хирургии, иммунологии и дерматовенерологии. При регенерации кожной раны запускается каскад различных иммунологических факторов, одним их которых является интерлейкин-1(3 (ИЛ-1р) - многофункциональный цитокин. ИЛ-ір обладает широким спектром эффектов на различные клетки, включая клетки эпителия кожи. При регенерации эпителия кожи ИЛ-ір обеспечивает миграцию лейкоцитов в область раны и активирует нейтрофилы в зоне воспаления. Кроме того, ИЛ-1р может стимулировать рост соединительной ткани, вызывая пролиферацию фибробластов, а также способствовать эпителизации, регулируя пролиферацию кератиноцитов (Thornton et al., 1990; Chedid et al., 1994, Maas-Szabowski et al., 2000). ИЛ-ір инициирует продукцию других провоспалительных цитокинов. Своё влияние на кератиноциты ИЛ-ір способен осуществлять как посредством связывания с комплементарным рецептором I типа на поверхности кератиноцита, так и опосредованным путем за счет стимуляции продукции фактора роста кератиноцитов фибробластами после активации рецептора ИЛ-1 I типа на поверхности фибробласта (Werner, 1994; Grewe, 1996; Maas-Szabowski et al., 2000).
Хотя способность ИЛ-ip положительно влиять на заживление ран была хорошо изучена in vitro, всего несколько работ опубликовано об эффекте аппликации ИЛ-ip у экспериментальных животных. ИЛ-ір применялся у мышей с кожными ранами, получавших дозы радиоактивного облучения в качестве замедляющего фактора (Vegesna et al., 1995). В этих условиях ИЛ-ір действовал как фиброгенный фактор. Также местное применение ИЛ-ір способно ускорять реэпителизацию полнокожных ран у мышей на фоне введения гидрокортизона, что было показано при морфологических исследованиях (Variouchina et al., 2003). Кроме того показано, что при повреждении кожи экспрессия мРНК и уровень эндогенного белка ИЛ-ір в раневой жидкости повышаются, достигая пика на ранних стадиях заживления (Sato, Ohshima, 2000). Местная аппликация человеческого рекомбинантного ИЛ-1а, обладающего идентичным действием с ИЛ-1р, значительно ускоряла заживление кожных ран у свиней (Sauder et al., 1990). Зажившие под влиянием ИЛ-1а раны представляли собой полную и структурно-нормальную эпидермальную регенерацию.
Ранение кожи, как правило, сопровождается нарушением эпидермального барьера, в состав которого входят роговой слой эпидермиса с белково-липидным комплексом, а также плотные контакты между клетками зернистого слоя. Основными структурными и регуляторными белками плотных контактов являются клаудины. «Нокаутные» мыши по
4 клаудину-1 или гиперэкспрессирующие клаудин-6 умирают вскоре после рождения вследствие нарушения эпидермального барьера и массивной потери жидкости через эпидермис, что подчеркивает важность структур плотных контактов для поддержания барьерной функции кожи (Furase et al., 2002; Turksen, Troy, 2002). В ходе эксперимента при исследовании заживления раны человека показано, что белки плотных контактов клаудин-1, окклюдин и ZO-1 появляются уже в первых клетках нарастающего эпителиального пласта на самых ранних этапах заживления раны задолго до реконструкции рогового слоя (Brandner et al., 2002). Для сравнения, десмоколлин-1 -маркер дифференциации десмосом, или маркер рогового слоя филаггрин в регенерирующем эпидермисе на ранних этапах не определялись (Moll et al., 1998). ИЛ-lp способен влиять на экспрессию белков плотных контактов в различных тканях (Al-Sadi, Ma, 2007; Abe et al., 2003), однако его влияние на экспрессию белков плотных контактов в коже in vivo не изучено. Также показано, что короткая экспозиция высоких концентраций ИЛ-ір способна оказывать влияние на экспрессию белков плотных контактов в культуре кератиноцитов НаСаТ (Watson et al., 2007). Тем не менее, влияние длительной экспозиции малых доз ИЛ-ір на экспрессию белков плотных контактов in vitro также ещё не изучено.
Заживление кожных ран у лабораторных животных целесообразно изучать на фоне иммуносупрессии, вызываемой инъекциями гидрокортизона, поскольку данная модель позволяет снизить скорость раневого процесса и оценить влияние ИЛ-1|3 на различные аспекты регенерации кожных покровов (Варюшина и соавт., 2004).
Цель исследования: изучение влияния интерлейкина-ір на динамику заживления кожных ран, а также на формирование эпидермального барьера у мышей на фоне иммуносупрессии. Задачи исследования:
-
Оценить динамику уменьшения раневой поверхности под влиянием интерлейкина-lp с помощью морфометрического анализа
-
Исследовать влияние интерлейкина-ір на ультраструктуру клеток при заживлении кожной раны
-
Исследовать локализацию белков плотных контактов при регенерации эпидермиса под влиянием интерлейкина-ір
-
Оценить влияние интерлейкина-ір на экспрессию белков плотных контактов в культуре кератиноцитов НаСаТ
Научная новизна. Впервые проведено комплексное электронно-микроскопическое, иммуноцитохимическое и молекулярно-биологическое исследование влияния ИЛ-ір на заживление кожных ран. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что местное
5 применение ИЛ-1р способствует формированию межклеточных контактов (десмосом) между регенерирующими кератиноцитами. Впервые установлено, что нанесение ИЛ-1р на поверхность кожной раны сопровождается активизацией местных факторов защиты, что приводит к элиминации микроорганизмов из раны. Впервые показано, что ИЛ-ір ускоряет дифференцировку кератиноцитов. Получены новые данные о том, что ИЛ-ір усиливает экспрессию клаудина-1 в культуре кератиноцитов и меняет характер экспрессии белков плотных контактов в регенерирующих кератиноцитах при заживлении кожной раны. Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенного исследования получены данные, которые позволяют расширить представления об эффектах, оказываемых ИЛ-ір на ткани при регенерации кожных покровов. Результаты, полученные в ходе исследования влияния ИЛ-ір на регенерацию кожных покровов у мышей на фоне иммуносупрессии, позволяют предположить возможные механизмы действия ИЛ-ір, применяемого при лечении кожных ран. Результаты диссертации использованы в курсах лекций по физиологии и иммунологии на медицинском и биолого-почвенном факультетах Санкт-Петербургского государственного университета. Положения, выносимые на защиту:
-
Интерлейкин-ір способствует восстановлению эпидермального барьера за счет образования межклеточных контактов при заживлении кожных ран
-
Интерлейкин-1р обусловливает формирование клеточных слоев, ускоряя дифференцировку кератиноцитов
-
Интерлейкин-1р ускоряет элиминацию микроорганизмов из раны, препятствуя развитию раневой инфекции
Апробация работы. Результаты исследования бьши доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом Форуме - 2008 (Санкт-Петербург, 2008); на VII Всероссийской конференции с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2009); IX Всероссийской молодежной научной конференции «Физиология человека и животных (от эксперимента к клинической практике)» (Сыктывкар, 2010); XIII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2010); XXIII Европейской конференции EITG (Солерно, 2010). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК и 5 работ в сборниках трудов научно-практических конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка
литературы, включающего 291 источник, из которых 19 работ отечественных авторов и 272 - зарубежных. Диссертация иллюстрирована тремя таблицами и 33 рисунками.
