Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Шанероны и их влияние на фолдинг белков 10
Семейство шаперонинов \ Hsp 60 12
Шаперонины класса 1 13
Структура шаперонина GroEL 14
Структура кошаперонина GroES. 15
GroEL/GroES зависимый механизм сворачивания белков 17
Изменения в структуре шаперонина при GroEL-зависимом фолдшіге 19
Взаимодействие полипептидов с шаперонином GroEL 21
Цис- и транс-третичные комплексы GroEL-GwES-полипептид 24
Симметричный комплекс 25
Высвобождение ненативных форм белка из
комплекса GroEL-GroES. 27
Взаимодействие GroEL с большими белками 28
Взаимодействие шаперонов с прионовым белком 30
Константы связывания белков с шаперонином 32
Изучение связывания полипептидов с GroEL in vitro 33
Шаперонины класса II 34
Основные свойства и функции
D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы 36
Механизм дегидрогеиазпойреакции 39
Полифункционалъностъ ГАФД. 41
Образование и основные свойства пептида Р-а мило ид а 1.42 43
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50
Материалы 50
Методы 51
Методы выделения белков 51
Выделение глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из
скелетных мышц кролика 51
Выделение шаперонина GroEL и ко-шаперонина GroES. 52
Аналитические методы 54
Определение когщентраций реагентов 54
Определение ферментативной активности ГАФД. 55
Определение ферментативной активности ЛДГ. 55
Определение коїщентрации белка 55
Денатурация ГАФД и ЛДГ. 56
Исследование реактивации ГАФД. 56
Исследование реактивации ЛДГ. 57
Окисление ГАФД перекисью водорода 57
Титрование SH-групп ГАФД. 58
Кинетика термоагрегации ГАФД. 59
Дифференциальная сканирующая калориметрия 60
Регистрация спектров кругового дихроизма 60
Электрофорез белков ПААГв денатурирующих условиях 60
Иммобилизация антител и GroEL на сефарозе 4В 61
Исследование образования и диссоциации комплексов
GroEL-ГАФДпри помощи иммобилизованных антител 6С5 63
Метод динамического лазерного светорассеивания 64
Метод поверхностного плазмонного резонанса 65
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 6$
Влияние окисленной развернутой ГАФД на GroEL-зависимое
сворачивание денатурированной формы этого фермента 69
Выявление комплекса между разными формами денатурированной
ГАФД и GroEL при помощи антител 6С5, иммобилизованных
па сефарозе 74
GroEL-зависимое сворачивание денатурированной лактатдегидрогеназы
в присутствии окисленной развернутой ГАФД. 78
Влияние шаперонииа GroEL на процессы термоинактиваі}ии и
термоагрегации ГАФД. 85
Термогшактиваїшя и реактивация ГА ФД в присутствии GroEL 86
Исследование взаимодействия ГА ФД и ЛДГ с GroEL методом ДСК. 90
Влияние GroEL на термоагрегацию ГАФД. 95
Заключение к 1 части исследования 106
Взаимодействие пептида (^-амилоида с ГАФД и
шаперонином GroEL 1И
Изучение взаимодействия ГА ФД с пептидом В-амилоида-і^
методом поверхностного плазмонного резонанса 112
Влияние пептида В-амилоида^42 на термоинактивацию
и термоагрегацию ГАФД. : 119
Влияние пептида В-амилоида}.42 на GroEL-зависимое
сворачивание денатурированной формы ГАФД. 128
Взаимодействие петида К-амилоида^ с шаперонином GroEL 130
Заключение ко 2 части исследования 133
ВЫВОДЫ 135
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
р-амилоидм2 - пептид р-амилоида]-42
АФК - активные формы кислорода
ГАФД - D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа
ГАФДо* - D-глицеральдегид-З-фосфатдєгидрогеназа окисленная Н20:
в присутствии 4 М гуанидин гидрохлорида ДГФР - дегидрофолатредуктаза ДМСО - диметилсульфоксид
ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия ДСН - додецилсульфат натрия ДТНБ - 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) ДТТ - 1,4-дитио-ПЬ-треитол ЛДГ - лактатдегидрогеназа ПААГ - полиакриламидный гель Тм - температура максимума теплопоглощения Трис - трис(гидроксиметил)метиламин 3-ФГА - 3-фосфоглицериновый альдегид ЭДТА - этиле нднами нтетраацетат АТР - аденозинтри фосфат ADP - аденозиндифосфат АРР - предшественник амилоидного белка HEPES - Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-этансульфоновая кислота NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный NFTs - нейрофибриллярные клубки Р-20 - неионный детергент PMSF - фенилметилсульфонилфторид
Введение к работе
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (NAD - зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12) катализирующая центральную стадию гликолиза - реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-Дифосфоглицерата с образованием NADH, является одним из самых изучаемых ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью изучения его основной гликолитической функции, но и с обнаружением многочисленных негликолитических активностей данного фермента в клетке. Существует также обширная информация об участии ГАФД в различных процессах просто за счет возникновения белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий без проявления какой-либо ферментативной активности. Важность разнообразных негликолитических функций ГАФД в регуляции функционирования клеток связана еще и с тем, что содержание этого фермента в тканях составляет 10-15% от общего количества растворимых белков. Очевидно, что из-за такой высокой концентрации ГАФД в клетке невозможно пренебрегать никакими сведениями об участии этого белка в тех или иных процессах. Особенно важно, на наш взгляд, изучение роли ГАФД в агрегации белков, образовании амилоидных структур и функционировании системы шаперонов, так как в этих случаях первостепенное значение имеет именно концентрация белка в клетке. В нашей работе основное внимание было уделено исследованию денатурации, ренатурации и агрегации ГАФД и участию в этих процессах шаперонина и пептида р-амилоидаМ2. Мы полагаем, что именно благодаря очень высокой концентрации ГАФД в различных тканях этот белок является полноправным участником развития многих патологических процессов, обусловленных накоплением агрегированных белков и формированием амилоидных структур. Правильность такого предположения подтверждается постоянным появлением все новых фактов участия ГАФД в возникновении различных «конформационных болезней».
Известно, что для того, чтобы вновь синтезируемый белок приобрел присущие ему функциональные свойства, он должен свернуться в пространстве строго определенным образом. Хотя, нативная пространственная структура определяется аминокислотной последовательностью, за исключением некоторых случаев она не может быть сформирована или восстановлена после повреждения без участия белков-шаперонов, обеспечивающих их правильное сворачивание, фолдинг. Повреждения белков, вследствие химических модификаций, структурных повреждений, полученных из-за теплового или других стрессов, могут приводить к инактивации белков и к их агрегации. В нормальных условиях для предотвращения подобных нарушений функционирования клетки при увеличении внутриклеточной агрегации запускается «Heat-Shock ответ» и увеличивается синтез шаперонов. Существует ряд патологических состояний - нейродегенеративных заболеваний, при которых происходит накопление неправильно свернутых белков, крупных белковых агрегатов. К подобной патологии могут приводить и нарушения функционирования шапероновой системы. Естественным является предположение, что одной из возможных причин нарушений в работе шаперонов может быть их перегрузка или блокирование такими поврежденными формами белков, которые из-за неспособности восстановить свое нативное состояние препятствуют шаперонам в выполнении их функций.
Ранее в нашей лаборатории было исследовано взаимодействие шаперонина GroEL с различными формами фермента, неспособными к формированию нативной структуры: ГАФД из мышц кролика с SH-группами, модифицированными дитионитробензоатом, димерная форма ГАФД из Bacillus stearothermophilus с мутациями по Р-оси (Y46G/S48G и Y46G/R52G) - O-F-димеры и 0-Я-димеры: Y283V и Y283V/W84F. Было показано, что блокирование шаперонина GroEL происходило при добавлении химически модифицированных и мутантных форм ГАФД, неспособных сворачиваться в нативную конформацию (Polyakova et al., 2005). В настоящей работе представлялось целесообразным получить неправильно свернутые формы ("misfolded forms") белков в условиях более близких к реальным условиям функционирования тканей, в том числе при воздействии малых концентраций перекиси водорода, всегда присутствующих в клетках с аэробным метаболизмом. Такое исследование потребовало изучения некоторых элементов механизмов функционирования шаперонов и роли различных факторов, приводящих к нарушению этих функций.
В последние годы накопилось много данных по исследованию участия ГАФД в нейродегеративных заболеваниях. Например, было продемонстрировано ее связывание с хантингтином и атаксином при спиноцеребральной атаксии и атаксином-3 при болезни Джозефа-Мохадо (Burke et. al., 1996; Cooper et. al., 1997). Так же продемонстрировано взаимодействие ГАФД с предшественником амилоидного белка (Tamaoka et. al, 1996), однако ничего не известно о взаимодействия ГАФД с пептидом р-амилоидам2 - ключевым фактором болезни Альцгеймера. Это определило второй раздел настоящего исследования.
Таким образом, исследование участия ГАФД в развитии нейродегенеративных заболеваний тесно переплетается с изучением систем, защищающих ГАФД от агрегации - это прежде всего система шаперонов, и с проблемой взаимодействия ГАФД с пептидом р-амилоида^- Поэтому основанной целью пашей работы явилось во-первых, изучение процесса блокирования шаперонинов неправильно свернутыми энзиматическими белками, а также особенностей взаимодействия шаперонина с пептидом Р- амилоидаі.42; и во-вторых, исследование возможного участия различных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (нативных, дентатурированных, термодентаурированных и окисленных) как в блокировании шаперонов, так и в образовании амилоидных структур.
