Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Стволовые клетки 11
1.1.1. Эмбриональные стволовые клетки. 12
1.1.2. Стволовые клетки дифференцированных тканей взрослого организма. 14
1.1.3. Мезенхимные стволовые клетки. 21
1.2. Терапия инфаркта миокарда 35
1.2.1. Инфаркт миокарда 35
1.2.2. Терапевтические подходы к лечению инфаркта миокарда 37
1.2.3. Стимуляция эндогенной регенерации миокарда. 38
1.2.4. Трансплантация фетальных и неонатальных кардиомиоцитов. 40
1.2.5. Реимплантация миобластов в область повреждения 41
1.2.6. Мобилизация эндогенных стволовых клеток. 42
1.2.7. Клеточная терапия повреждений миокарда с применением мононуклеарной фракции костного мозга 43
1.2.8. Клеточная терапия повреждения миокарда с применением ГСК. 44
1.2.9. Клеточная терапия повреждений миокарда с применением МСК. 45
ГЛАВА 2. Материал и методика 49
2.1. Выделение и культивирование МСК крысы 49
2.2. Фенотипирование МСК крысы 49
2.3. Дифференцировка МСК крысы в ортодоксальных направлениях 50
2.3.1. Дифференцировка МСК крысы в остеоцитарном направлении 50
2.3.2. Дифференцировка МСК крысы в хондроцитарном направлении. 50
2.3.3. Дифференцировка МСК крысы в адипоцитарном направлении. 50
2.4. Дифференцировка МСК крысы в кардиомиоцитарном направлении 51
2.5. Фенотипирование дифференцированных производных МСК 51
2.6. Окрашивание мезенхимных стволовых клеток крысы флуорохромом РКН 26 .51
2.7. Моделирование экспериментального инфаркта миокарда (ЭИМ) 53
2.8. Введение МСК животным 53
2.9. Фиксация материала, морфологический и гистологический анализ препаратов. 54
2.10. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда 55
2.10.1. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против коннексина 55
2.10.2. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против транскрипционного фактора GATA4 и тропонина I. 57
2.11. Анализ распределения МСК в организме подопытных и интактных животных 57
2.12. Анализ распределения лизата МСК, окрашенных РКН26, в миокарде подопытных животных 58
2.13. Количественная оценка васкуляризации зоны повреждения и измерение дилатации полостей сердца 59
ГЛАВА 3 Результаты 60
3.1. Мезенхимные стволовые клетки 60
3.1.1. Характеристика культур МСК крыс. 60
3.1.2. Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в трёх ортодоксальных направлениях и фенотипирование полученных производных 61
3.1.3. Дифференцировка МСК в кардиомиоцитарном направлении 64
3.2. Динамика экспериментального инфаркта миокарда у крыс линии Wistar Kyoto. 65
3.2.1. Четвертые сутки после ЭИМ. 65
3.2.2. Седьмые сутки после операции ЭИМ. 65
3.2.3. Двадцать первые сутки после ЭИМ. 66
3.2.4. Тридцать пятые сутки после ЭИМ. 66
3.2.5. Сорок вторые сутки после операции ЭИМ. 69
3.3. Распределение МСК по организму интактных и подопытных животных 71
3.3.1. Распределение МСК в организме интактного животного ЭИМ. 71
3.3.2. Распределение МСК в организме животного перенесшего ЭИМ. 71
3.3.3. Трансплантация лизата мезенхимных стволовых клеток животным с ЭИМ. 74
3.4. Динамика течения экспериментального инфаркта миокарда после трансплантации МСК 76
3.4.1. Детекция донорских клеток в миокарде интактных и подопытных животных. 76
3.4.2. Морфологические особенности в строении ткани в зоне инфаркта миокарда у подопытных животных 78
3.4.3. Выявление кардиомиоцитов периинфарктной зоны окрашенных РКН26. 85
3.5. Сравнение степени дилатации полостей сердца у контрольных и подопытных животных после ЭИМ 87
3.6. Анализ васкуляризации зоны ишемического повреждения у контрольных и подопытных животных 87
3.7. Регистрация изменений электрокардиограмм у контрольных и подопытных (с введенными МСК) животных после ЭИМ 89
3.8. Влияние сроков внутривенного введения мезенхимных стволовых клеток при осложненном инфаркте 90
3.8.1. Детекция флуоресцентно окрашенных мезенхимных стволовых клеток 90
3.8.2. Особенности в строении рубцовой ткани при терапевтической трансплантации МСК. 90
3.8.3. Особенности в строении рубцовой ткани при профилактической трансплантации МСК. 96
3.9. Изменение морфометрических параметров миокарда у крыс с ЭИМ при разных сроках трансплантации МСК 100
ГЛАВА 4 Обсуждение 103
Выводы 117
Заключение 118
Список работ, опубликованных по теме диссертации 119
Благодарности 120
Список литературы 121
- Клеточная терапия повреждений миокарда с применением мононуклеарной фракции костного мозга
- Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против коннексина
- Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в трёх ортодоксальных направлениях и фенотипирование полученных производных
- Морфологические особенности в строении ткани в зоне инфаркта миокарда у подопытных животных
Введение к работе
Изучение свойств мезенхимных стволовых клеток и их влияния на репаративные процессы в организме - одна из наиболее актуальных задач современной клеточной биологии. Особая значимость исследований в данной области связана с применением клеточных технологий для лечения человека. Мезенхимные стволовые клетки (МСК) - резиденты стромы костного мозга. Они обладают всеми свойствами мультипотентных стволовых клеток -способностью к самовоспроизведению и дифференцировке в нескольких направлениях. МСК можно культивировать in vitro, многократно увеличивая биомассу, не теряя дифференцировочного потенциала (Hung et al., 2002). Так называемыми ортодоксальными направлениями их дифференцировки считаются остеогенное, адипогенное и хондрогенное. Известно, что МСК способны к дифференцировке и в неортодоксальных направлениях -нейрональном и глиальном, кардиомиоцитарном и миоцитарном (Ferrari et al., 1998; Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001; Woodbury et al., 2002; Long et al., 2005).
Предполагается, что основная задача МСК в сформированном организме - репарация тканей мезодермального происхождения. Эксперименты по введению МСК в организм интактного животного показали диффузное распределение донорского материала именно по тканям мезодермального происхождения, в том числе и по мышечной ткани (Anjos-Afonso et al., 2004). Более того, в исследованиях по трансплантации МСК в кровоток животным с повреждениями костной ткани было доказано что донорский материал мигрирует из кровотока в зону повреждения (Lu et al., 2001; Ji et al., 2004). Однако данная гипотеза не может считаться абсолютно доказанной на сегодняшний день.
На основании данных экспериментов многие исследователи предположили возможность применения МСК в качестве репаративного материала в области клеточной терапии. Во-первых, МСК мультипотентны.
Второй важный фактор - наличие разработанных воспроизводимых методик наращивания в культуре чистых популяций МСК, выделенных из костного мозга. Кроме того, доступность костного мозга для пункции позволяет использовать для трансплантации аутологичные МСК и избежать, таким образом, проблем иммунологической совместимости. Наконец, несмотря на их высокий пролиферативный потенциал in vitro, в сотнях проведённых эктопических трансплантаций МСК ни разу не фиксировали развитие опухоли.
Клеточная терапия - новый метод лечения заболеваний связанных с необратимой гибелью клеточных элементов. Области применения клеточных технологий постоянно расширяются. Ещё в середине 90-х клеточные технологии использовались лишь при пересадках костного мозга (Silvestri et al., 1992). Сейчас они применяются для лечения сахарного диабета, печеночной недостаточности, лечения ожогов (Gohari et al., 2002). На экспериментальном уровне клеточные технологии активно используются в кардиологии, при инфаркте миокарда и кардиомиопатии (Smits et al., 2003; Hill et al., 2004; Kang et al., 2004).
Инфаркт миокарда - одна из основных причин, приводящих к стойкой инвалидизации или смертности во всём мире. Тромбоз или эмболия коронарных артерий способствуют образованию в сердце зоны ишемии и некрозу кардиомиоцитов. В области повреждения миокарда с первых минут развивается острый сосудистый ответ: вазодилатация артериол и капилляров, повышение проницаемости капилляров, временная вазоконстрикция исходящих сосудов, экссудация, а как следствие - отек. В течение нескольких часов формируется острый клеточный ответ: инфильтрация клетками воспаления, среди которых преобладают нейтрофилы, ликвидация клеточного дебриса, образование тромба. В последующие несколько дней развивается хронический клеточный ответ: миграция в зону повреждения макрофагов и лимфоцитов, образование грануляционной ткани и как следствие соединительно-тканного рубца. Повреждённый миокард никогда
не восстанавливает своей первоначальной структуры. Это приводит к тяжёлым патологическим изменениям в функции сердца и развитию таких осложнений как сердечная недостаточность, аритмии, аневризмы, разрыв миокарда и т.д.
Применение клеточных технологий на экспериментальных моделях повреждения миокарда оказывало положительное влияние на репарацию ткани и восстановление сердечной деятельности. В качестве агентов клеточной терапии инфаркта миокарда использовали миобласты поперечнополосатой мускулатуры, фетальные кардиомиоциты, гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки эндотелия сосудов и в том числе МСК (Atkins et al., 1999; Orlic et al., 2001; Kawamoto et al., 2003; Leobon et al.,2003; Skobel et al., 2004; Zhang et al., 2004; Katritsis et al., 2005; Xu et al.,2005). Однако проведенные исследования не охватывают весь спектр проблем, связанных с клеточной терапией инфаркта миокарда. В большинстве работ проводили интрамиокардиальное введение клеточного материала, что зачастую невозможно в клинической практике. Вопрос о миграции клеток при их трансплантации в кровоток животных с повреждением миокарда практически не исследован. Нам не удалось обнаружить данных о терапевтическом потенциале МСК трансплантированных в кровоток животных с экспериментальным повреждением миокарда.
Свидетельства того, что МСК могут дифференцироваться в кардиомиоциты как in vitro, так и in vivo, способны паракринно воздействовать на эндогенные популяции стволовых клеток и мигрировать в зону повреждения, послужили основой для формулировки цели и задач нашего исследования.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось изучение влияния трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток на течение экспериментального инфаркта миокарда у крыс.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. Выделить и охарактеризовать мезенхимные стволовые клетки крысы.
2. Адаптировать модель экспериментального инфаркта миокарда у крыс для животных породы Wistar-Kyoto.
3. Изучить общую картину течения экспериментального инфаркта миокарда у крыс линии Wistar-Kyoto.
4. Изучить распределение донорских МСК в организме интактных крыс.
5. Выявить МСК в миокарде экспериментальных животных.
6. Оценить влияние трансплантации МСК на гистологическую картину состояния ишемизированного миокарда.
7. Провести гистохимический анализ зоны ишемии экспериментальных животных.
8. Оценить гистологические, морфологические и морфометрические особенности в строении тканевой зоны инфаркта миокарда при профилактической и терапевтической трансплантации МСК.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro в кардиомиоцитарном направлении сопровождается экспрессией эмбриональных и функциональных маркеров миокарда.
2. МСК крысы, введённые в кровоток, мигрируют в зону инфаркта миокарда.
3. Трансплантация сингенных МСК ускоряет течение процессов воспаления в ишемизированном миокарде.
4. Трансплантация сингенных МСК существенно влияет на гистологическое строение зоны ишемического повреждения, а именно: усиливается васкуляризация зоны повреждения, сохраняются переживающие кардиомиоциты периинфарктной зоны, зона рубца насыщена волокнами эластического типа.
5. Оптимальными сроками трансплантации МСК в кровоток для получения наилучшего профилактического и терапевтического эффекта при ЭИМ являются сроки за 2 суток, в день, через 2 и 7 суток после операции ЭИМ.
Клеточная терапия повреждений миокарда с применением мононуклеарной фракции костного мозга
Исследования в этом направлении начаты Торо, по данным которого парентеральное введение экстракта сердца эмбрионов, коргормона (Corhormon), стимулирует регенерацию миокарда крыс. В качестве механизма регенерации предлагается следующая схема. Происходит отщепление миоцитов перинекротических волокон по линиям вставочных дисков, их митотическое деление и вторичное объединение в мышечную ткань. По мнению автора, инъекция коргормона способствовала значительному уменьшению размеров инфаркта миокарда. Но аналогичные эксперименты не позволили подтвердить эффект регенерации мышечной ткани сердца, хотя после инъекции в соединительной ткани резко возрастало количество эластических волокон (Mohr, 1952; Mohr, Helmreich, 1952).
В нашей стране, начиная с работы Л. В. Полежаева и соавторов 1958 года, выполнено множество исследований на обсуждаемую тему. В них показана возможность эффективного стимулирования регенерации миокарда взрослых млекопитающих при воздействии целого ряда веществ: гидролизата миокарда, пирогенала, витаминов В6 и В12, фрагментов ДНК и РНК, АТФ, метилурацила, соединений кобальта и некоторых других препаратов (Полежаев и др., 1965, 1975). Описано несколько проявлений стимулированной регенерации: возникновение миобластов, частичное заполнение ими дефекта миокарда, миграция в тяжи и вторичная дифференцировка миобластов (Полежаев и др., 1958, 1965; Синицын, 1962; Саидрасулов, 1963, Андреев и др., 1968). Наряду с отщеплением миобластов от мышечных волокон допускалось и их образование путем дифференцировки из клеток грануляционной ткани (Полежаев и др., 1965; Полежаев, 1970). Введение комплексных соединений кобальта крысам после термокоагуляционного повреждения миокарда вызывает дедифференцировку кардиомиоцитов перинекротических мышечных волокон и образование цепочек миобластов, сформированных de novo (Polezhaev and Tinyakov, 1980). В большинстве работ размеры рубцовых очагов в миокарде при различных экспериментальных патологиях (экспериментальном инфаркте, термокоагуляционном повреждении, ранениях) под влиянием стимулирующих препаратов уменьшаются. Кроме того, представлены данные о том, что в центральной части дефекта возникают островки или целые пласты мышечной ткани, образующие соединения с прилежащими группами мышечных волокон. Однако по мнению Полежаева регенерировавшие мышцы с течением времени подвергаются полной дегенерации (Полежаев и др., 1965).
Детальное изучение процессов регенерации в миокарде подчеркнуло недостаточную доказательность выводов об эффективном стимулировании регенерации миокарда (Саркисов, 1977). В работе Саркисова подчеркивается, что уменьшение дефекта миокарда в экспериментах с применением биостимуляторов может быть связано не с истинной регенерацией мышечной ткани за счет миобластов или дифференцировки, а с предотвращением вторичных волн некроза миокарда.
Повторные эксперименты по стимуляции регенерации миокарда при действии гидролизата мышцы сердца, пирогенала, метилурацила и других агентов (Карапетян и др., 1970; Миракян и др., 1970; Ахабадзе, 1971,) дали негативные результаты. Эти вещества активизировали синтез ДНК и митозы, но не в кардиомиоцитах или миобластах, а в клетках соединительной ткани и эндотелия. Стимуляция ответа соединительной ткани преобладало и при применении метилурацила на. репаративные процессы при экспериментальном инфаркте миокарда у кроликов (Беленький и др., 1979). Было также отмечено, что применение названных препаратов не приводит к усилению метки ядер кардиомиоцитов ЗН-тимидином. К настоящему моменту исследования в данной области не ведутся.
Многие современные исследователи связывают экспериментальную регенерацию миокарда при повреждениях не только со стимуляцией эндогенных механизмов репарации, но и с применением клеточной терапии.
Способность фетальных и неонатальных кардиомиоцитов пролиферировать in vitro послужила основой для применения данных клеток при экспериментальном инфаркте миокарда (Sundgren et al., 2003). Первые эксперименты по инъекции культивированных кардиомиоцитов в нормальный миокард экспериментальных животных показали, что трансплантированные клетки не только приживаются в сердце реципиента, но и формируют щелевые контакты с кардиомиоцитами хозяина (Skobel et al., 2004).
Трансплантация неонатальных кардиомиоцитов в область криоповреждения приводила к приживлению трансплантированных клеточных элементов (Reinecke et al., 1999). Жизнеспособные и пролиферирующие кардиомиоциты выявлялись в рубцовой ткани миокарда реципиента на протяжении 65 дней после трансплантации. Клетками сравнения в данной работе служили кардиомиоциты взрослого организма, трансплантация которых приводила к развитию коагуляционного некроза введённого материала.
Трансплантация фетальных кардиомиоцитов в зону хронического инфаркта приводила к сохранению клеточных элементов только в периинфарктной зоне, что вероятно связано с недостатком васкуляризации зоны ишемии (Watanabe et al., 1998). Ожидания исследователей, что трансплантированные кардиомиоциты будут способствовать замещению фиброзной ткани на мышечную не оправдались. В ряде экспериментов исследователям удалось выявить островки дифференцированных кардиомиоцитов в толще рубцовой ткани на сроках до 12 недель. Данные островки мышечной ткани были васкуляризированы. Однако количество клеточных элементов было существенно меньше, чем инъецировалось (Muller-Ehmsen et al., 2002).
Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда антителами против коннексина
Свидетельства костномозгового происхождения кардиомиоцитов и клеток сосудов обратили внимание исследователей на костный мозг как на агент клеточной терапии. Впервые кардиомиогенные свойства клеток костномозгового происхождения in vivo были описаны Битером и соавторами (Bittner et al., 1999). В этих экспериментах пересадка костного мозга от здоровой мыши генетически модифицированной мыши с миодистрофией предотвращала дегенерацию сердечной мышцы.
Экспериментально доказано, что в красном костном мозге количество стволовых клеток взрослого организма существенно выше, чем в периферической крови, но всё же невелико. Для увеличения содержания стволовых клеток в аспирате костного мозга используют методики концентрирования клеточных элементов - получение мононуклеарной фракции (МФ) (Lin et al., 2004). К настоящему моменту проведен ряд исследований с применением мононуклеарной фракции костного мозга. Так, прямые инъекции клеток мононуклеарной фракции в зону ишемии миокарда и инъекции клеточного материала в артерию, питающую зону повреждения, приводили к улучшению васкуляризации ишемизированного миокарда и частичному восстановлению метаболизма повреждённого миокарда (Kawamoto et al., 2003; Zhang et al., 2004). Косвенно эти данные могут свидетельствовать об активации репарационных процессов в зоне рубца. Прямых доказательств репарации миокарда при применении МФ не получено.
Можно отметить следующие положительные аспекты применения мононуклеарной фракции костного мозга в условиях клиники. Это возможность работать с аутологичным материалом в условиях, так называемой "закрытой системы", при которой не происходит контакта клеточного материала с окружающей средой. К недостаткам МФ относят специфичность материала для каждого пациента - соотношение стволовые клетки/прогениторные сильно клетки варьирует (Jacobs et al., 1991). Как следствие, не существует чётких критериев стандартизации МФ. Количество костного мозга необходимого для приготовления МФ, достаточно велико. При применении МФ невозможно предсказать выраженность эффекта терапии.
К настоящему моменту, несмотря на недостатки метода, проводятся клинические исследования по применению МФ костного мозга при инфаркте миокарда и ишемической кардиомиопатии (Kuethe et al., 2004).
Большинство клеток мононуклеарной фракции костного мозга составляют гемопоэтические стволовые клетки и клетки гемопоэтического ряда (Jacobs et al., 1991). Первое свидетельство того, что ГСК могут принимать участие в регенерации миокарда было получено в работе Джексона с коллегами (Jackson et al., 2001). В исследовании использовали субпопуляцию ГСК, позднее получивших название SP-клеток. Фенотип клеток был CD34-/low, c-Kit+, Scal+. Мышам производили пересадку костного мозга с применением SP-клеток меченых геном люциферазы и вызывали экспериментальный инфаркт. Анализ повреждённого миокарда выявил кардиомиоциты донорского происхождения в периинфарктной зоне. В работах Орлика с коллегами проводили инъекции ГСК в ишемический миокард (Orlic et al., 2001). Фенотип ГСК был Lin-, c-Kit+. Инъекции производились в периинфарктную область. На 9 день после инъекции в 68% инфарктной зоны выявлялись юные кардиомиоциты донорского происхождения. Однако исследователи, пытавшиеся повторить данный эксперимент, потерпели неудачу (Balsam et al.,2004; Nygren et al., 2004). Анализ миокарда выявил, что донорские клеточные элементы на сроках анализа от 30 дней до 6 месяцев продолжали экспрессировать маркеры гемопоэтических клеток.
Таким образом, остаётся неясным, действительно ли ГСК способны трансдифференцироваться в миокардиальном направлении и участвовать в регенерации миокарда.
Изучение дифференцировочного потенциала МСК, выявление способности дифференцироваться в кардиомиоцитарном направлении in vitro и in vivo послужили основой для их использования как агентов клеточной терапии при повреждениях миокарда (Wang et al., 2000; Fukuda, 2001).
Томита с коллегами проводили трансплантацию МСК в область криоповрежденного миокарда (Tomita et al., 1999). При анализе гистологических препаратов через 8 недель после трансплантации клеточного материала кардиомиоциты с донорской меткой в зоне криоповреждения. Трансплантация МСК в зону повреждения миокарда при экспериментальном инфаркте приводила к значимому улучшению функциональных параметров повреждённого сердца (Shake et al., 2002). Гистологический анализ области повреждения показал, что введённые клетки через 2 недели экспрессировали ранние маркеры миоцитарной дифференцировки. Анализ миокарда через 4 недели после трансплантации продемонстрировал, что МСК интегрировались в миокард и дифференцировались в направлении миоцитов. Недавно был разработан новый метод доставки МСК в миокард, исследователи использовали сочетано фибриновый матрикс и МСК (Liu et al., 2004). В своей работе авторы применяли модель реперфузирумого инфаркта миокарда, трансплантацию клеточного материала проводили непосредственно после перевязки коронарной артерии. Анализ препаратов миокарда через 20 суток после введения МСК выявил кардиомиоциты с донорской меткой, а также существенное усиление васкуляризации зоны повреждения. Такой метод доставки, по мнению данных исследователей, позволяет предотвратить такое осложнение инфаркта миокарда как формирование аневризмы.
Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в трёх ортодоксальных направлениях и фенотипирование полученных производных
Для иммуногистохимического окрашивания антителами против транскрипционного фактора GATA4 и тропонина I криосрезы толщиной 7 мкм. Срезы помещали на стекло, расправляли нагреванием, высушивали в течение 2 мин при комнатной температуре. Далее промывали двукратно PBS, инкубировали 25 минут в буфере TrisHCl (рН-2) на кипящей водяной бане. Затем срезы дважды промывали PBS. Далее срезы инкубировали в 10% растворе фетальной сыворотки, содержащей 0,03% азида натрия, 0,01% Triton-X-100. Затем срезы помещали в раствор первых поликлональных антител к GATA4 (Santa Cruz) или моноклональных антител к тропонину I (Chemicon). Далее срезы промывали PBS и помещали в раствор вторых антител. В качестве вторых антител использовали козлиные антитела против иммуноглобулинов кролика, коньюгированные с СуЗ или ослиные антитела против иммуноглобулинов мыши, коньюгированные с СуЗ. Препараты заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB НС (Leica, Германия). Для анализа распределения МСК в организме животного в хвостовую вену вводили 5 миллионов флуоресцентно меченых клеток. Анализировали костный мозг, печень, мышцы, кишечник, лёгкие и селезёнку. Для этого проводили криофиксацию фрагментов указанных органов (кроме костного мозга). Фиксацию материала проводили на 7 и 21 сутки. Фрагменты охлаждали в парах азота в течение 10 сек, погружали в жидкий азот на 1 час, а затем помещали в морозильную камеру с температурой -70С. Для криофиксации печени орган инкубировали в криопротекторе, а затем охлаждали в парах азота. Срезы толщиной 7 мкм изготавливали на криостатном микротоме Leica CM 1900 Cryostat (Leica). Срезы помещали на стекло, расправляли нагреванием, высушивали в течение 2 мин при комнатной температуре. Препараты заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB НС (Leica).
Для анализа костного мозга проводили его эксплантацию, клетки культивировали 3-7 суток, фиксировали параформальдегидом в монослое, заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB НС (Leica).
Для получения лизата МСК клетки наращивали до плотного монослоя, снимали трипсином. Помещали в гипотоническую среду, стерильную деионизированную воду. Качество лизата контролировали под инвертированным микроскопом. Лизат 5 млн флуоресцентно меченых МСК вводили животным в хвостовую вену в 100 мкл питательной среды аМЕМ. Лизат трансплантировали на 2 сутки после операции ЭИМ. Для данного эксперимента было сформировано 2 подопытных группы животных со сроками наблюдения 7 и 21 сутки после ЭИМ. В каждую группу входило не менее 5 животных. У животных непосредственно после декапитации извлекали сердце. Затем желудочки разрезали перпендикулярно оси сердца на 3 параллельных сегмента толщиной 0,3-0,4 см каждый. Центральный сегмент охлаждали в парах азота в течение 10 сек, погружали в жидкий азот на 1 час, а затем помещали в морозильную камеру с температурой -70С. Срезы толщиной 7 мкм изготавливали на криостатном микротоме Leica СМ 1900 Cryostat (Leica). Срезы помещали на стекло, расправляли нагреванием, высушивали в течение 2 мин при комнатной температуре. Препараты заливали в пропилгаллат (5% в глицерине) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica DM LB НС (Leica).
Количественная оценка васкуляризации зоны повреждения и измерение дилатации полостей сердца. Подсчет сосудов регулируемого типа (артериол и венул) и сосудов синусоидного типа (сосудов с тонкой нерегулируемой стенкой) проводили в зоне повреждения миокарда на площади 30 мкм2 под световым микроскопом (Leica, Германия) через 35 суток после ЭИМ. Поля подсчета сосудов выбирались случайным образом. Все измерения повторяли 10-кратно. Полученные данные были обработаны с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc).
Дилатация полостей сердца (Д) рассчитывали как отношение средней площади просвета (Sn) к средней площади миокарда (SM) желудочков у групп животных с введением МСК и у контрольных групп (Свищев, 1972). (Д= SIT/ SM). Для морфометрических измерений выбирали животных только с трансмуральными инфарктами и постинфарктными аневризмами. Гистологические препараты были отсканированы. Площадь миокарда и площадь просвета желудочков были измерены с помощью программы PhotoM. Полученные данные были проанализированы с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc).
Морфологические особенности в строении ткани в зоне инфаркта миокарда у подопытных животных
В основе клеточной терапии любого заболевания, в том числе и инфаркта миокарда, лежит выделение, культивирование, дифференцировка и фенотипирование in vitro клеточного материала. Результаты терапии практически полностью зависят от того, какие именно клетки были использованы для трансплантации, а также от их качества.
В результате тщательного анализа литературных данных мы пришли к выводу, что наиболее перспективными для клеточной терапии инфаркта миокарда являются аутологичные мезенхимные стволовые клетки. Наличие отработанных и практически безвредных для человека процедур по получению первичного материала дают возможность использовать для трансплантации только аутологичныи клеточный материал, что позволяет полностью избежать реакций гистосовместимости (Kuznetsov et al., 2001; Jiang et al., 2002; Zhang et al., 2003). К настоящему времени описан фенотип МСК и выявлены их ортодоксальные направления дифференцировки (Young et al., 1995 Johnstone et al., 1998; Pittenger et al., 1999; Martin et al., 2002; Zuk et al., 2002; Pittenger and Martin 2004). На этой основе можно четко охарактеризовать полученный клеточный материал.
Для мезенхимных стволовых клеток фенотип клеточной популяции определен как CD34-, CD45-, CD44+, CD90+, CD105+, CD106+. Такой клеточный фенотип используется для МСК человека и мыши (Guo et al., 2001).
С помощью проточной цитофлуориметрии мы показали, что выделяли и выращивали in vitro CD45- и CD90+ клетки, что соответствует данным фенотипирования клеток человека и мыши (рис. 4). Для дополнительной характеристики выделенных из костного мозга клеток мы проводили дифференцировку в ортодоксальных для МСК направлениях: остеоцитарном, хондроцитарном, адипоцтрарном. Мы показали, что использованные нами клетки после второго пассажа были способны дифференцироваться в данных направлениях (рис. 5, 6). Итак, были получены доказательства того, что в терапии инфаркта миокарда у крыс была использована клеточная популяции, на 96% состоящая именно из мезенхимных стволовых клеток. Выделенные нами МСК могли дифференцироваться in vitro в кардиомиоциты. По методике, описанной в работах Фукуды и Шумакова (Fukuda, 2001; Шумаков и др., 2002), культивируемые in vitro мезенхимные стволовые клетки были обработаны 5 - азацитидином. После этого в культуре крысиных МСК были выявлены спонтанно сокращающиеся "валики". Такие же морфологические изменения наблюдали и вышеупомянутые авторы. В настоящей работе количество сокращающихся клеточных элементов никогда не превышало 15% от общего количества клеток в культуре, хотя экспрессия фибронектина понижалась существенно (рис. 5). Анализ экспрессии маркерных генов кардиомиоцитов показал, что в популяции дифференцированных МСК экспрессировались как маркеры ранней детерминации кардиомиоцитов - транскрипционные факторы GATA4 и Nkx2.5, так и маркеры дифференцированных клеток. В популяции дифференцированных МСК мы выявили экспрессию коннексина 43, основного белка щелевых контактов необходимого для передачи сигнала сокращения (Ya et al., 1998). Эти результаты свидетельствуют о том, что дифференцировка МСК под воздействием 5-азацитидина приводила к формированию функционально активных кардиомиоцитов. Однако наряду с этим в популяции присутствовали и предифференцированные клетки. Следует отметить, что экспрессия транскрипционных факторов кардиомиоцитарной дифференцировки отмечалась и в недифференцированных МСК, что может косвенно свидетельствовать о дифференцировочном потенциале мезенхимных стволовых клеток. Применение 5 - азацитидина для направленной дифференцировки МСК не может быть рекомендовано для работы с человеческим материалом, т. к. этот реагент является неспецифическим деметилирующим агентом. Его влияние на геном клетки непредсказуемо; высока вероятность образования малигнизированных клеточных элементов. Мезенхимные стволовые клетки могут дифференцироваться в кардиомиоциты не только in vitro, но и непосредственно в миокарде, согласно теории органных ниш (Mackenzie and Flake, 2001) и современным экспериментальным данным (Tomita et al., 1999). Томита с соавторами трансплантировали меченые МСК непосредственно в поврежденный участок миокарда крысы. Через определенное время регистрировали наличие меченых кардиомиоцитов в месте повреждения.
На основании вышеизложенного материала для дальнейших экспериментов мы использовали недифференцированные МСК и не применяли клетки, обработанные 5-азацитидином.
Перед нами стоял вопрос о способе введения МСК подопытным животным. В литературе упоминаются следующие пути трансплантации клеточного материала: непосредственно в зону повреждения, в коронарные сосуды или в кровоток. Введение МСК интрамиокардиально или интракоронарно требует тяжелой повторной операции, вскрытия грудной клетки, и очень часто приводит к нарушению работы сердца - аритмии (Subha et al., 2003, Zhang et al., 2002). Предпринятая нами попытка вводить клеточную суспензию непосредственно в некротическую зону была безуспешной. Около 80% животных погибали через несколько минут после трансплантации. Избежать подобных осложнений нам удалось при введении МСК в венозную кровь. Анализ кардиограмм животных с ЭИМ после внутривенного введения МСК показал, что трансплантация клеток не вызывала аритмий, то есть не оказывала дополнительной нагрузки на поврежденное сердце (рис. 22).
