Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Экология видов рода Aulacoseira в оз. Байкал 9
1.2. Филогенетический анализ диатомовых водорослей на основе морфологических признаков 11
1.3. Пластичность морфологии в ответ на изменчивость среды 14
1.4. Данные об эволюции диатомовых водорослей, полученные с применением молекулярных методов 16
1.5. Возможные механизмы видообразования у диатомовых водорослей 24
1.6. Палеонтологические данные об эволюции видов рода Aulacoseira в оз. Байкал 27
1.7. Метода филогенетического анализа 30 I
Глава2. Материалы и методы 35
2.1. Материалы 35
2.2. Выделение суммарной клеточной ДНК 35
2.3. Амплификация и секвенирование полноразмерного гена 18S рРНК 36
2.4. Выбор праймеров для амплификации и секвенирования фрагмента гена Rubisco 38
2.5. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 38
2.6. Кладистический анализ морфологических признаков 39
Глава 3. Разработка метода выделения ДНК из индивидуальных клеток 46
Глава 4. Молекулярно-филогенетический анализ доминирующих в оз. байкал видов рода AULACOSEIRA 50
4.1. Анализ нуклеотидных последовательностей полноразмерного ядерного гена малой субъединицы рРНК 50
4.2. Анализ последовательностей фрагмента хлоропластного гена Rubisco 54
4.3. Оценка времени дивергенции видов по молекулярным данным 61
Глава 5. Анализ эволюции морфологических признаков с применением кладистики 63
Глава 6. Возможные пути эволюции видов рода AULACOSEIRA В ОЗ. БАЙКАЛ 73
6.1. Сопоставление гипотез эволюции Aulacoseira по молекулярным и морфологическим данным 73
6.2. Разные стратегии выживания как возможные пути эволюции видов Aulacoseira в Байкале 74
Выводы 77
Литература 79
Приложение 98
- Филогенетический анализ диатомовых водорослей на основе морфологических признаков
- Выделение суммарной клеточной ДНК
- Разработка метода выделения ДНК из индивидуальных клеток
- Анализ последовательностей фрагмента хлоропластного гена Rubisco
Введение к работе
Актуальность темы. Знания о процессах возникновения, вымирания и филогении диатомовых водорослей до недавнего времени основывались исключительно на сопоставлении морфологических признаков строения кремниевых панцирей у современных и ископаемых видов. Исследования молекулярной эволюции предоставляют дополнительную возможность использовать полученные результаты для моделирования механизмов специализации, выработанных близкородственными таксонами при освоении различных экологических ниш.
Одним из важных элементов флоры Байкала являются диатомовые водоросли рода Aulacoseira Thwaites, которые представлены как широко распространенными, так и эндемичными формами, причем последние - А. baicalensis (К. Meyer) Simonsen и A. skvortzowii Edlund, Stoermer et Taylor являются видами, доминирующими в фитопланктоне и донных отложениях озера. Попытка восстановления эволюционных связей рода Aulacoseira, представляет интерес как с точки зрения исследования закономерностей эволюции видов диатомовых водорослей, так и с позиции изучения этапов образования современного доминирующего в экосистеме озера Байкал комплекса видов рода Aulacoseira.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выяснение истории формирования байкальской группы доминирующих видов рода Aulacoseira на основе сравнительного изучения изменчивости некоторых генов и морфологических признаков.
Были поставлены следующие задачи:
-
Разработать микрометод отбора клеток одной видовой принадлежности из природных проб фитопланктона для выделения суммарной клеточной ДНК и последующего использования ее в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенировании.
-
Выбрать молекулярные маркеры и праймеры для ПЦР, определить нук-леотидные последовательности амплифицированных участков ДНК, провести филогенетический анализ байкальских и внебайкальских представителей рода и оценить время их дивергенции.
ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА Gtltttpfytr 05
-
Провести кладистический анализ признаков тонкого строения панцирей видов Aulacoseira и сопоставить полученные данные с результатами мо-лекулярно-филогенетического анализа.
-
Проследить изменения состояний морфологических признаков в ходе эволюции рода Aulacoseira и предложить гипотезу формирования байкальской группы видов, занимающих различные экологические ниши.
Научная новизна. Впервые для диатомовых водорослей проведен моле-кулярно-филогенетический анализ видов внутри одного рода. Впервые показано совпадение филогенетических гипотез, основанных на генетических и морфологических данных, и оценена роль признаков строения панцирей в эволюции видов рода Aulacoseira.
Теоретическая и практическая значимость. Приобретение знаний по эволюционной истории изучаемого рода, который в массе представлен как в фитопланктоне, так и в донных отложениях многих водоемов, в том числе озера Байкал, крайне важно для экологического мониторинга и построения точных палеоклиматических реконструкций. Метод отбора небольшого числа клеток из природных проб для выделения ДНК гарантированной видовой принадлежности, разработанный в ходе выполнения работы, позволяет амплифи-цировать различные гены и определять их последовательности. Это дает возможность исследовать разнообразие диатомовых водорослей из природных популяций, избегая трудоемкого культивирования. Пополнение банка данных последовательностей создает основу для конструирования идентификационных олигонуклеотидных проб (ДНКовых подписей), которые могут быть использованы для изучения видового разнообразия фитопланктона.
Основные защищаемые положения:
-
Преимущества разработанной методики выделения ДНК из индивидуальных клеток диатомовых водорослей или из их небольшого числа, обеспечивающей, с одной стороны, амплификацию и секвенирование ядерных и хлоропластных генов, а с другой - однозначную идентификацию ультраструктурных и иных морфологических признаков.
-
Тесное генетическое и морфологическое родство доминирующих в экосистеме озера Байкал видов рода Aulacoseira и распространенного во всем Северном полушарии вида A. islandica (О. Mueller) Simonsen.
-
Информативность параллгльного молекулярно-филогенетического и морфолого-кладистического анализов для верификации филогенетических гипотез.
Апробация работы. Результаты работы доложены: на V-ой Школе диа-томологов стран СНГ «Диатомовые водоросли - индикаторы изменений окружающей среды и климата», 16-20 марта 1993 г. (Иркутск); на 13-ом Международном диатомовом симпозиуме, 1-7 сентября 1994 г. (Аквафреда ди Марра-тея, Италия); на 3-ем Международном симпозиуме "Видообразование древних озер" (SIAL- 3), 4 - 9 сент., 2002 г. (Иркутск).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
В диссертационную работу вошли исследования, поддержанные грантами MVH000 и MVH300; INTAS 93-36С4 и 93-3605-ext; РФФИ 94-04-11005, 97-04-50225, 01-04-49470 и 01-04-48991; СО РАН 10.3.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 103 стр., состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы (181 источник, из них 126 на иностранных языках) и приложения; содержит 9 таблиц, 11 рисунков.
Филогенетический анализ диатомовых водорослей на основе морфологических признаков
В основу систематики BACILLARIOPHYTA положены морфологические признаки строения кремниевых панцирей (Round, Crawford, Mann, 1990), в которые заключены эти одноклеточные водоросли. Твердые клеточные панцири диатомей хорошо сохраняются в осадках. Анализ строения ископаемых и современных форм позволяет определить родство видов и гомологию признаков, используя дарвиновский принцип модифицированных потомков, выстраивать эволюцию и систематику таксонов диатомовых водорослей, начиная с раннего мела до настоящего времени. Таким образом формировались доминирующие в настоящее время взгляды на филогению этой группы (Simonsen, 1979; Макарова, 1986; Николаев, Харвуд, Самсоной, 2001).
Сопоставление морфологии панцирей ископаемых и современных видов позволило выявить первичность и вторичность отдельных элементов строения (если перевести это в терминологию кладистики, соответственно, плезиоморфные и апоморфные признаки). Первичным, по мнению А.В. Топачевского (1962), является шаровидный панцирь с беспорядочным расположением ареол, через которые происходит обмен клетки с окружающей средой. Ареолы возникли одновременно с формированием двухстворчатого панциря и имеются у всех диатомей, а их структура более всего указывают на генетическое родство таксонов (Прошкина-Лавренко, 1974). Особенности строения ареол З.И. Глезер (1983) относит к медленно эволюционирующим признакам. Детально исследовав ископаемые диатомей, В.А. Николаев (1984а, б) пришел к заключению, что дивергенция диатомей по положению велума в ареолах (наружный или внутренний) произошла на ранней стадии их эволюции и является самым консервативным элементом структуры панциря. Показано, что совершенствование ареол является одним из направлений эволюции центрических диатомей порядка Coscinodiscales (Хурсевич, 1991; Khursevich, 1994). Строение самого велума - очень гибкое и лабильное, оно может зависеть от экологических условий, и его рекомендуется использовать только для характеристики видов и внутривидовых таксонов (Николаев, 19846).
С применением электронной микроскопии были открыты элементы тонкого строения панциря, например, двугубый вырост (rimoportula) (Hasle, 1974; Ross, Sims, 1972), свойственный почти всем видам диатомей, а исключения являются вторичными (Simonsen, 1979). Предполагаемой функцией двугубого выроста является вьщеление через его наружное отверстие слизи для обеспечения движения клеток (Medlin, Crawford, Andersen, 1986; Pickett-Heaps, Hill, Weatherbee, 1986). Внутренняя часть этого выроста служит цитоплазматическим якорем ядра во время интерфазы и образования новых створок (Schmid, 1994). Предполагается, что в эволюции диатомей первым из специализированных выростов сформировался именно двугубый, примерно 110-115 млн лет назад (Nikolaev, Harwood, 1997; Николаев, Харвуд, Самсонов, 2001). В дальнейшей эволюции именно из него произошел шов пеннатных шовных диатомей (Hasle, 1974).
Количество, расположение и строение двугубых выростов весьма разнообразно. По мнению одних авторов (Simonsen, 1979), примитивным состоянием является один вырост на створку, другие же считают примитивным состоянием большое число неравномерно расположенных двугубых выростов (Беклемишев, Семина, 1982; Николаев, 19846). В ходе эволюции выросты разделились на две основные группы по местоположению на створке - краевые и центральные. Локализация и расположение двугубых выростов позволяет характеризовать крупные таксоны (семейства), число выростов в пределах этих типов коррелирует с родовой принадлежностью (Николаев, 19846). Эволюция формы двугубых выростов у центрических диатомей шла от простого к сложному - от щели или от щели, окруженной валиками, к приподнятой трубке с валиками, а также к увеличению длины щели (Беклемишев, Семина, 1982; Хурсевич, 1991).
Способность клеток образовывать колонии считается для центрических диатомей примитивным признаком (Simonsen, 1972). Жесткий тип соединения в колонии характерен для древних таксонов; прогрессивным, свойственным многим современным видам, считается слизистый, гибкий способ соединения клеток в колонии (Николаев, 19846).
Спорообразование характерно для многих диатомей (McQuoid, Hobson, 1996). Это - специализированные покоящиеся клетки, обеспечивающие механизмы выживания и отличающиеся по строению от вегетативных клеток. Спорообразование является особенностью жизненного цикла, закономерно заканчивает активную фазу роста для некоторых видов и позволяет им благополучно переживать неблагоприятные условия до следующей вегетации. Способность образовывать покоящиеся споры также считается примитивным признаком центрических диатомей (Simonsen, 1972). Покоящиеся клетки (resting cells) также служат для выживания, но они одинаковы по строению со створками вегетативных клеток (отличием является более толстый панцирь) и считаются более «продвинутым» признаком, чем споры (Smetacek, 1985; Ishizaka, Kaichi, Takahashi, 1987; McQuoid, Hobson, 1996).
Большинство других признаков, характеризующих морфологию клеток диатомовых, являются морфометрическими: длина, ширина, плотность или количество пор, шипов или ареол в ряду. Цитологические или физиологические признаки не имеют широкого применения в систематике и идентификации этих водорослей.
Выделение суммарной клеточной ДНК
Для выделения ДНК использовали метод (Doyle, Doyle, 1990), основанный на способности нуклеиновых кислот образовывать стабильные и растворимые соединения с цетилтриэтиламмоний бромидом (СТАВ) в растворе с высоким содержанием солей. При уменьшении концентрации NaCl ниже 0,4 М комплекс СТАВ-нуклеиновые кислоты выпадает в осадок. Клетки отмывали от фиксатора (80% этанола) центрифугированием в течение 2 мин, спирт удаляли, добавляли воду, процедуру повторяли. Супернатант отбирали пипеткой. Осадок заливали 50-100 мкл СТАВ-буфера, предварительно прогретого при 60С, помещали в термостат (60С) и в течение 5 мин тщательно растирали пестиком для разрушения прочных кремнистых стенок, контролируя степень разрушения створок под лупой. Затем добавляли еще 100 мкл буфера и инкубировали в термостате при температуре 60С в течение 30 мин, время от времени перемешивая раствор вращением пробирки. Охлаждали раствор до комнатной температуры, добавляли равный объём смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), перемешивали покачиванием пробирки в течение 10 мин и разделяли фазы центрифугированием в течение 10 мин. Супернатант (СТАВ с нуклеиновыми кислотами) переносили в чистую пробирку объёмом 1,5 мл. Добавляли 2/3 объема холодного изопрапанола. Оставляли на ночь при температуре -20С для осаждения ДНК. Центрифугировали 30 мин, отбирали изопропанол. Для удаления избытков солей промывали осадок двумя объемами 80%-ного этанола, инкубировали 20 мин при комнатной температуре, центрифугировали 2 мин, тщательно удаляли спирт, подсушивали пробирку на воздухе для удаления паров спирта. Осадок ДНК растворяли в 20 мкл ТЕ-буфера (0,01 М трис-HCl, рН-7,4; 1 mM EDTA) до полного исчезновения осадка, что требовало иногда кратковременного прогревания при 50-60С и аккуратного пипетирования. Для амплификации и секвенирования полноразмерного гена малой субъединицы рРНК (рис. 1) использовали эукариотические праймеры, разработанные ранее (Elwood, Olsen, Sogin, 1985), приведенные в таблице 1. Амплификацию 18 S рДНК проводили с применением набора AmpHTAQ (Perkin-Elmer) по рекомендуемому фирмой протоколу в "Minicycler" (Biozym) в режиме: 94С - 5 мин, 60С - 5 мин + 0,5 ед. Taq-полимеразы и затем 30 циклов в условиях: 94С - 1 мин, 54С - 1 мин, 72С -1,2 мин. Результаты реакции анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле в трис-боратном буфере, полосу нужной длины вырезали и очищали с помощью набора QIA-quick PCR (Quiagen) по рекомендации производителя. Прямое определение нуклеотидных последовательностей проводили по прописи производителя с помощью SequiTherm EXCEL 11 Long-Read DNA Sequecing Kit (Biozym) с использованием (a-33P)dATP, либо с модификацией этого же набора (Kits-LC) для автоматического секвенатора LI-COR с ипользованием праймеров, меченных флюоресцентной меткой, в режиме: 94С — 30 сек, 42С - 30 сек, 70С - 60 сек. Продукт амплификации A. baicalensis был секвенирован в виде одноцепочечной матрицы, клонированной в фаге М13 с применением внутренних праймеров по описанному ранее методу (Medlin, Williams, Sims, 1993). Фрагмент хлоропластной ДНК, включающего З -концевой район \ большой субъединицы, 5 -конец малой субъединицы и межгенный спейсер оперона гена Rubisco амплифицировали с помощью выбранных самостоятельно праймеров S GGTAAACCCCATAATTCCCAATAS и 5 GGTACAGTTGTAGGTAAATTAG3 в буфере для амплифиации (10 тМ трис-НС1; 50 mM КС1; 0,2 mg/ml BSA (V-фракция); 3,5-4 тМ MgCl2; по 10 pmol праймеров; по 0,15 тМ каждого dNTP; около 1 нг геномной ДНК на 25 мкл реакции) в условиях: 95С - 5 мин, и 35 циклов по схеме: 94С — 1 мин, 54С - I мин, 72С - 1 мин. Продукт ожидаемой длины очищали и концентрировали электроэлюцией. Прямое секвенирование полученных ПЦР-продуктов проводили с помощью набора "fmol DNA Sequencing System" (Promega) с использованием (a-33P)dATP в режиме: 94С - 40 сек, 50С — 30 сек, 70С - 40 сек. Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы DIALIGN2 (Morgenshtern, 1999). Состав последовательностей ДНК и их выравненного набора оценивали программой MEGA 2 (Kumar et al.y 2001). Полученные данные сравнивали с опубликованными в GenBank гомологичными последовательностями, приведенными в таблице 2. Филогенетический анализ последовательностей 18S рРНК и Rubisco проводили с использованием пакета филогенетических программ Phylip v.3.6a2 (Felsenstein, 1981, 1993), программы TREE-PUZZLE (Schmidt et al, 2002). Графическое оформление филогенетических схем выполняли с помощью программы Tree View (Page, 1996).
Разработка метода выделения ДНК из индивидуальных клеток
Образцы природных пелагических популяций оз. Байкал, наряду с большим количеством клеток интересующего вида всегда содержали примесь сопутствующих других видов диатомовых и иных водорослей. Поскольку выполнение поставленных перед настоящей работой задач требовало анализа ДНК видов, взятых из природной среды, в ПЦР, необходимо было иметь метод отбора пула клеток, гомогенного в видовом отношении. Возможность использования чистых культур диатомовых водорослей ограничена, а при использовании проб фитопланктона, даже таких, в которых доминирует один вид, существует опасность амплификации при проведении ПЦР примесной ДНК (теоретическая чувствительность реакции достигает 1 молекулы ДНК (Li et at, 1988; Steinman et at, 1997)). Поэтому необходимо было разработать метод выделения ДНК из немногих клеток, представляющих гарантировано один вид (в нашем случае - объекты цилиндрической формы с диаметром 10 — 40 мкм и высотой до 100 мкм) и подобрать условия получения из них амплифицированного продукта.
Отбор индивидуальных клеток A. skvortzowii, A. baicalensis или A, islandica (Chivyrkuy) из образцов природных популяций для выделения суммарной ДНК проводили под бинокулярной лупой с помощью оттянутого микрокапилляра, затем пул отобранных клеток (ок. 300 шт.) отмывали проводкой через серию капель воды на силиконизированном предметном стекле. Состав конечного препарата на содержание постороннего материала и видовую принадлежность набранных клеток контролировали под световым микроскопом. Выделенную с применением 3%-ного цетилтриметиламмония по методу, описанному в главе 2, ДНК использовали в ПЦР с применением специфических праймеров (Sherbakova et at, 2000; Грачев и др., 2002).
В том случае, если проба была бедна нужными клетками, или их было трудно идентифицировать под лупой, мы использовали модификацию метода выделения ДНК из индивидуальных клеток диатомей (Sherbakova et al. 2000).
Под бинокулярной лупой из капли пробы фитопланктона с помощью стеклянной микропипетки (диаметром 30-50 мкм), оттянутой из стеклянного капилляра, отбирали отдельные клетки, отмывали проводкой через 2-3 капли дистиллированной воды и компактно помещали на силиконизированное покровное стекло, размещенное на предметном столике инвертированного микроскопа Axiovert 10 Zeiss), совмещенного с микроманипулятором. После испарения влаги, панцири перфорировали оттянутой стеклянной иглой (диаметром 3 мкм), управляемой микроманипулятором. Затем на поврежденные клетки наносили 1-2 мкл раствора с протеиназой К (0,5 мг/мл в буфере, содержащем 0,1% SDS или 0,1% Triton Х-100; 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5; 10 mM NaCl; 0,5 мМ ЭДТА), в которую освобождалось содержимое клеток через поврежденные мембраны и отверстия в кремниевой створке. Каплю покрывали жидким парафином, покровное стекло с материалом переносили в чашку Петри и помещали в инкубатор на 2 час при 60С. Затем каплю разводили 250 нл 0,1% Triton Х-100 и 3 мкл полученного раствора переносили в пробирки, содержащие 15 мкл ПЦР-буфера. Оставшиеся на покровном стекле панцири высушивали на воздухе, остаток жидкого парафина удаляли трехкратным промыванием гексаном (нанося каплю сверху). После испарения гексана препарат на покровном стекле обрабатывали в течение 2 час при 75С 30% перекисью водорода, отмывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе, напыляли золотом в вакуумной установке Balzers SCD 004 и исследовали в СЭМ Philips 525М. По рисунку 3 видно, что по оставшимся фрагментам панцирей можно идентифицировать вид, потому как основные морфологические признаки створок можно наблюдать: и лицевая часть створок, и загиб сохраняются, можно определить их размеры и плотность расположения ареол, также сохраняются шипы.
Анализ последовательностей фрагмента хлоропластного гена Rubisco
Для более детального анализа межвидовых взаимоотношений выбирали другой молекулярный маркер. Из литературных данных было известно, что последовательности большой и малой субъединиц гена, кодирующего рибулозо-1,5-дидосфаткарбоксилазу (ген Rubisco) у диатомового вида Cylindrotheca sp., как и у большинства других водорослей (Chrysophyta, Chromophyta, Rhodophyta) за исключением зеленых, локализован в хлоропластной ДНК. Ген организован в оперон, в котором последовательности субъединиц разделяет спейсер. У Ectocarpus (Phaeophyceae) последовательность этого межгенного участка оказалась тонким инструментом, позволившим различить до 40 клонов, выделенных из разных географических локализаций (Stache-Crain, Muller, Goff, 1997), а у Rhodophyta с его помощью удалось разделить североатлантический комплекс близкородственных видов, классифицируемый как Gymnogorngrus devonsiensis (Maggs et al„ 1992). Использованный в этих работах фрагмент ДНК содержит как белок-кодирующие последовательности ДНК, эволюционирующие достаточно медленно, так и некодирующий спейсер, который теоретически может накапливать замены с высокой скоростью. Кодирующие участки ДНК обладают рядом преимуществ в сравнении с рибосомной ДНК для филогенетического исследования, так как позволяют проследить некоторые / механизмы эволюции нуклеотидных последовательностей, а также оценить і время дивергенции видов.
На основе сравнения свыше двух десятков последовательностей, взятых из банка EMBL и принадлежащих разным классам водорослей, мной были сконструированы праймеры, предположительно ограничивающие 3 - концевой фрагмент большой субъединицы, межгенный спейсер и 5 -участок малой субъединицы гена Rubisco. Выбранная длина фрагмента позволяла определение его нуклеотидной последовательности без использования внутренних праймеров и имела достаточное для филогенетического анализа количество сайтов.
При амплификации суммарной клеточной ДНК для шести видов центрических диатомей был получен специфический продукт, дающий при электрофорезе в агарозном геле фрагмент длиной около 570 пар оснований.
Нуклеотидные последовательности фрагмента хлоропластного гена Rubisco определяли для того же набора видов Aulacoseiray для которого расшифрованы последовательности 18S рДНК, но с одним исключением {A. baicalensis взят из природного образца, а не из лабораторной культуры) и одним дополнением — популяцией A. islandica (Chivyrkuy) из Чивыркуйского залива оз. Байкал. Фрагменты большой и малой субъединиц гена Rubisco выравнивались относительно гомологичных последовательностей диатомовых Detonula confervacea и Odontella sinensis, взятых из GenBank с помощью программы DIALIGN2 (Morgenshtern, 1999). При этом не выявлено вставок и делеций в кодирующей части фрагмента и обнаружена единственная непрерывная рамка считывания аминокислот по универсальному коду. Старт малой субъединицы определяет кодон GTG, также как для некоторых других водорослей и высших растений. Выравненный набор последовательностей на участке длиной 568 п.н. содержит 105 (19%) информативных сайтов.
Анализ нуклеотидного состава (табл. 6) кодирующей части фрагмента показал, что соотношение G+C и А+Т в составе последовательностей указывает на предпочтительность использования А, Т нуклеотидов (81,7%), и наличие сдвига в сторону использования кодонов с основаниями А и Т в третьем положении синонимичных кодонов.
