Содержание к диссертации
Введение
Глава, 1. Функциональная роль ксилотрофных базидиомицетов в экосистеме и перспективы их использования в биотехнологии» (обзор литературы) 13
1.1. Особенности-биологии представителей разных трофических и сукцессионных группировок 13
1.2 Современные представления о ферментных системах грибов,бёлойи бурой гнили. ..24
1.3. Статус чистой культуры в микологических исследованиях.. ...40
1.4. Коллекции культур базидйальных макромицетов как возможность максимального раскрытия и сохранения их природного потенциала ... 46
1.5. Эколого-трофические потребности базидиомицетов в условиях чистой культуры...54
1.6. Ксилотрофные базидиомицеты как перспективный объект биотехнологии. : 79
1.7. Использование низкомолекулярных соединений различной природы для регуляции ростовых и синтетических процессов у базидиомицетов;в культуре 105
Глава 2. Материал и методы исследовании 119
2.1.. Эколого-географическая характеристика района выделения изолятов:... 119
2.2. Объекты исследования.. 127
2:3. Методы исследований. 133
Глава 3. Значение ксилотрофных базидиомицетов в лесных экосистемах лесостепи Правобережного Поволжья 152:
3.1. Эколого-трофические особенности биоты ксилотрофных базидиомицетов в районе исследований 152
3.2. Связь внутривидового (штаммового) полиморфизма видов ксилотрофных базидиомицетов,с их экологическими особенностями . .162
3.3. Формирование анаморф у видов ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры 211
Глава 4. Особенности развития штаммов ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры . 218
4.1. Особенности морфогенеза структур мицелия при погруженном культивировании у некоторых представителей ксилотрофных базидиомицетов. 218
4:2. Влияние концентрации кислорода на рост и продуктивные свойства некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры 226
Глава 5. Особенности развития видов ксилотрофных базидиомицетов с различными трофическими стратегиями в условиях чистой культуры 232
5.1. Развитие культур видов с различными трофическими стратегиями на распространенных агаризованных средах 232
5.2. Использование парааминобензойной кислоты в качестве фактора, оптимизирующего развитие мицелия редких и ценных с позиций биотехнологии видов ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре . 237
5.3. Использование соединений селена при,культивировании штаммов ксилотрофных базидиомицетов разных трофических стратегий .243
Глава 6. Возможности использования соединений селена при хранении коллекционных культур ксилотрофных базидиомицетов 251
Глава 7. Адаптация некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов к воздействию полиенового макролида нистатина 260
7.1. Особенности толерантных к действию токсичных концентраций нистатина штаммов Ganoderma lucidum... 260
7.2. Особенности толерантных к действию токсичных концентраций нистатина штаммов Pleurotus ostreatus... 268
Глава 8. Использование комплексных источников целлюлозы и лигнина при культивировании штаммов ксилотрофных базидиомицетов 272
8.1. Влияние различных по структуре комплексных источников целлюлозы и лигнина на рост и развитие мицелия ксилотрофных базидиомицетов 272
8.2. Активность некоторых ферментов ксилотрофных базидиомицетов при твердофазном культивировании 277
8.3. Штаммовые особенности ферментативной активности представителей грибов белой гнили на лигноцеллюлозном субстрате 284
8.4. Влияние экстракта перколированного лигнина на процесс синтеза эргостерина штаммами некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов 288
8.5. Влияние лигноцеллюлозных компонентов субстрата на процессы гоюдообразования у ксилотрофных базидиомицетов в условиях чистой культуры 292
Глава 9. Технология получения базидиом и возможности использования продуктов на основе мицелия Ganoderma lucidum 305
9.1. Оригинальные рецептуры субстратов и технология получения плодовых тел Ganoderma lucidum 305
9.2. Возможности использования*мицелия G. lucidum в качестве кормовой добавки к рациону сельскохозяйственной птицы 314
9.2.1. Влияние кормовых добавок на основе мицелия G.lucidumna, биохимические показатели сыворотки крови птиц родительского стада 315
9.2.2. Влияние кормовой добавки на основе мицелия G. lucidum к рациону птиц родительского стада на продуктивность, биохимические и инкубационные показатели яиц 323
Заключение 327
Выводы 335
Список литературы 338
Приложение 1 371
- Коллекции культур базидйальных макромицетов как возможность максимального раскрытия и сохранения их природного потенциала
- Связь внутривидового (штаммового) полиморфизма видов ксилотрофных базидиомицетов,с их экологическими особенностями
- Влияние концентрации кислорода на рост и продуктивные свойства некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры
- Использование парааминобензойной кислоты в качестве фактора, оптимизирующего развитие мицелия редких и ценных с позиций биотехнологии видов ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре
Введение к работе
Актуальность темы. Ксилотрофные базидиальные макромицеты - уникальная группа организмов, способная к полной деструкции лигноцеллюлоз, обеспечивающая мобилизацию депонированного в древесине углерода (Мухин, 1993). В качестве специфического компонента экосистем, составляющего основу механизма регуляции процессов накопления и разложения растительных остатков, ксилотрофные базидиомицеты представляются весьма актуальными объектами исследования. Ряд крупных монографический работ второй половины XX века (Бондар-цев, 1953; Бондарцева, Пармасто, 1986; Бондарцева, 1998; Erikson et al, 1973-1988; Jtilich, Stalpers, 1980) предопределил интенсивное развитие экологического направления исследований этой группы грибов. За рубежом преобладающим стал природоохранный аспект (Knudsen, Vesterholt, 1990; Kotiranta, Niemela, 1996), а в отечественных исследованиях реализовывались традиции классической экологии (Бондарцева, 2000; Мухин, 2003; Стороженко, 2002; Змитрович и др., 2003; Сафонов, 2003; Арефьев, 2006 и др.). На сегодняшний день довольно ограничены сведения, касающиеся аспектов биологии видов, различающихся экологическими особенностями, в условиях культуры, о потенциале различных географических и экологических изолятов in vitro, возможностях сохранения генофонда редких и охраняемых видов в качестве мицелиальных культур. Однако, только в условиях чистой культуры возможно детальное исследование экологических особенностей вида и установление параметров, оптимальных для реализации природного потенциала гриба. В последние десятилетия ксилотрофные базидиомицеты заняли одно из ведущих мест в качестве объектов биотехнологии.
Вышесказанное свидетельствует об актуальности исследований экологии ксилотрофных базидиомицетов, целесообразности создания коллекций их чистых культур, располагающих достаточным объемом экспериментального материала и работы с природными изолятами, потенциально перспективными в биотехнологии.
Цель и задачи исследований. Цель работы - выявление экологических особенностей ксилотрофных базидиомицетов в лесных экосистемах лесостепи Правобережного Поволжья и оценка физиологического и биотехнологического потенциала изолятов видов с различными экологическими особенностями в условиях чистой культуры. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
изучить таксономическую и трофическую структуру биоты ксилотрофных базидиомицетов с учетом особенностей их взаимодействия с древесными субстратами в районе исследований;
исследовать функциональные роли группировок видов ксилотрофных базидиомицетов в сукцессионном ряду разложения древесины;
создать коллекцию изолятов ксилотрофных базидиомицетов, вызывающих разные типы гнилей древесины, выделенных с различных древесных пород и субстратов различной степени деструкции;
разработать оптимальные приемы культивирования видов с учетом их экологических особенностей и степени функциональной зависимости физиологического потенциала от условий культивирования;
разработать приемы, обеспечивающие максимальную сохранность морфоло-го-физиологических параметров мицелиальных культур и генофонда редких и занесенных в Красные Книги РФ и Пензенской области видов;
исследовать влияние ряда лимитирующих экологических факторов на мице-лиальные культуры ксилотрофных базидиомицетов в лабораторных условиях с целью установления пределов толерантности и оценки связи устойчивости к различным воздействиям с эколого-биологическими особенностями видов;
изучить роль метоксильных групп лигнина, как трофического и корригирующего процессы морфогенеза фактора;
- выявить взаимосвязь между эколого-физиологическими особенностями
культур и их биотехнологической перспективностью.
Научная новизна и теоретическая значимость. Изучены экологические особенности ксилотрофной микобиоты лесостепи Правобережного Поволжья, установлены закономерности формирования трофических связей видов и древесных пород - их природных субстратов. Выявлена связь между широтой субстратной приуроченности видов грибов в природе и степенью внутривидового полиморфизма в культуре. Комплексно изучена роль важнейшей составляющей природного субстрата - лигнина как трофического и корригирующего фактора в развитии ксилотрофных базидиомицетов. Изучены механизмы адаптации ксилотрофных базидиомицетов к фунгициду полиеновой природы. Установлено стимулирующее влияние метоксильных групп лигнина на процесс синтеза эргостерина и плодоношение в культуре у грибов белой гнили.
Практическая значимость. Создана коллекция мицелиальных культур базидиомицетов - представителей ксилотрофной микобиоты лесостепи Правобережного Поволжья. Коллекция включает 44 вида и 215 штаммов грибов, принадлежащих
к разным систематическим и экологическим группам, в том числе в ней представлены редкие и занесенные в Красные Книги РФ и Пензенской области виды. Показаны возможности культивирования видов, независимо от их субстратной специфичности в природе, на субстратах, содержащих экстрагированные метоксилиро-ванные лигноцеллюлозные компоненты. С помощью разработанного метода скрининга отобраны штаммы ксилотрофных базидиомицетов, перспективные в качестве продуцентов стеринов. Получены положительные решения по заявкам на патентование оригинальной рецептуры субстратов и способа получения плодовых тел ксилотрофных базидиомицетов, перспективных в биотехнологии. Разработана биологически активная добавка к рациону сельскохозяйственных птиц на основе мицелия Ganoderma lucidum, которая апробирована в условиях крупнейшего птицеводческого комплекса Пензенской области (ООО ПТФ «Васильевская»). Подана заявка на патентование. Запатентован способ хранения мицелиальных культур, обеспечивающий сохранение продуктивных свойств штаммов и генофонда редких видов, в том числе, занесенных в Красные Книги РФ и Пензенской области. Полученные данные относительно особенностей экологии ксилотрофных базидиомицетов используются в процессе преподавания курсов «Экология» и «Основы экологии» в ФГОУ ВПО «Пензенская ГСХА». Положения, выносимые на защиту:
Лесные экосистемы лесостепи Правобережного Поволжья представляют собой богатый резерват видов и штаммов ксилотрофных базидиомицетов, составляющих различные эколого-трофические группировки.
Комплексная оценка экологического статуса вида в природе позволяет оптимизировать процесс искусственного культивирования, а статус чистой культуры расширяет возможности исследования важнейших сторон экологии ксилотрофных базидиомицетов в природе.
3. По эколого-физиологическим характеристикам культуры можно судить
о потенциальной метаболической активности и, как следствие, биотехнологиче
ской ценности штамма.
Широта субстратной специфичности в отношении древесных пород и стадии разложения древесины является одним из факторов, определяющих степень штаммового полиморфизма вида в культуре.
Метоксильные группы лигнина служат индуктором синтеза эргостерина у грибов белой гнили и стимулятором плодоношения ксилотрофных базидиомицетов.
Работа выполнена в лаборатории биохимии при кафедре биологии животных и ветеринарии Пензенской государственной сельскохозяйственной академии (свидетельство о состоянии измерений №264-224-2008), в соответствии с плановой тематикой "Исследование эколого-биохимического и биотехнологического потенциала ксилотрофных базидиомицетов" (№ гос. регистрации 0120.0850925), а также «Повышение продуктивных качеств животных и разработка рациональных технологий производства продукции животноводства в условиях Среднего Поволжья» (№ гос. регистрации 0120.1064496). В ходе исследований использовалась материальная и приборная база Центральной экоаналитической лаборатории Регионального Центра государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области (аттестат аккредитации в системе СААЛ РОСС PU. 0001.515921).
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конференциях, форумах и симпозиумах: Международной конференции, посвященной 80-летию кафедры микологии и альгологии МГУ и 90-летию М.В. Горленко «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии» (Москва, 1998); II Съезде ботаников «Проблемы ботаники на рубеже XX -XXI веков» (Санкт - Петербург, 1998); Международном симпозиуме «Проблемы изучения и охраны биоразнообразия и природных ландшафтов Европы» (Пенза, 2001); Международной конференции «Физиология и биохимия культивируемых грибов» (Саратов, 2002); 1-ом Международном Съезде микологов России (Москва, 2002); Всероссийской научно - практической конференции «Вопросы прикладной экологии» (Пенза, 2002); Всероссийской научной конференции, посвященной 130-летию со дня рождения И.И. Спрыгина «Охрана растительного и животного мира Поволжья и сопредельных территорий» (Пенза, 2003); Международной научной конференции «Биология, систематика и экология грибов в природных экосистемах и агрофито-ценозах» (Минск, 2004); Международной научно - практической конференции «Проблемы охраны природных ландшафтов и биоразнообразия России и сопредельных стран» (Пенза, 2004); Научно - практической конференции, посвященной памяти профессора А.Ф. Блинохватова «Образование, наука, медицина: эколого-экономический аспект» (Пенза, 2006); Всероссийской научно - практической конференции «Проблемы охраны и экологического мониторинга природных ландшафтов и биоразнообразия» (Пенза, 2007); Всероссийской научно - практической конференции «Мониторинг природных экосистем в зонах защитных мероприятий объектов по уничтожению химического оружия» (Пенза, 2007); Юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.В. Горленко «Высшие ба-зидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества» (Москва, 2008); II
Международном Съезде микологов России (Москва, 2008); Международной научной конференции, посвященной 135-летию со дня рождения И.И. Спрыгина «Биоразнообразие: проблемы и перспективы сохранения» (Пенза, 2008); V Международной конференции «Изучение грибов в биоценозах» (Пермь, 2009); I и II Междисциплинарных Микологических форумах (г. Москва, 2009, 2010); Всероссийской научно - практической конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Пенза, 2010); XX Международном Салоне Инноваций и инвестиций (Москва, 2010); Областном форуме «Инновационные технологии в медицине и фармакологии» (Пенза, 2011); Второй международной выставке «Инновации и технологии», (Москва, 2011), IV Российском форуме «Российским инновациям -Российский капитал» (Оренбург, 2011).
Публикации. Автором опубликовано 95 работ, включая 13 статей в изданиях, входящих в "Перечень периодических научных изданий, рекомендуемых ВАК ...", 66 работ (статьи и тезисы) в сборниках научных трудов, 2 монографии, 9 учебно-методических изданий по экологической тематике, получены 5 патентов РФ и 2 положительных решения о выдаче.
Личный вклад соискателя. Автору принадлежит идея исследования, разработка путей экспериментального выполнения и теоретическое обоснование всех основополагающих задач, поставленных в диссертационной работе, ключевая роль на всех этапах исследования и интерпретации полученных результатов. В совместных публикациях доля автора составляла от 20 до 60%.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 9 глав, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Работа изложена на 370 страницах машинописного текста, основная часть содержит 32 таблицы, 34 рисунка, 47 фотоиллюстраций. Список литературы включает 455 источников отечественных и зарубежных авторов.
Коллекции культур базидйальных макромицетов как возможность максимального раскрытия и сохранения их природного потенциала
Одним из первостепенных приемов, предваряющих любые лабораторные исследования, связанные с микроорганизмами, является выделение и поддержание чистых культур, что подразумевает создание коллекции. Коллекции микроорганизмов создаются в разных целях: для более глубокого познания разнообразия микробного мира, населяющего разные природные субстраты, изучения биологических особенностей разных видов, их функциональных различий, а также извлечения из каждого вида той пользы, которая в закодированном виде содержится в геноме (Лугаускас, Репечкене, 2002). Поэтому объем и специфика коллекций определяются, безусловно, целями исследований и направлениями научных изысканий. Практика создания коллекций культур микроорганизмов имеет давнюю историю. Естественно, что поддержание чистых культур в составе коллекций стало возможным лишь с появлением специальных средств (холодильные установки, стерилизаторы и т.п.). XX век был ознаменован бурным развитием коллекций культур микроорганизмов во всем мире, в связи с чем скоро возникла необходимость их общей систематизации. Наиболее существенные итоги работы- коллекций культур в Европе и в мире были подведены в 1981 году, в г. Брно (ЧССР), где с 20 по 24 июля проходила IV Международная конференция по коллекциям культур. Конференция была организованная Всемирной федерацией по кол-лекциям культур (WFCC), Чехословацкой коллекцией1 микроорганизмов (ССМ) при Университете Пуркине, Брно и Чехословацким микробиологическим обществом. Доклады, сделанные 250 представителями из 42 стран мира касались роли культур в науке, образовании, медицине и промышленности; хранения культур; биоопасности в коллекциях и их контроля; методов выделения и очистки культур. Подробный анализ деятельности конференции сделан Л.А. Беляковой и В.М. Благодатской (Белякова, Благо датская, 1983). В работе дан обзор состояния и деятельности существующих на тот момент европейских коллекций культур микроорганизмов: основанной в 1963 году Чехословацкой коллекции микроорганизмов (ССМ) при Университете Пуркине, г. Брно; созданной в 1964-1965 годах коллекции культур грибов (CCF) Карлова Университета в г. Праге; Чехословацкой коллекции культур грибов, разрушающих древесину, организованной еще в 1948 году в г. Братиславе профессором Рипачеком; богатой штаммами базидиомицетов коллекции культур (CBS) в г. Баарне, Нидерланды; коллекции Микологического института (CMI), г. Кью, Англия, основанной в 1947 году; коллекции культур высших грибов в г. Веймаре, Германия; наконец, коллекции культур базиди-альных грибов Норвежского лесного исследовательского института, основанной в 1937 году. Большой объем информации имеется по коллекциям дрожжей.
За период, прошедший с момента опубликования этих данных, в связи с интенсификацией этого направления науки, а также с грандиозным расширением информационных возможностей, в мире было создано множество коллекций самой разной направленности, а также единая справочная система: Всемирный справочник коллекций культур (World Data Center of microorganism, WDCM). В настоящий момент в справочнике содержится информация о 568 коллекциях культур в 68 зарегистрированных в WDCM странах. По данным статистики, среди 1534400 единиц культур, содержащихся в них, на первом месте бактериальные (684202 единиц), а на втором - грибные (488860 единиц). Микологические коллекции содержат в целом 25186 видов и подвидов грибов (http://wdcm.nig.ac.ip/CCINFO,xml31). Для микологов и биотехнологов, работающих с культурами грибов, наибольший интерес представляют именно микологические специализированные коллекции. Среди таких коллекций, зарегистрированных в WDCM, можно отметить (приводятся акроним и название коллекции): IIB-INTECH, Collection of Fungal cultures (Аргентина); RCDM, Republican Centre for Deposition of Microorganisms of the National Academy of Sciences and Ministry of Education and Science of Armenia (Армения); ACH, Mycology Culture Collection (Австралия); ACBR , Austrian Center of Biological Resources and Applied Mycology (Автрия); CCB Colecao de Culturas de Basidiomicetos (Бразилия); CCFC, Canadian Collection of Fungal Cultures (Канада); CCBAS, Culture Collection of Basidiomycetes (Греция); IBT, IBT Culture Collection of Fungi (Дания); TFC, Tartu Fungal Culture Collection (Эстония); LCP, Fungal Strain Collection, Laboratory of Crypogamy (Франция); FSU PRZ, Pilz-Referenz-Zentrum (Fungal Reference Centre) Jena (Германия); PPIHAS, Mycology Collection (Венгрия); NFCCI, National Fungal Culture Collection of India и VPCI, Fungal Culture Collection (Индия); IRAN, Iranian Fungal Culture Collection (Иран); TAUFCC, Fungal Culture Collection (Израиль); TIMM, Institute of Medical Mycology и TSY Laboratory of Mycology, Division of Microbiology (Япония); CCARM, Culture Collection of Antimirobial Resistant Microorganisms и CCWM, Culture Collection of Wild Mushroom (Корея); BMFM-UNAM, Culture Collection of Fungal Pathogens Strains from the Basic Mycology Laboratory of the Department of Microbiology and Parasitology Faculty of Medicine (Мексика); CBS, Centraalbureau voor Schimmelculrures, Fungal and Yeast Collection (Нидерланды); FCBP, First fungal culture bank of Pakistan и NFCCP, National Fungal Culture Collection of Pakistan (Пакистан); PPRI, National Collection of Fungi: Culture Collection (ЮАР); FCUG, Fungal Cultures University of Goteborg (Швеция); NCWRF, Na tional Collection of Wood Rotting Fungi (Англия); FGSC Fungal Genetics Stock Center (США).
В настоящее время большинство коллекций в Европе являются членами ЕССО (Европейской организации коллекций культур), часть из них выступает в качестве международных депозитариев (International Depositari Authorities, IDA). К их числу относится наиболее крупная коллекция Российской Федерации - Всероссийская коллекция микроорганизмов ВКМ (VKM) (Коч-кина, 1996). География ВКМ охватывает практически всю территорию России, коллекции, представленные в разных городах, имеют самую разнообразную направленность: коллекции клеточных и тканевых культур, зоо- и фито-патогенных организмов, вирусов, бактерий, грибов самых разных таксономических групп (рис. 1).
Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМИБФМ РАН) в течение ряда лет является ведущей организацией по Федеральной научной про грамме «Биоразнообразие» (основное направление — «Коллекции живых культур») (Озерская и др., 2002). По итогам выполнения программы создан сводный каталог культур микроорганизмов российских коллекций, включающий и мицелиальные грибы. В настоящее время в России действуют 14 грибных коллекций, 10 из которых участвовали в данной программе. Совокупный фонд поддерживаемых в коллекциях России грибных культур составляет в настоящее время около 8000 штаммов, большая часть которых помещена в сводный каталог. Видовое разнообразие грибов, поддерживаемых в коллекциях России, сейчас насчитывает примерно 1700 видов, относящихся к 489 родам. При этом отмечено увеличение совокупного фонда грибов на 3000 штаммов по сравнению с ВКМ, а разнообразие его - почти на 500 видов. Большая часть этого разнообразия представлена в коллекциях институ-тов Академии наук РФ, что объясняется, в первую очередь, стремлением исследователей к сохранению в искусственных условиях максимально возможного разнообразия выделяемых культур. Для коллекций прикладных институтов (таких как ВКПМ, ВНИИА, ВНИИПАКК) более характерно сохранение и поддержание продуцентов известных метаболитов, что приводит к ограничению разнообразия фондов несколькими десятками известных своими потенциальными возможностями родов грибов.
Связь внутривидового (штаммового) полиморфизма видов ксилотрофных базидиомицетов,с их экологическими особенностями
Разложение древесины сосны в качестве моновалентных стенотрофов осуществляет значительная доля облигатных паразитов, вызывающих стволовые гнили, в первую очередь Phellimis ріпі; на корнях и основаниях стволов развиваются Heterobasidion annosum, Phaeolus schweinitzii, Sparassis crispa. На ослабленных деревьях сосны как паразит себя , проявляет Fomitopsis pinicola, однако чаще вид встречается на отмершей древесине. В отдельных случаях как паразит себя может проявлять Thelephora terrestris, поражающий 1-3 летние сеянцы сосны. Это явление проявляется обычно среди загущенного самосева на песчаных почвах (Шубин, 1973). С древесиной сосны связаны и множество видов — поливалентных стенотрофов: на живых стволах развиваются также виды, связанные с мертвыми покровными тканями (Мусепа purpureofasca и М. viscose); на свежем отпаде сосны крупного диаметра встречается Lentinus lepideus; на пнях и сухостое - Coriolellus serialis, Fomitopsis pinicola, Memliopsis taxicola, Trichaptum abietinum, Armillaria borealis, Hypholoma capnoides, H. radicosum, Paxillus panuoides, Pluteus ati-omarginatus, Tricholomopsis ornata, T. rutilans, Xeromphalina campanella. Основным деструктором веточного отпада сосны является Hygrophoropsis aurantiaca, который развивается как на свежем, так и на сильно разложившемся, погребенном в подстилку отпаде хвойных.
На древесине еще одной широко распространенной породы - березы, из моновалентных стенотрофов берез можно отметить только Inonotus obliquus и Piptoporus betulinus. Прочие виды, поражающие указанную породу, имеют более широкие трофические диапазоны и являются поливалентными стенотрофами.
К эвритрофам второго порядка в районе исследований следует отнести виды, поражающие значительный набор лиственных пород: Ganoderma applanatum, Chondrostereum purpureum, Crepidotus mollis, Peniophora inclinata, Schizophyllum commune, Stereum hirsutum, Trametes gibbosa, T. hirsuta, T. versicolor, Kuehneromyces mutabilis, Pleurotus pulmonarius, Hypholoma sublateritium, Oudemansiella platyphylla, Pholiota curvipes, Phyllotopsis nidulans, Polyporus coronatus, P. melanopus, Armillaria ostoyae и другие.
Эвритрофы первого порядка образуют наименьшую по числу группировку и представлены в районе исследований видами: Fomitopsis pinicola, Bjerkandera adusta, Fomes fomentarius, Crucibuhim leave, Armillaria mellea, Flammulina velutipes.
В коллекции мицелиальных культур ксилотрофных базидиомицетов, созданной на базе биохимической лаборатории технологического факультета Пензенской сельхозакадемии поддерживаются 215 штаммов 44 видов ксилотрофных базидиомицетов. Среди них представлены виды, относящиеся к разным семействам порядков: Hymenochaetales: Coltricia perennis (L.) Murrill, J. Mycol., Inonotus dryadeus (Pers.) Murrill, Inonotus obliquus (Pers.: Fr.) Pilat, Phellinus igniarhts (L.) Quel., Ph. ріпі (Brot.) Bondartsev & Singer, Ph. robustus (P. Karst.) Bourdot & Galzin, Ph. tremulae (Bondartsev) Bondartsev & P.N. Borisov; Polyporales: Sparassis crispa (Wulfen) Fr., Daedalea quercina (L.) Pers., Fomitopsis pinicola (Sw.) P. Karst., Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill, Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst., Ganoderma applanatum (Pers.) Pat., Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst., Bjerkandera adusta (Willd.) P. Karst., B.fumosa (Pers.) P. Karst., Daedaleopsis confragosa (Bolton) J. Schrot, Fomes fomentarius (L.) J.J. Kickx, Lenzites betalina (L.) Fr., L. warnieri Durieu & Mont., Polyporus squamosus (Huds.) Fr., P. varius (Pers.) Fr., Pycnoporus cinnabarinus (Jacq.) P. Karst., Trametes gibbosa (Pers.) Fr., T. hirsuta (Wulfen) Pilat, T. pubescens (Schum.; Fr.) Pilat, T. suaveolens (Fr.)Fr., T. versicolor (L.) Lloyd; Russulales: Heterobasidion annosum (Fr.) Bref., Stereum hirsutum (Willd.) Pers.; Agaricales: Chondrostereum purpureum (Pers.) Pouzar, Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth, Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm., Flammulina velutipes (Curtis) Singer, Pleurotus cornucopiae (Paulent) Rolland, P. dryinus (Pers.) P. Kumm., P. ostreahis (Jacq.) P. Kumm., P. puhnonarius (Fr.) Quel., Schizophyllum commune Fr., Pholiota aurivella (Batsch) P. Kumm., P. decussata (Fr.) M.M. Moser, Phyllotopsis nididans (Pers.) Singer; Thelephorales: Thelephora terrestris Ehrh., Auriculariales: Auricidaria mesenterica (Dicks.) Pers.
Отбор видов для? включения в коллекцию осуществлялся с учетом потенциальной ценности (с позиций биотехнологии) и статуса вида (редкий, исчезающий), учитывалась также сама возможность развития вида в культуре.
Среди изученных в условиях чистой культуры видов представлены несколько групп: доминантные, широко распространенные и обычные виды, среди них как эври- так и стенотрофные в отношении субстратов; занимающие различные места в сукцессионных рядах, то есть поселяющиеся на древесине разной степени разложения; высокоспециализированные и редкие в регионе виды (табл. 4). С позиций наших исследований, интерес представлял анализ трофической приуроченности видов, составляющих ядро ксилотрофной микобиоты региона, а также редких видов и поиск связей между особенностями экологии видов и штаммов и характером их развития в условиях культуры.
Для выделения штаммов в чистую культуру отбирались плодовые тела одних и тех же видов, развивающиеся как на живом, так и на мертвом древесном субстрате (за исключением паразитов, обнаруженных только на живых деревьях). Видам номинировали трофический статус, исходя из системы В.Г. Стороженко (2002), однако с учетом региональных особенностей. В .таблице 4 приводятся данные о происхождении коллекционных штаммов ксилотрофных базидиомицетов, а также их культурально-морфологические характеристики. Для определения принадлежности вида к той или иной трофической группировке использовались наблюдения, сделанные в природных условиях района исследования, информация о которых находится в Приложении 1.
Влияние концентрации кислорода на рост и продуктивные свойства некоторых видов ксилотрофных базидиомицетов в условиях глубинной культуры
Установлено наличие трех групп видов: у видов первой группы значение QW превышает 0,40 ед.; второй — составляет не более 0,30 ед., а виды третьей, немногочисленной группы имеют промежуточные значения: 0,30 QW 0,40. При сопоставлении полученных результатов с эколого-трофическими характеристиками видов в природе, обнаружена связь штам-мового разнообразия в культуре с широтой трофического диапазона вида в природе (рис. 19). Установленные закономерности имеют место и у видов, представленных в коллекции менее, чем пятью штаммами, однако в связи с малой выборкой данные на представлены.
Попытки обнаружить закономерности между степенью штаммовой вариабельности и систематической принадлежностью видов, а также типом и характером вызываемой гнили результатов не дали. Однако при сопоставлении полученных результатов с эколого-трофическими характеристиками видов в природе, обнаружена связь штаммового разнообразия в культуре с широтой-трофического диапазона вида в природе, что подтверждает наши предположения. Максимальной вариабельностью (QW 0,40) обладают виды, относящиеся к эвритрофам первого и второго порядков с позиций разнообразия древесных субстратов произрастания и их степени разложения. Виды, харак 207 теризующиеся выраженной спецификой местообитания и трофической специализации, не проявляют в культуре значительной вариабельности в характеристиках штаммов (QW 0,30).
Таким образом, установлено, что максимальной вариабельностью обладают виды, относящиеся к эвритрофам первого и второго порядка в эколого 208 трофическом отношении с позиций разнообразия древесных пород в качестве субстратов произрастания. Для их штаммов характерны существенные различия в скоростях роста, различаются и типы колоний (признаки устойчиво воспроизводятся после 5 пассажей). При этом отдельные штаммы имеют ярко выраженную тенденцию к образованию зачатков плодовых тел или развитой стадии телеоморфы в чистой культуре на стерильных агаризованных средах, а у других штаммов тех же видов целенаправленное получение телеоморфы весьма проблематично и не всегда результативно. Микроструктура мицелия различна: для некоторых штаммов одного и того же вида отмечены анаморфы различного характера, для других они не обнаружены вовсе. Наиболее стабильным видовым показателем служит наличие или отсутствие пряжек на дикариотичном мицелии. В качестве примера в этом случае следует привести виды родов Bjerkandera, Trametes, а также Fomes fomentarius, Chizophyllum commune, Stereum hirsutum и некоторые другие. Виды, занимающие узкие экологические ниши и характеризующиеся выраженной спецификой местообитания и трофики, не проявляют в культуре широкой ва-риабельности в характеристиках штаммов. Более того, для большинства из них морфология мицелия столь типична и отлична от штаммов других видов, причем любой из изученных штаммов практически идентичен другому, что делает «узнаваемым» в культуре данный вид. Это относится к штаммам таких родов, как Lenzites, Phellinus и видов, как Coltricia perennis, Inonotus obliquus, Heterobasidion annosum, Fistulina hepatica, Thelephora terrestris, Auricularia mesenterica.
Также на общем фоне определенную долю составляет группа видов, для которых характерна средняя степень вариабельности культуральных признаков, незначительная разница в скоростях роста, слабо выраженные отличия в структуре колоний. Различия в микроструктуре мицелия практически не отмечены. К этой группе следует отнести представителей родов Polyporus, !И виды Ganoderma lucidum, Pleurotus ostrtatus, Flammulina velutipes, Pycnoporus cinnabarinus. При этом три последних вида также имеют типичную, «узнаваемую» макроморфологию в культуре, а полученные значения вариабельности объясняются у них разными скоростями роста мицелия. В природе же, как известно, эти виды тяготеют к древесине мягких пород. Ganoderma lucidum, напротив, предпочитает твердолиственные породы, штаммы характеризуются заметными различиями) в макроморфологии колоний, прочие же признаки не проявляют значительной вариабельности.
Полученные данные целесообразно систематизировать, предложив три группы видов в соответствии с их природными эколого-трофическими особенностями и культуральными признаками штаммов (табл. 9).
Анализ связи внутривидового полиморфизма в культуре и степени раз- і ложения субстрата, с которого были выделены изученные штаммы, достоверных закономерностей не обнаружил. В этом отношении, на видовом уровне, была установлена связь между трофической стратегией вида, а, соответственно, и состоянием субстрата, с которого был выделен изолят, и ростовыми показателями культуры. Обнаруженные закономерности описаны в разделе 5.1.
Использование парааминобензойной кислоты в качестве фактора, оптимизирующего развитие мицелия редких и ценных с позиций биотехнологии видов ксилотрофных базидиомицетов в чистой культуре
С использованием классических подходов к рецептуре глубинной среды (среда Чапека) были установлены некоторые показатели развития в условиях погруженной культуры у изученных видов ксилотрофных базидиомицетов, представленных в коллекции не менее чем тремя штаммами (табл:. 11). В наших экспериментах использовалась многогнездная «качалка» с эксцентриситетом 2,5 см и скоростью вращения 220 об/мин. Объем среды к объему колбы составлял соотношение 1:10 (45 мл среды в колбе Эрленмейера объемом 500 мл), содержание растворенного кислорода при вращении 4,09±0,05 мг/л). Инокуляция осуществлялась путем смыва 5 мл стерильного физиологического раствора с поверхности растущей на скошенном агаре чистой культуры.
Проведенные эксперименты по выращиванию культур в глубинных условиях на среде Чапека позволили обнаружить, что для некоторых штаммов требуется не менее 10-14 суток для максимального накопления биомассы (например, для штаммов видов L. sulphureus, G. applanatum, G. lucidum, P. cinnabarinus). Однако мицелий других штаммов по мере наступления ранней идио-фазы быстро подвергается автолизу, поэтому для получения представительных результатов в настоящем опыте определяли биомассу мицелия, уже на 10 сутки развития. После 10 суток культивирования в условиях качалки глубинный мицелий (пеллетный или филаментный, в зависимости от вида) отфильтровывали, и на бумажном фильтре высушивали до постоянного веса.
Были обнаружены существенные различия в морфологии глубинного мицелия у разных видов (Приложение 2). Так, филаментный рост, иногда сопровождающийся формированием рыхлых пеллетоподобных структур, или клубков, на поздних стадиях развития, характерен для развивающегося в условиях глубинной культуры мицелия видов родов Bjerkandera, видов С. perennis, I. dryadeus, I. obliquus, S. hirsutum, F. hepatica, S. commune. Типичные филаменты представляют собой рыхлые нитчатые образования аморфной структуры, которые могут присутствовать как единичные элементы, так и образовывать объемные конгломератные комплексы (см. Приложение 2). Размеры филаментных скоплений и длины отдельных филаментов варьировали в широких пределах (последние от 1,0 мкм до 5,0 мм).
Иной морфотип мицелия при развитии в условиях глубинной культуры характерен для комплекса видов родов Phellinus, Polyporus, а также видов P. betulinus, L. sulphureus, Н. annosum, F. pinicola. Культуры названных видов образуют обильно опушенные округлые или продолговатые структуры, подобные пеллетам. Причем плотная часть такой пеллеты приходится на ее центр, а по направлению в периферии она становится все более рыхлой. В зависимости от вида, а иногда и от штамма, размер структур мог быть единым, а мог варьировать в достаточно больших пределах (от 10,2 мкм до 1,7 мм). Типичные опушенные пеллеты представлены на рисунках в Приложении 2.
Третий морфотип глубинных мицелиальных структур представлен плотными пеллетами с гладкой, лакированной поверхностью, причем размер структур варьирует в наиболее значительной степени (от 1,0 мм до 22,5 мм). Важно, что при одинаковом способе инокуляции в ходе глубинного культивирования, которое сопровождается определенным механическим воздействием на мицелий в ходе перемешивания, для некоторых культур характерна тенденция к конгломерации клеток, и формированию единичных крупных глыб, а для других, напротив, к дроблению на множественные индивидуальные образования. В частности, штаммы представителей родов Ganoderma, Lenzites и Trametes, а также штаммы видов F. fomentarius, P.cinnabarinus характеризовались типичным пеллетным ростом. У двух, представителей рода Ganoderma пеллеты были очень компактными, со слабо выраженными филаментными выростами (см. Приложение 2).
В большинстве случаев формировались достаточно мелкие пеллеты (0,1— 4,5 ММ)І однако, для таких видов; как F.fomentarius,. Р:cinnabarinus характерно образование довольно крупных гладких глыбчатых структур. . Наконец, гигантские пеллеты, единичные; с . тенденцией к дифференцировке мицелия внутри такой: структуры, отмечены у штаммов: представителей родов Trametes, Eensites (см. Приложение 2);
Анализ, данных таблицы свидетельствует, что образование пеллет у і афиллофороидных грибов характерно для видов с димитической и ! ! тримитической гифальными системами, тогда как преимущественно ] филаментный рост — для видов с мономитической (табл. 11, 12; табл. 2 в главе 2). Для. грибов с димитической гифальной системой отмечено образование пеллет, а с тримитической — наиболее плотных пеллет, зачастую с тенденцией к дифференциации. Внутри такой пеллеты формируется своеобразное «ядро», отличающееся от периферического мицелия. Мицелий «ядра» более светлый, плотный, структура соответствует структуре скелетного мицелия, его плотные лучеобразные тяжи» радиально внедряются в массу обводненного периферического мицелия. Таким образом, при анализе всего1 обнаруженного разнообразия морфологии структур глубинного мицелия наблюдается своеобразная параллель: моно— ди— тримитическая гифальная система и филаменты — рыхлые пеллеты — плотные пеллеты пеллеты с внутренней дифференциацией (табл. 12).
