Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Химическое загрязнение водных экосистем 13
1.1.Тяжёлые металлы как приоритетные загрязнители окружающей среды 13
1.2. К вопросу о состоянии химического загрязнения водных экосистем 19
1.3. Донные отложения как объект биомониторинга водных экосистем 28
1.4. Нормирование содержания загрязняющих веществ в донных отложениях 31
ГЛАВА II. Химическое загрязнение как один из факторов мутагенной опасности окружающей среды 33
2.1. История и методы генотоксикологии 33
2.2. Использование различных тест-систем для оценки генотоксического состояния морских и пресноводных экосистем 41
ГЛАВА III. Объект, материалы и методы исследования 48
3.1. Описание объекта исследования 48
3.2. Материал и методы исследования 51
3.2.1. Методы определения содержания неорганических загрязнителей в цельном грунте и водной вытяжке донных отложений 53
3.2.2. Методы определения мутагенной активности 54
3.2.2.1. Метод учета видимых мутаций у Ch. vulgaris 55
3.2.2.2. Метод учета хромосомных аберраций у А1. сера.. 59
3.2.2.3. Метод учета доминантных летальных мутаций у Dr. melanogaster 63
3.2.3. Методы статистической обработки результатов 68
Характеристика загрязнения металлами донных отложений водных экосистем оренбургской области 69
4.1. Оценка состояния химического загрязнения донных отложений водоемов и водотоков Оренбургской области (2004 г.) 69
4.2.Экологическая оценка содержания металлов в донных отложениях в долях от экологических нормативов (2004 г.) 78
4.3. Оценка химического загрязнения донных отложений водоемов и водотоков Оренбургской области (2007 г.) ... 84
4.4. Экологическая оценка содержания металлов в донных отложениях в долях от экологических нормативов (2007 г.) 92
Временная динамика загрязнения тяжёлыми металлами донных отложений водных экосистем оренбургской области 96
5.1. Динамика межгодовых изменений в содержании тяжёлых металлов в цельном грунте водотоков и водоёмов Оренбургской области 96
5.2. Оценка межгодовых изменений экологического
состояния водных экосистем Оренбургской области 103
Характеристика качества и уровня неорганического загрязнения водорастворимой компоненты донных отложений водных экосистем оренбургской области 105
ГЛАВА VII. Пространственная и временная динамика генотоксическои активности донных отложений водных экосистем на территории оренбургской области (2004 г. и 2007 г.) 128
7.1. Генотоксическая активность донных отложений водотоков и водоемов Оренбургской области (2004 г.) 128
7.2. Генотоксическая активность донных отложений водотоков и водоемов Оренбургской области (2007 г.)... 145
7.3. Временная динамика мутагенной активности донных отложений водных экосистем Оренбургской области 155
7.4. Пространственная динамика мутагенной активности донных отложений водных экосистем Оренбургской области 160
ГЛАВА VIII. Корреляционный анализ химического загрязнения и мутагенной активности донных отложений водных экосистем
оренбургской области 164
Заключение 172
Выводы 181
Список литературы 183
Приложения 201
- К вопросу о состоянии химического загрязнения водных экосистем
- Использование различных тест-систем для оценки генотоксического состояния морских и пресноводных экосистем
- Метод учета доминантных летальных мутаций у Dr. melanogaster
- Оценка химического загрязнения донных отложений водоемов и водотоков Оренбургской области (2007 г.)
Введение к работе
Актуальность работы: Одной из глобальной проблем современности является загрязнение окружающей среды, в результате которого происходит деградация биосферы. В число наиболее опасных загрязнителей природной среды входят ТМ, а в последние годы возросли и масштабы поступления редкоземельных металлов. Данные поллютанты не подвергаются процессам разложения и перераспределяются между отдельными компонентами экосистемы, аккумулируются в донных отложениях, представляющих собой сложную многокомпонентную систему (Баканов А.И., 1999; Медянкина М.В., 2007), которая может рассматриваться в качестве информативного показателя состояния экосистемы. Накопление загрязняющих веществ в ДО является одной из причин временного выведения их из круговорота и самоочищения водной среды, но загрязнение экосистемы при этом сохраняется (Линник П.Н., 2006; Овсяный Е.Н., 2003), а при определенных условиях ДО могут выступать в роли источника вторичного загрязнения. В связи с этим, одним из наиболее важных критериев оценки состояния экосистемы является отсутствие накопления химических элементов в ДО реки, особенно вблизи возможных источников техногенного загрязнения (Головина В.В. и др., 1996).
Химические поллютанты могут выступать в качестве мутагенов, либо промутагенов, поэтому при изучении водоёмов важной составляющей является оценка генотоксической ситуации. Генотоксиканты – поллютанты, способные нарушать генетические структуры и процессы, приводящие к увеличению частоты наследственных и онкологических заболеваний, врождённых пороков развития, снижению иммунитета и преждевременному старению организма, что может приводить к серьёзным негативным последствиям, вплоть до вырождения и вымирания видов (Абилев С.К., 2003). В связи с этим для научной разработки природоохранных мероприятий очевидна необходимость оценки генотоксической активности водотоков, и особенно малых рек. Однако в настоящее время особенности динамики генотоксической ситуации в малых реках, подвергающихся антропогенному прессу, в том числе и воздействию генотоксикантов, изучены не достаточно, хотя они являются начальным звеном формирования водных ресурсов страны и определяют состояние средних и крупных рек, водоёмов и ресурсов подземных вод, играют важную хозяйственную и рекреационно-оздоровительную роль, на их берегах проживает большая часть населения (Кондратьева Л.М., 2006).
В Оренбургской области проблема загрязнения водных экосистем освящена в ряде работ, проведенных с использованием гидрохимических показателей, имеются данные по состоянию донного осадка на территории области. В работах Боева В.М., Куксанова В.Ф. и Быстрых В.В. (2002) показано, что распределение концентраций элементов в ДО на территории области в целом отражает содержание их в почве. Рядом авторов (Боев В.М., Красиков С.И., Перепёлкин С.В.и др., 2003) была дана оценка содержанию ряда элементов в ДО открытых водоёмов Западной части Оренбургской области.
В рамках работы Ивановой И.Ю. (2009) были показаны различия в содержании отдельных металлов в цельном грунте и ВВДО городских и сельских территорий разных регионов области. Была дана оценка экологическому состоянию водотоков и водоёмов Оренбургской области по результатам биотестирования, установлена высокая токсичность ВВДО рек Блявы и Кураганки. Однако, отдалённые последствия действия экотоксикантов, связанные с повреждением генетического аппарата, остаются неизученными. Указанный комплекс нерешённых вопросов определяет актуальность проведенных исследований.
Цель работы: оценка экологического состояния водных экосистем Оренбургской области на основе мониторинга химического и генотоксического загрязнения донных отложений.
Задачи исследования
-
Определить суммарную нагрузку металлами твёрдой фракции ДО, проследить временную динамику в их содержании, установить вклад отдельных поллютантов в экологическое состояние водных экосистем Оренбургской области, выявить приоритетные загрязнители и экосистемы с высоким уровнем антропогенной нагрузки.
-
Ранжировать весь спектр обнаруженных в водной вытяжке донных отложений химических элементов и провести оценку содержания некоторых загрязнителей в водорастворимой компоненте неорганического загрязнения в сравнении с имеющимися для воды нормативами, выявить приоритетные загрязнители.
-
Исследовать спектр мутагенов, присутствующих в донных отложениях с использованием экспериментальных тест-объектов и дать характеристику генотоксической ситуации водных экосистем на территории Оренбургской области.
-
Изучить временные изменения мутагенной активности донных отложений в различных регионах Оренбургской области и пространственную динамику на ряде водотоков.
-
С использованием корреляционного анализа выявить зависимость различных типов мутаций от химического загрязнения цельного грунта и водной вытяжки донных отложений, обозначить наиболее опасные генотоксиканты, выявленные в водных экосистемах на территории Оренбургской области.
Научная новизна. Установлено превышение большинства существующих нормативов по Cr и Ni в цельном грунте. Выявлены аномальные концентрации металлов в водных экосистемах: Западного региона Mg, Ni; Центрального Li, Fe, Al, Mn, Cr, Zn, Pb, Урала и Сакмары в районе Оренбурга Cu, Zn, Pb (2004 г.), Cd, Hg в водных экосистемах Центрального региона (2007 г.).
В межгодовой динамике зарегистрировано увеличение содержания в ДО Fe и Ni во всех регионах, в Центральном – ещё и Cr, в Западном - Cr и Cu, а в районе Оренбурга, помимо Fe и Ni, в 2 раза возросло содержание Mn.
Установлено сравнительное экологическое благополучие водных экосистем на территории Оренбургской области.
Рассчитаны индексы нагрузки элементами разных групп ВВДО, и дана оценка водных экосистем регионов по их нагрузке, впервые показано равномерное распределение щелочных и щелочноземельных металлов, повсеместное распространение РЗМ и максимальное поступление неметаллов в водотоки Восточной зоны.
Выявлено широкое распространение Hg: в цельном грунте её содержание повсеместно превышало норматив IEPA, а в ВВДО –ПДКр.х.
Впервые в лабораторных условиях с использованием нескольких тест-объектов проведено биологическое тестирование суммарной мутагенной активности ДО водных экосистем на территории Оренбургской области. Загрязнение водных экосистем области генотоксикантами оценено как высокое в оба года исследования, и выявлен широкий спектр мутагенов и промутагенов, вызывающих генные, геномные и хромосомные мутации. Во временной динамике в грунтах большинства водных экосистем произошла аккумуляция генотоксикантов с расширением спектра или его сменой, а на отдельных - загрязнение генотоксикантами перестало регистрироваться. Наибольшая степень МА и широта спектра мутагенов выявлены вблизи крупных городов и населенных пунктов.
Впервые установлена наиболее высокая положительная корреляционная связь между содержанием РЗМ и алюминием в ВВДО и мутациями разного типа.
Теоретическая и практическая значимость работы. Расширены знания об экологическом состоянии водных экосистем на территории Оренбургской области. Установлен широкий спектр водорастворимых форм неорганических загрязнителей, содержащихся в ДО, оценен уровень суммарной мутагенной активности и прослежена пространственная и временная динамика. Выявлена наибольшая информативность водорастворимой компоненты донных отложений в эффективной оценке генотоксической ситуации водных экосистем, которая рекомендована к использованию в экологическом мониторинге.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования послужили основой для разработки методического письма по нормированию уровней содержания ТМ в донных отложениях поверхностных водных объектов, что имеет важное значение для совершенствования экологического мониторинга водных экосистем и решения практических вопросов хозяйственно-питьевого водоснабжения населения Оренбургской области. Результаты исследований внедрены в практическую деятельность Управления Роспотребнадзора по Оренбургской области (акт внедрения от 28.01.2011 г.), в работу научно-производственной фирмы «Экобиос» (акт внедрения от 29.03. 2011 г.).
Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре общей и коммунальной гигиены ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» (акт внедрения от 4.04 2011 г.); а также включены в практику выполнения выпускных квалификационных работ студентов ОГУ (акт внедрения от 3.02.2011 г.), материалы исследования внедрены в лекционный курс на кафедре биоэкологии и природопользования ОГАУ (акт внедрения от 23.03.2011 г.).
Апробация работы и публикации. Результаты исследования представлены в аналитических отчётах Оренбургского областного благотворительного общественного фонда памяти Дмитрия Соловых по экологическому проекту «Экологический мониторинг пресноводных экосистем и состояние здоровья населения», финансируемого согласно Распоряжению Президента РФ № 628 от 15 декабря 2006 года.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов: Оренбург, 2006, 2008, 2009; на Международной (Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции: Москва, 2006, 2008; на Всероссийской конференции с участием стран ближнего зарубежья «Экология пресноводных экосистем и состояние здоровья населения»: Оренбург, 2006; на IX Съезде Гидробиологического общества РАН: Тольятти, 2006; на конференции «Экологические проблемы уникальных природных и антропогенных ландшафтов»: Ярославль, 2006, 2007; на конференции «Молодежь и наука: итоги и перспективы»: Саратов, 2006, 2008; на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров: Москва, 2010; на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки»: Ярославль, 2010. Диссертация апробирована на расширенном заседании проблемной комиссии «Гигиена, экология, эпидемиология, общественное здоровье и здравоохранение» ОрГМА.
По теме диссертации опубликованы 17 работ, из них 6 статей в рецензируемых научных журналах, обозначенных в списке ВАК для опубликования основных научных результатов исследований на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.
Положения, выносимые на защиту.
-
Широкий спектр регистрируемых мутагенных эффектов у экспериментальных объектов свидетельствует о наличии генотоксикантов в водных экосистемах Оренбургской области с различным характером действия, претерпевающих пространственную и временную динамику.
-
Содержание водорастворимых форм неорганических поллютантов, как наиболее лабильных и генотоксически активных, – один из информативных показателей в оценке эколого-генотоксического состояния водотоков и водоёмов.
Объём и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста и включает введение, 2 главы обзора литературы, главу по материалам и методам исследования, 5 глав собственных исследований, заключение, выводы, приложение. Библиографический список содержит 174 отечественных и 66 зарубежных источников литературы. Текст иллюстрирован 20 таблицами и 64 рисунками.
Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование выполнено в ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития» в соответствии с открытым планом научно-исследовательской работы ГОУ ВПО «ОрГМА Минздравсоцразвития России» (№ гос. регистрации темы 01200614192). Работа выполнена при грантовой поддержке Президента РФ № 628 от 15 декабря 2006 г.
Благодарность. Автор выражает глубокую признательность сотруднику Института биологии внутренних вод РАН им. И.Д. Папанина к.х.н. М.В. Гапеевой, сотрудникам Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова к.б.н. И.М. Прохоровой, к.б.н. М.И. Ковалёвой, к.б.н. А.Н. Фомичёвой за консультации и помощь в проведении исследования.
Материалы и методы исследования
Материалом исследования являлись ДО водоемов и водотоков Оренбургской области. Пробы донных отложений отбирали с горизонта 0-10 см дночерпателем. В 2004 г. исследованы ДО 49, в 2007 г - 21 станций. Содержание металлов в пробах 2004 г. определялось методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICAP – 61, США) на базе Института биологии внутренних вод имени И.Д. Папанина РАН к.х.н. М.В. Гапеевой. Определение металлов в образцах ДО 2007 г. проводилось атомно-абсорбционным методом на анализаторе «Спектр-5» на базе лаборатории Федерального государственного учреждения Государственный центр агрохимической службы «Оренбургский». Определение ртути произведено с помощью ртутно-гидридной системы РГС – 1 по МУ М. ЦИНАО 1992 год.
Для оценки загрязнения ДО использовали параметр М±2, где М – средняя концентрация, – стандартное отклонение. Концентрации, отличающиеся от средних более чем на удвоенное значение стандартного отклонения (М±2), считали аномальными (Экологические проблемы Верхней Волги, 2001). Также использовали ПДК для почв (Г.Н. 2.1.7.2041-06), но грунты водоемов коренным образом отличаются от почв, поэтому сравнение наших результатов было проведено с рекомендованными концентрациями тяжелых металлов для ДО, разработанными в разных странах: IEPA, IJС, MOE (Ingersoll C.G, Nelson M.K., 1990) и нормативами, принятыми в Нидерландах: «намеченный» (экологический) («Streewaarde» S) и «нормативы санации» («Interventiewaarde» I). Условно считается, что при соблюдении «намеченного» (экологического) норматива экосистеме не наносится ущерба (Волга в Череповце…, 1996). Содержание ряда металлов сравнивали с фоновыми концентрациями ТМ в ДО пресноводных водоемов северной Cкандинавии и Кольского полуострова (Даувальтер В.А., 2001).
Одновременно с анализом цельного грунта в 2004 г выполнен анализ водной вытяжки донных отложений (ВВДО) на определение концентраций 69 химических элементов на приборе Перкин-Эльмер ICP-MS DRC-e в режиме Total Quant. Нормативов по содержанию химических загрязнителей в ВВДО не имеется, поэтому в работе мы руководствовались перечнем ПДК для воды рыбохозяйственных водоемов, ПДК для воды водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования, а также Директивой Совета Европейского Союза и рекомендациями Всемирной организации здравоохранения при ООН (СаНПиН 2.1.4.1074-01; Г.Н. 2.1.5.2280-07; Guidelines for drinking-water quality, 1983).
Оценка генотоксической активности донных отложений проведена с использованием трех токсикогенетических методов: метода учета видимых (генных) мутаций (ВМ) у хлореллы Chlorella vulgaris, ана-телофазного метода учета хромосомных аберраций (ХА) в меристематической ткани проростков корешков лука Allium cepa, метода учета доминантных летальных мутаций (ДЛМ) у дрозофилы Drosophila melanogaster (генные, геномные и хромосомные). Такое сочетание методов позволяет выявить широкий спектр генетических нарушений и снизить вероятность ложноотрицательного результата (Ковалёва М.И., 2005; Прохорова И.М., 2008).
В работе использован альгологически и бактериально чистый штамм ЛАРГ-1 одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris. Для культивирования хлореллы использовалась среда Праата (Владимирова М.Г., 1962; Генетическая токсикология: лабораторный практикум, 2005). Учет видимых мутаций проводился под бинокуляром МБС-3 при увеличении 8*16. Регистрировались все выросшие колонии. Колонии, измененные по форме, цвету, или размерам пересевались для подтверждения наследуемости признаков. Колонии, сохранившие измененный фенотип, учитывались как мутантные.
В качестве второго тест-обьекта использовался лук Allium cepa сорта Штутгартен Ризен. Для изучения генотоксичности донных отложений лук проращивался на вытяжке ДО 3 дня. Затем кончики корешков длиной около 7 мм отделялись и фиксировались в фиксаторе Карнуа. Корешки окрашивались ацеторсеиновым красителем. Готовились временные давленые препараты корневых меристем. Препараты анализировались под микроскопом при увеличениях 12,51,540 и 12,51,590. Для каждого препарата просматривалось 600 клеток, расположенных монослойно. Учитывались клетки, находящиеся на разных фазах митоза. Отдельно регистрировались клетки на стадии анафазы и телофазы с хромосомными аберрациями (ХА) и отставаниями хромосом (Прохорова И.М. и др., 2005).
В качестве третьего объекта использовалась линия дрозофилы дикого типа D-32, полученная на кафедре генетики МГУ им. Ломоносова. Трехдневных самцов, предварительно посаженных на трехчасовое голодание, 72 часа поили ВВДО. Далее самцы скрещивались с интактными виргинными самками в чашках Петри. В чашках мухи находились трое суток. Через сутки уничтожали самцов, через двое суток – самок. Чашки Петри с отложенными яйцами ставились в термостат на пять суток для выхода личинки из яйца. Затем проводился подсчет яиц под микроскопом МБС-2, считали количество развившихся из яйца личинок и количество неразвившихся яиц. Погибшие яйца считали как количество леталей.
Для сравнения результатов, полученных в разных тестах, использовался такой показатель как «выраженность мутагенной активности» (ВМА) (табл 1) (Ковалёва М.И., 2005; Прохорова И.М., 2008).
Таблица 1
Оценка выраженности мутагенной активности
Статистическая обработка результатов и корреляционный анализ осуществлялись при помощи компьютерных программ EXCEL2000 (Microsoft, USA) и “Statistic for Windows”. Для проверки гипотезы о достоверности различий между средними арифметическими контрольного и опытного вариантов использовался t-критерий Стьюдента. Отклонение считалось достоверным при достижении 5% уровня значимости (при p<0,05). Для выявления прямой (сильной, средней, умеренной и слабой) корреляционной связи использовали коэффициент корреляции Пирсона.
К вопросу о состоянии химического загрязнения водных экосистем
Сам факт, что химические соединения — загрязнители окружающей среды, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека, был осознан вначале научным, а вслед за этим и всем обществом [19]. В результате возникло новое направление в генетике - генетическая токсикология.
В 20-ые годы XX века А.С. Серебровский (1929) высказывал опасения, что возникающие и накапливающиеся в генофонде человека мутации могут быть причиной различных патологий и, в конечном счете, привести к вырождению человека как биологического вида. Проблема генетической опасности приобрела особую актуальность после открытия Г. Меллером способности ионизирующего излучения индуцировать мутации. Дальнейшее развитие его идей привело к определению понятия генетического груза, но задача его количественной оценки у человека оказалась очень сложной, и не решена сегодня [150].
Возможность воздействовать на наследственность экспериментально, показанная на примере ионизирующей радиации, стимулировала поиск такой способности у химических соединений, что привело к открытию химического мутагенеза И.А. Рапопортом на примере этиленамина, этиленоксида, эпихлоргидрина и других алкалирующих агентов и Ш. Ауэрбахом в случае иприта и его аналогов [49, 151].
В 60-х годах XX века было показано наличие мутагенной активности у ряда широко распространенных в окружающей среде химических соединений [1]. В результате, в США в 1969 г., а затем в Европе были созданы общества мутагенов окружающей среды, что считают моментом рождения генетической токсикологии как науки [52]. К середине 70-х годов XX века были получены многочисленные результаты изучения генотоксичности большого числа химических соединений, использующихся в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и в быту. В 1977 году была создана Международная комиссия по защите от мутагенов и канцерогенов окружающей среды (ICPEMC — International Commission for the Protection against Environmental Mutagens and Carcinogens). Одной из главных задач ICPEMC была разработка рекомендаций, которые могли бы быть использованы для национальных законодательных и регулирующих проектов, направленных на минимизацию генетических последствий от мутагенов окружающей среды.
В нашей стране исследования по генетической токсикологии развивались в рамках Секции генетических аспектов проблемы «Человек и биосфера» Государственного Комитета по Науке и Технике, руководимой академиком Н.П. Дубининым и в 1992 г. было создано Мутагенное общество, объединяющее специалистов в этой области науки.
Важность изучения проблемы химических мутагенов окружающей среды хорошо выражена словами профессора Дж. Кроу (США): «Есть все основания для беспокойства в связи с тем, что некоторые химические вещества могут быть насколько же опасными, как и радиация, и даже еще более. Учитывать только радиационную опасность значило бы игнорировать подводную часть айсберга» [32, 49].
В 1986 Н.П. Дубинин приводит 9 основных классов химических мутагенов: 1) алкилирующие соединения; 2) перекиси; 3) альдегиды; 4) гидроксиламины; 5) азотная кислота; 6) антиметаболиты, в том числе аналоги азотистых оснований; 7) соли тяжелых металлов; 8) акридиновые красители; 9) ряд химических веществ, разных по химическому составу — уретан, свободные радикалы, некоторые лекарственные вещества, ядохимикаты и др. [3, 5].
Начиная с 1973 г. и вплоть до сегодняшнего дня в генетической токсикологии существуют два субнаправления. Первое включает отбор химических соединений, не обладающих способностью индуцировать передающие из поколения в поколение мутации, лежащие в основе различных наследственных патологий у человека, т.е. немутагенов. Второе направление связано с использованием тестов, регистрирующих генотоксичность химических соединений для выявления канцерогенов. Таким образом, в отношении мутагенов осуществляется негативный отбор (в случае канцерогенов - отбор позитивный) [121].
Химические загрязнители опасны в чрезвычайно низких концентрациях и не выявляются при обычном химическом анализе воды. В этом случае только тест на мутагенность позволяет определить степень генетической безопасности внешней среды [50,166]. Природа и общество представляют единую динамическую систему, и, стало быть, изменяя окружающую среду, человек создает предпосылки к изменению характера генетических процессов в собственных популяциях [33]. На генотип влияют различные химические вещества (тяжелые металлы, красители, разнообразные мономеры, пищевые добавки, лекарства), а также физические факторы (радиация, ионизирующее излучение), в конечном итоге приводящие и к изменению структуры популяции [156].
Согласно «Глобальному экологическому прогнозу», тенденции носят в основном неблагоприятный характер. Проблема предотвращения экологической катастрофы - глобальна и по своей грандиозности превосходит все остальные [105].
Число зарегистрированных в международном регистре химических соединений составляет более 19 миллионов и увеличивается каждый день примерно на тысячу соединений [1]. Количество «новых» загрязнителей среды составляет величину порядка 3500 в год, то есть примерно 10 соединений в день. Всё сказанное свидетельствует о необходимости создания достаточно оперативной и экономичной системы тестирования химических соединений в отношении их потенциальной генетической опасности для человека. Невозможность экспериментального исследования генетической активности химических соединений у человека обусловила создание и использование для этих целей различных тест — систем. Количественная экстраполяция полученных данных на человека невозможна. Но они четко показывают мутагенность среды, окружающей людей [82].
На первом этапе проведения токсикогенетических работ главной задачей была разработка методов оценки мутагенного эффекта различных факторов и выявление среди них наиболее чувствительных и экономичных.
Огромный объем необходимых работ требует использования краткосрочных и дешевых (экономичных) тестов. Так как химические соединения и физические факторы способны вызывать различные генетические повреждения (геномные, хромосомные, генные), то необходимы тесты, позволяющие регистрировать все типы мутаций [52].
Использование различных тест-систем для оценки генотоксического состояния морских и пресноводных экосистем
Мониторинг генотоксического загрязнения природных сред является важным звеном экологических исследований. В первую очередь, необходим контроль за содержанием генетически активных поллютантов в компонентах водных экосистем, т.к. качество воды напрямую влияет на здоровье населения [4,10,23,39,45], накопление загрязнителей в ДО в дальнейшем приведет с повторному загрязнению водной среды. Обозначенная проблема является актуальной для многих стран, поэтому в рамках проведенных экологических исследований показана напряженная ситуация на ряде рек и морей мира. Большой объём работ выполнен по исследованию токсичности воды и ДО в отношении различных тест-объектов.
Отдельно следует отметить работы по исследованию генотоксичности питьевой воды. Грунтовая вода, употребляемая населением, была изучена в 42 из 50 штатов США, в целом было найдено 146 органических и 30 неорганических соединений. Мутагенность воды определялась поливалентной смесью мутагенов [51]. Работами Sora S. было доказано, что в Северной Италии используемая питьевая вода обладает генотоксичностью [232]. Л.Г. Дубинина и Н.П. Дубинин с помощью растительного тест-объекта скерды зелёной {Crepis capillaries) показали, что в 4 из 16 районов г. Москва питьевая воды содержит генетически активные соединения, а загрязнение питьевой воды часто приводит к раковым заболеваниям [51, 192].
Наличие генетически активных поллютантов было выявлено в ДО Северного моря [209, 210]. Полная оценка токсико-генетического состояния прибрежных вод Дагестана была дана с помощью теста Эймса сальмонелла/микросомы, в качества объектов исследования использовались вода, ДО, водоросли, гидробионты. Постепенное увеличение мутагенной активности в ряду «вода - водоросли - донные отложения - донные животные с подвижным образом жизни — малоподвижные и неподвижные животные» указывало на накопление мутагенов и промутагенов в детритных пищевых цепях прибрежных морских экосистем [152].
Так как в рамках диссертационного исследования изучались лишь пресноводные водотоки и водоёмы, следует более подробно изучить историю оценки генотоксичности пресноводных экосистем. С помощью теста Эймса была доказано наличие мутагенной активности проб воды и ДО, отобранных в устье реки Ла-Плата (Аргентина) [180]. В.P. Bohentin в 2008 г. с помощью химических и токсикологических методов показаны загрязнение металлами и генотоксикантами водораздела реки Чикаго [183]. Наличие генотоксикантов в реке Кишон (Израиль) было отмечено в 2002 г. N. Avishai [et al]. С помощью микроядерного теста рядом исследователей зарегистрированы генотоксиканты в озере Тэйху (Китай) [211], присутствуют генотоксиканты и в других водных экосистемах Китая, таких как крупное водохранилище Гуаньтин и река Юндин [216]. В дельте реки Гёксу (Турция) генотоксический потенциал был оценен с помощью исследования ядерных аномалий эритроцитов трёх видов рыб, обитающих в разных слоях водотока [220]. Рыбы - как индикаторы загрязнения были использованы и при изучении мутагенной активности донных отложений на протяжении реки По (Италия), работами L. Vigano [et al] доказано возможность использования рыб в качестве биомаркёров загрязнения [222].
О. Морару в 2006 г. была выполнена работа по оценке суммарного мутагенного фона природных вод Молдовы с применением гистидин зависимого штамма Salmonella typhimurium ТА98 и ТА 100, были исследованы реки, озёра и сточные воды г. Кишинёва. Максимальная мутагенная активность была характерна для р. Прут, для которой отмечено загрязнение, в основном химического типа, которое в свою очередь создало благоприятные условия для возникновения бактериологического загрязнения. В конечном итоге, экологическое состояние реки привело к появлению мутагенной активности воды [102].
Одним из бедственных районов России по уровню загрязнения окружающей среды является бассейн Нижней Волги. Наибольшей интерес в этом плане представляет Астраханская область, т.к. г. Астрахань расположен в устье Волги, куда приносит свои воды великая река, загрязнённая промышленными отходами многочисленных производств. В Астраханской области находится ряд крупных промышленных и сельскохозяйственных предприятий, результат деятельности которых сказывается на ухудшении экологической обстановки в близлежащих районах[82]. Большое негативное влияние оказывает Аксарайский газоперерабатывающий завод (АГПЗ), расположенный в 60 км от г. Астрахани. Для изучения мутагенной активности воды и илистых отложений использовалась растительная тест — система Crepis capillaries. Исследованиями З.И. Курашовой, З.И. Дубининой и И.В. Волковой в 1992 г. было показано, что илистые отложения с АГПЗ вызывают более сильный мутагенный эффект, чем вода, а пробы воды и илистых отложений, взятые из других пунктов Астраханской области, не показали достоверных отличий от контроля [82].
В 2004 г. И.Л. Ахиянц и Л.Г. Сентюровой была повторно исследована водная среда Волго-Каспия на наличие мутагенного загрязнения. В качестве критерия использовалось изменение частоты рецессивных сцепленных с полом (Х-хромосомой) летальных мутаций, возникающих при действии загрязнений среды на самцов дикого типа (D. Normal) методом «Мёллер - 5». Анализ полученных результатов мониторинга воды Волго-Каспийского бассейна показал, что уровень мутагенной активности достигает максимального значения в летний период, а наиболее напряженная эколого-генетическая ситуация наблюдается в непосредственной близости от АГПЗ [5]. Таким образом, токсикогенетическая ситуация за прошедший период времени не улучшилась.
Помимо Нижней Волги, наличие генотоксического загрязнения выявлено и для Верхней Волги, данной проблеме посвящено большое количество работ [71, 72, 81, 115]. Сотрудниками Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН И.Н. Крыловой и И.И. Томилиной была дана оценка токсических и мутагенных свойств природной воды и ДО водохранилищ Верхней Волги на территории Ярославской области [81].
Метод учета доминантных летальных мутаций у Dr. melanogaster
Продолжительность жизни взрослых мух зависит от многих факторов (температура, влажность, пища, плотность посадки) и равняется нескольким неделям, но, в специальных условиях, удается содержать взрослых мух в течение полугода. Для опытов используют виргинных самок. Важной особенностью мух является то, что вылупившаяся из куколки муха не способна спариваться в течение 8 — 10 часов [4, 123]. Определяющим физиологическим фактором при комплексном воздействии загрязнений водной среды на опытные и тестовые линии дрозофилы меланогастер является возраст имаго 3-5 дней, когда плодовитость и скорость откладки яиц позволяет в минимально допустимые сроки получить максимально многочисленное потомство. Кроме того, имаго именно этого возраста проявляют наиболее однородную физиологическую и генотипическую реакцию на индуцированное воздействие [5]. Клетки Drosophila melanogaster содержат 4 пары хромосом. Характерно исключительное богатство мутационных рас, большинство из которых характеризуется четким фенотипическим проявлением.
Важным преимуществом дрозофилы для генотоксических исследований является возможность исследований мутагенной активности соединений на половых клетках различных стадий. Это имеет большое значение, т.к. одной из характерных черт химических мутагенов является чувствительность к разным стадиям. Благодаря вышеперечисленным преимуществам дрозофила широко используется в качестве тест-системы для изучения мутагенов окружающей среды. Метод учета частоты ДЛМ — один из самых простых и экономичных методов выявления мутагенного эффекта, как индивидуальных загрязнителей, так и СМА природных тел.
Для постановки опыта использовалась линия дрозофилы дикого типа D-32, полученная на кафедре генетики МГУ им. Ломоносова. Линия D-32 отличается очень низкой спонтанной мутагенностью в отношении мутаций некоторых типов (ДЛМ, РСПЛМ, некоторых типов хромосомных мутаций), что делает ее очень удобной для опытов, имеющих целью выяснение различий эффектов индуцированного мутагенеза. В качестве корма для мух готовилась среда следующего состава: вода - 800 мл; крупа манная - 25 г; песок сахарный - 95 г; дрожжи - 75 г; агар — 9 г. В качестве консерванта была использована пропионовая кислота (2мл). Культура содержалась в термостате, при температуре 22С.
Постановка эксперимента осуществлялась по следующей методике. В стаканчик наливали 5мл водной вытяжки ДО (в опытных вариантах) или 5 мл 5%-ного раствора сахарозы на дистиллированной воде (в контрольном варианте). На дно стаканчика помещалась металлическая сеточка таким образом, чтобы вода касалась нижней ее поверхности. На сеточку помещали трехдневных самцов линии D-32 на 72 часа, предварительно посаженных на трехчасовое голодание. Далее самцы скрещивались с интактными виргинными самками. Скрещивание проводили в чашках Петри, дно которых предварительно заливали средой: вода — 700мл; агар-агар — 9г; сахарный песок - 25г. При помощи марли делали на поверхности среды «шероховатую поверхность». Особое внимание уделялось созданию оптимальных условий для кладки: аэрация сосуда и предупреждения стресс - эффекта от встряхивания мух. В чашках мухи находились трое суток. Через сутки уничтожали самцов, через двое суток — самок. Нами использовалась общепринятая методика учета ДЛМ у Drosophila melanogaster в модификации М.Ю.Хромых (1977).
После опыта, когда уничтожались мухи, чашки Петри с отложенными яйцами ставились в термостат на пять суток для выхода личинки из яйца. По истечении этого времени проводился подсчет яиц под микроскопом МБС-2. При постановке метода ДЛМ необходимо отметить ряд трудностей, которые возникают в процессе работы: 1. большая трудность в подготовке операций; 2.создание оптимальных условий для кладки; должна быть достаточная аэрация в сосуде, иначе воздух переувлажняется, и мухи прилипают к стенкам сосуда; необходимо предупреждать стресс-эффект от встряхивания мух, т.к. это ведет к снижению кладки яиц, начальные этапы эмбриогенеза при этом происходят «внутриутробно»; целесообразно делать верхний слой среды шероховатым При воздействии на мух мутагенами имеется определенная вероятность откладки неоплодотворенных яиц (физиологические повреждения сперматозоидов или снижение половой активности самцов). Мы вели подсчет на стадии яйца, т.е. считали количество развившихся из яйца личинок и количество неразвившихся яиц. Учет яиц виргинных самок, так как установлено (экспериментально), что виргинные самки откладывают яйца на 7-8 сутки после вылупления.
Оценка химического загрязнения донных отложений водоемов и водотоков Оренбургской области (2007 г.)
В Западном регионе превышение ПДКрх зарегистрировано на 81,8% станций, а среднерегиональная его концентрация была выше в 4,2 раза. Низкая концентрация А1 характеризовала водные экосистемы Центрального региона , хотя и она превышала ПДКрх в 3,2 раза (рис 58).. Между водными экосистемаиа регионов области достоверных различий по алюминию выявлено не было.
В ряду опасных загрязнителей биосферы особое место занимают радионуклиды - радиоактивные загрязнители биосферы. Антропогенные радионуклиды образуют две основные группы: искусственные, получаемые в результате ядерных реакций, и естественные, или природные радионуклиды (уран, торий и продукты их распада), концентрация резко возросла за счет экологических процессов, связанных с перемещением их из более глубоких зон земной коры. Основным источником естественных радионуклидов (ЕР) в биосфере также является добыча, переработка и использование фосфатных удобрений. Систематическое применение удобрений приводит к увеличению концентрации ЕР и в водоемах (воде, донных отложениях, водных организмах). Кроме того, ЕР поступают в окружающую среду при сжигании угля, а также применения угольной золы в производстве цемента и бетона в качестве наполнителя для дорожных покрытий и удобрения в сельском хозяйстве [157].
Обширные масштабы поступления ЕР в окружающую среду, а также то, что часть территории Оренбургской области находится в зоне Тоцкого ядерного взрыва (1954 г.) и обусловили актуальность проведенной работы по оценке содержания урана и тория в водных экосистемах. Оценка степени загрязненности территории и водной среды области ураном ранее была проведена В.М. Боевым, В.Ф. Куксановым и В.В. Быстрых [15], по их данным концентрация U в поверхностном стоке рек области колебалась в широких пределах от 0,04-10" мг/л до 44,7-10" мг/л. По результатам нашего исследования в ВВДО водотоков и водоёмов Оренбургской области минимальная концентрация урана была на порядок выше (0,397-10" мг/л - ст 8, р. Самара г. Бузулук, Западный регион,) а максимальный показатель был значительно ниже полученных ими данных (9,56-10" мг/л - ст 11, р. Молочай Александровский р-н, Центральный регион) и не превышал ПДК для воды хозяйственно-питьевого назначения. Сравнение содержания U в ВВДО с кларком для речных вод (0,4-10"3 мг/л) показало, что во всех регионах средняя концентрация U была выше кларка: в районе Оренбурга в 3,9 раза, в 11,6 раза в Восточном регионе (рис 59). Максимальное превышение в 23,75 раза наблюдалось в Центральном регионе на р. Молочай Александровский р-н. В рамках нашего исследования достоверные различия между регионами в содержании урана в ВВДО выявлены не были, но отмечена тенденция к увеличению содержания урана в ВВДО водоемов и водотоков Восточного региона, где его средняя концентрация была на уровне 4,64-10"3 мг/л, что выше содержания урана в воде данного региона 3,23-10"3 мг/л [15]. Полученные данные доказывают, что ДО водотоков и водоёмов аккумулируют в своем составе радиоактивные элементы, причем наряду с U, в Восточном регионе нами зафиксирована и максимальная средняя концентрация другого ЕР — тория, что свидетельствует об усилении радиационного эффекта воздействия на человека [15]. Таким образом, анализ суммарного содерэ/сания химических элементов, не обозначенных как ТМ при проведении экологических исследований, и радионуклидов в ВВДО водотоков и водоёмов показал, что максимальную нагрузку элементами данной группы испытывают водные экосистемы Восточного региона области. Наибольшую опасность для гидроэкосистем представляет А1, содержание которого повсеместно превышало ПДКрх. Наряду с А1, водотоки и водоёмы Оренбургской области, за исключением Урала и Сакмары в районе Оренбурга, характеризовались средним содержанием Ті выше ПДКрх. Особую опасность представляют радиоактивные элементы U и Th. В водотоках и водоёмах Оренбургской области были выявлены концентрации U близкие, либо значительно превышающие кларк для речных вод, что свидетельствует об их накоплении в ДО водных экосистем. Отобранные пробы ДО на водотоках и водоёмах Оренбургской области имели преимущественно песчаный характер, а известно, что илистые и глинистые ДО удерживают загрязнители более прочно, чем песчаные [120], поэтому присутствие относительно высокой доли песчаных фракций в ДО районов, несущих повышенную антропогенную нагрузку, может иметь негативные последствия для водной среды из-за пониженных сорбционных свойств песчаных осадков [ПО], что приводит к более лёгкому переходу поллютантов в водную среду. Эти литературные данные подтвердились в рамках нашего исследования, пробы ДО, отобранные в Восточном регионе области, имели песчаную природу, и химический анализ цельного грунта показал минимальные концентрации в содержании металлов, а проведенный анализ содержания неорганических загрязнителей в ВВДО выявил наиболее высокие концентрации водорастворимых форм химических элементов: максимальные ИН неметаллами, РЗМ, щелочными и щелочноземельными металлами, а также металлами, не обозначенными как ТМ при проведении экологических исследований. Из числа химических загрязнителей, для которых установлены нормативы, в водных экосистемах Восточного региона отмечены максимальные средние концентрации Al, U, Мо, Мп и Se, также содержание Hg превышало все установленные нормативы на всех исследованных водотоках и водоёмах указанного региона.
Для ВВДО Урала и Сакмары в районе Оренбурга были отмечены низкие средние индексы нагрузки неметаллами, щелочными и щелочноземельными металлами и ТМ, кроме того, были выявлены минимальные средние концентрации Ті, U, Fe, Mo, V, Си, Мп и Se. Тот факт, что в районе крупного промышленного города содержание ряда загрязняющих веществ было минимальным, можно объяснить тем, что пробы ДО имели минимальную способность к аккумуляции загрязнителей, что может быть обусловлено низким содержанием органического вещества.
Достоверные различия между регионами области были установлены лишь по содержанию в ВВДО Se между Центральным и Восточным регионами, и между Центральным регионом и Оренбургом. В Восточном регионе содержание селена в 1,3 раза выше, а в районе Оренбурга в 2,0 раза ниже, чем в Центральном регионе.
