Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Попкова София Марковна

Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири
<
Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Попкова София Марковна. Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири : Дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.16, 14.00.07 : Иркутск, 2004 301 c. РГБ ОД, 71:05-3/124

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ФОРМИРОВАНИИ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ ЧЕЛОВЕКА 20-37

1.1.1 .Экосистемные симбиотические взаимодействия 20-31

1.1.2. Адгезия микроорганизмов 31-37

1.1.3 . Роль симбионтных микроорганизмов в процессах иммуномодуляции макроорганизма 37-41

1.1.4. Реагирование макроорганизма на антигенные стимулы нормальной микрофлоры 41-57

1.2. НОСИТЕЛЬСТВО МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИСПОСОБИТЕЛЬНАЯ ФОРМА МИКРОБИОЦЕНОЗОВ ЧЕЛОВЕКА 57-59

1.3. ВЛИЯНИЕ ТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА ЗДОРОВЬЕ ЛЮДЕЙ 60-88

1.3.1. Иммунная система человека в условиях неблагополучной экосреды 60-65

1.3.2. Кишечные дисбактериозы и экологический прессинг 66-78

1.3.3. Современные методы коррекции дисбиотических нарушений кишечника 78-88

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 89-116

2.1. Объекты исследований. 89-91

2.2. Методы исследований 92-104

ГЛАВА 3. ЭКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗУЧАЕМЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ 105-112

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА КИШЕЧНЫХ ДИСБАКТЕРИОЗОВ У ДЕТЕЙ РАННЕГО И ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА, ПРОЖИВАЮЩИХ В ГОРОДАХ (ИРКУТСКЕ И АНГАРСКЕ) С РАЗНЫМ УРОВНЕМ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ НАПРЯЖЕННОСТИ 113-134

4.1. Особенности микробиоценоза кишечника у детей с диспепсическим синдромом и аллергическими проявлениями 113-123

4.2. Биохимическая внутрипопуляционная гетерогенность E.coli и формирование кишечных дисбиозов 123-129

4.3. Изучение антагонистических свойств аутоштаммов бифидобактерий, выделенных от детей с кишечными дисбактериозами 129-134

ГЛАВА 5. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА С ИНДИГЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ КИШЕЧНИКА 135-157

5.1. Изучение иммунологической реактивности разных групп населения по отношению к общим антигенам некоторых представителей индигенйой микрофлоры кишечника (бифидо- и лактобактериям) 135-142

5.2. Изучение (in vitro) влияния некоторых экзогенных и эндогенных факторов на адгезию индигенных микроорганизмов кишечника 142-157

5.2.1. Оценка эффектов воздействия антител против общих антигенов бифдобактерий на цитоадгезию 143-147

5.2.2. Регуляция адгезии микроорганизмов кишечного микробиоценоза растительными препаратами 147-157

ГЛАВА 6. ИММУНИТЕТ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЬСТВА C.diphtheriae 158-197

6.1. Носительство токсигенных и нетоксигенных C.diphtheriae 158-167

6.2.Показатели гуморального и клеточного иммунитета у носителей токсигенных C.diphtheriae 168-174

6.3. Антибактериальные антитела к C.diphtheriae и их роль в иммуногомеостазе человека 174-183

6.4. Пути коррекции антибактериального противодифтерийного иммунитета 183-199

ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНЫХ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ИММУНОДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К СИМБИОНТНОЙ МИКРОФЛОРЕ ЧЕЛОВЕКА

В РПГА.. 200-219

7.1. Эритроцитарный иммунодиагностикум по определению в сыворотке крови антител к C.diphtheriae 201-213

7.2. Получение лабораторного иммунодиагностикума для определения антител к индигенной микрофлоре кишечника - бифидо- и лактобактериям 214-219

ГЛАВА 8. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 220-251

ВЫВОДЫ 252-254

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

255

256-301

Список основных сокращений

ВГВ - вирус гепатита В

ЗЗР - зона задержки роста микроорганизмов

ИАМ - индекс адгезии микроорганизмов

ИЗА — индекс загрязнения атмосферы

ИИН - индекс иммунологических нарушений

КУЭ — коэффициент участия эритроцитов (в адгезии)

НКС - нормальная кроличья сыворотка

НКП - нормальная кишечная палочка

НТКД = (Cd tox-) нетоксигенные коринебактерии дифтерии

ОКИ — острые кишечные инфекции

CD3+ - общее содержание т-лимфоцитов

CD4+— Т-хелперы

CD8+- Т-супрессоры

NK-1 - естественные Т-киллеры

РПГА - реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации

СПА — средний показатель адгезии

ТКД = (Cd tox+) - токсигенные коринебактерии дифтерии

УПМ - условно-патогенная микрофлора

ЭПК - энтеропатогенная кишечная палочка

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Демоэкологическая политика, содействующая охране и улучшению
здоровья населения, невозможна без понимания закономерностей

функционирования нормальных биоценозов человека и животных.

Микробная колонизация представляет собой одно из явлений природы, которое изучается как биологией, так и медициной. С позиции экологии данное явление можно рассматривать как процесс расселения микроорганизмов на различных объектах, в том числе, на коже, слизистых оболочках, на раневой поверхности, что сопровождается их размножением до определенного предела. Колонизация приводит к формированию комплексных сообществ различных популяций микроорганизмов в определенных биотопах - как в окружающей среде, так и в организме животных и человека. В результате указанных событий формируются экосистемы, обнаруживается определенная иерархия среди микробных популяций [Бочков И.А., Овчарова Н.М., 1991; Бондаренко В.М., 1998; Воробьев А.А.и соавт., 2001; Шендеров Б.А., 1998].

Биоценозы состоят из совокупности популяций автохтонных, аллохтонных и заносных из внешней среды видов, между которыми существуют определенные количественные и качественные соотношения. В результате внешних и внутренних воздействий состав популяций постоянно меняется. При длительном влиянии дестабилизирующих факторов или кратковременном воздействии агента большой повреждающей силы, происходит нарушение механизмов стабилизации, и, как следствие этого, новый состав микрофлоры формирует дисбактериоз [Долгушина И.И. и соавт., 1998; Крамарь Л.В., 2001].

Социальное значение микроэкологических исследований значительно возрастает в эпоху научно-технических преобразований, характеризующихся усилением взаимодействия общества и природы. Нормальная микрофлора находится в прямой зависимости от факторов окружающей среды, является

первичной мишенью приложения любого попадающего в организм соединения и первой вовлекается в трансформацию естественных и чужеродных субстанций, в том числе ксенобиотиков и экотоксикантов. Это способствует росту дисбиозов биотопов человека, приводит к изменению физиологических, биохимических и иммунологических показателей, накоплению и селекции атипичных штаммов, формированию в организме новых микробных сообществ (патоценозов) и, в конечном итоге, способствует возникновению патологических состояний [Шендеров Б.А., Манвелова М.А., 1997].

Возрастающее экологическое неблагополучие окружающей среды уже
привело к тому, что некоторые эволюционно сложившиеся биоценозы почвы и
водоемов безвозвратно утеряны. Нарушение же естественных

микробиоценозов человека может привести к непредсказуемым последствиям для его здоровья и жизни. В условиях длительного воздействия негативных факторов на биологическую систему «макроорганизм - нормальная микрофлора» отношения между членами этой системы изменяются. К особым экологическим факторам следует отнести широко применяемые в практике здравоохранения антибиотики и другие противомикробные препараты. Своеобразная особенность этого экологического феномена для микроорганизмов заключается в том, что этот процесс трудно было приостановить [Бароян О.В., 1972]. Кроме того, в результате широкого применения вакцинных, фаговых препаратов в какой-то степени изменена иммунологическая структура населения, и циркуляция некоторых микроорганизмов происходит в необычных для них условиях. Поэтому правомерно будет говорить о существовании и такого экологического фактора, как обитание микроорганизма в необычных для него условиях [Покровский В.И. и соавт., 1994].

Широко распространенным состоянием ' при дисбактериозах является длительное носительство условно- патогенных и патогенных микроорганизмов, которые, как правило, в условиях массовой

вакцинопрофилактики, относятся к транзиторным видам. Примером такого длительного носительства служит бактериальное носительство токсигенных коринебактерий дифтерии. Логическим продолжением экологического прессинга на нормобиоценоз ротоглотки часто является довольно устойчивое состояние, которое иногда называют «здоровое носительство».

С биологической точки зрения бактерионосительство — эволюцонно-прогрессивная форма симбиоза, определяющая развитие и взаимоадаптацию живых систем [Бухарин О.В., 1996; Маргелис Л., 1996]. В экологическом аспекте - это расширение диапазона расселения патогена со сменой фаз паразитизма и сапрофитизма [Одум К., 1986; Сомов Г.П., 1988]. С медицинской точки зрения, бактерионосительство — осуществление цикла развития популяции паразита в популяции хозяина — переход от фазы резервации патогена к фазе эпидемического распространения возбудителя и наоборот [Беляков В.Д., 1988; Бухарин О.В., 1996]. Варианты тактического разнообразия в системе «макроорганизм - хозяин» являются отражением высоких адаптационных возможностей участников этой биологической системы, изучение которой остается одним из актуальнейших направлений современной медицины и биологии.

Бактерионосительство токсигенных коринебактерий дифтерии (ТКД) — биологический процесс, особенно тесно связанный с иммунной системой человека. Носители ТКД - дети и взрослые — являются одни из источников, поддерживающих эпидемический процесс дифтерии. В период последней эпидемии дифтерии показатели выявленных носителей резко увеличились, что повлекло за собой и увеличение плотности циркуляции ТКД. В настоящее время считают, что причинами длительного носительства являются особенности как микро-, так и макроорганизма. Так, известно о неоднородной адгезивности штаммов КД. Она более высокая у больных манифестируюшими формами дифтерии, чем у бактерионосителей [Костюкова Н.Н., 1991], а также повышена у лиц с длительным носительством. В свою очередь, состояние

макроорганизма, характеризующееся наличием очагов хронической инфекции,
снижением общей резистентности, дефектностью антимикробного

противодифтерийного иммунитета при нормальном или высоком уровне антитоксического иммунитета, изменением биоценоза слизистых и патологией ЛОР органов приводит к длительному носительству или заболеванию. Поэтому изучение механизмов, лежащих в основе сосуществования макроорганизма и симбионтных C.diphtheriae tox-, по-прежнему остается актуальной задачей в понимании проблемы длительного носительства C.diphtheriae tox+, а значит, и дифтерийной инфекции.

Следует подчеркнуть важное обстоятельство - отношения
макроорганизма с микроорганизмами, заселяющими свои экологические ниши,
складываются по-разному. Так, отношения с бифидофлорой, доминанты
кишечного микробиоценоза (около 90% всех бактерий кишечника), подобны
отношениям целого со своей частью - макроорганизмом. Не случайно, в
научной литературе имеет место приравнивания сложнейшей экологической
системы «нормобиоценоз кишечника» к «своеобразному

экстракорпоральному органу человека» [Дорофеев А.Э. с соавт., 1997; Крылов В.П. с соавт.,1998]. В кишечнике человека обитает около 100 триллионов бактерий. Живые бактерии составляют 30% фекальных масс. У здорового человека имеется стабильное равновесие в доминировании полезных микроорганизмов. Нормофлора взрослого человека составляет 2,5 - 3 кг. Т.е., по сути дела, это вполне полноценный орган человеческого организма, и эта система находится в состоянии динамического равновесия [Дорофеев А.Э. с соавт., 1997].

Иммунологические взаимоотношения в системе «макроорганизм -микрофлора» нередко выходят за границы нормы. Это проявляется наличием измененной реактивности к представителям нормальной микрофлоры хозяина, как условно- патогенной, так и непатогенной. В регуляции микробиоценоза

важную роль играют иммунные реакции, в т.ч. содержание IgA в слизистых секретах кишечника [Пинегин Б.В. с соавт., 1984; Лыкова Е.А.с соавт., 1996].

В последние годы интерес к симбиотной микрофлоре кишечника человека необыкновенно возрос. Дисбиоз кишечника со всеми заболеваниями, сопровождающими его, с его последствиями, связанными с нарушением функции интестинальной иммунной системы, привлекает пристальное внимание врачей во всем мире. Распространенность дисбиозов необычно велика. F.Perger (1985) на основе 2005 копрологических исследований смог установить наличие эубиоза лишь приблизительно в 2% случаев. Но, несмотря на многочисленность исследований по изучению кишечных дисбактериозов взрослых и особенно детей, обилие практических рекомендаций по коррекции кишечного микробного гомеостаза, профилактике и т.п., проблема остается актуальной поскольку даже тенденции к их сокращению не наблюдается.

Актуальность данной проблемы определяется и тем, что

климатогеографические и эколого-гигиенические условия обитания человека, возраст, характер питания и др. вызывают изменения в иммунореактивности организма, что отражается на его микробиоценозе, придавая особенности нормальной микрофлоре кишечника. В свою очередь, состав и биологические свойства нормальной микрофлоры определяют состояние здоровья человека, что доказывается ее изменениями при различных заболеваниях [Миронов А.Ю. 2001; и др.]. При этом нарушения в составе кишечной микрофлоры наступают задолго до клинических симптомов и поэтому могут быть предвестниками определенного патологического процесса [Воробьев А.А. и соавт., 1995; и др.]. В связи с этим возникает необходимость в разработке критериев оценки микрофлоры кишечника и определение нормы для населения различных территорий.

Не менее важной проблемой является ухудшение экологической обстановки, связанное с урбанизацией. В условиях экологического неблагополучия иммунодефицитные состояния наблюдаются практически у

всего населения, проживающего в данных регионах. При этом выраженность иммуносупрессивного эффекта зависит от продолжительности и интенсивности воздействия экологически вредных факторов на организм человека [Хаитов P.M. и соавт., 1995; Скачков М.В., 2001; и др.]. Изменения в иммунной системе проявляются в формировании первичных и вторичных иммунодефицитов, аллергии, аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также дисбактериозов, которые проявляются, прежде всего, в угнетении бифидо- и лактофлоры, обладающих иммуностимулирующей активностью и увеличением количества условнопатогенных бактерий, особенности биологических свойств которых определяются регионом их распространенности [Бондаренко В.М., 2002; и др.]

В процессе постоянного взаимодействия макро- и микроорганизмов формируется уникальная система, находящаяся в состоянии динамического равновесия. При этом постоянство микрофлоры, микробиологический фенотип, присущий каждому человеку, является показателем иммунологической реактивности организма и одним из факторов естественного иммунитета [Гребнев А.Л., Мягкова А.Н., 1994; Пинегин Б.В. с соавт., 1984; Лыкова Е.А. с соавт, 1996]. В месте с тем, роль центральной иммунорегуляции остается недостаточно изученной. Таких исследований, показавших, что степень дисбактериоза совпадает с глубиной недостаточности клеточного звена иммунитета, немного [Вершинина В.И., 1982; Гариб Ф.Ю. с соавт., 1991]. Между тем, разгадку многих механизмов, лежащих в основе формирования дисбактериозов, может дать всестороннее изучение всех сочленов данных сообществ, которые как объект экологии, представляет собой сложные многофакторные явления. Человек является не только средой обитания для микроорганизмов, но и непосредственным сочленом формирующихся биоценозов. Поэтому так важно иметь полное представление о поведении всех сочленов этого сообщества.

Так, практика показала, что коррекция препаратами пробиотиков, содержащих бифидо- и лактобактерии, часто не приводит к устойчивому улучшению состояния и дальнейшей нормализации микробиоценоза кишечника. И через 1-2 месяца после прекращения биокоррекции состояние дисбиоза кишечника возвращается. Считается, что эта коррекция не сопровождается заселением слизистых поверхностей кишечника штаммами лечебных препаратов. Они только, восполняя недостаточную антагонистическую и другие функции аутоштаммов, дают возможность размножиться и заселиться своей, аутохтонной микрофлоре. В тех случаях, когда не происходит восстановления нормобиоценоза кишечника с помощью препаратов-пробиотиков, создается впечатление, что организм как бы постоянно «отторгает» от себя нужную микрофлору.

Таким образом, поскольку механизмы процесса нарушения микробиоценоза изучены недостаточно, представляется важным дальнейшее изучение особенностей становления нормальной микрофлоры кишечника, специфик иммунной реактивности макроорганизма по отношению к его основному компоненту — бифидофлоре.

Учитывая малую вероятность полного оздоровления окружающей среды в ближайшее время, формирование и поддержание оптимальных микробиоценозов и их коррекция при дисбиозах являются важными задачами как в отношении сохранения здоровья отдельных людей, так и человеческой популяции в целом. Это делает необходимым дальнейшее расширение и углубление исследований в области микробной экологии, направленных на выяснение закономерностей саморегуляции биоценозов, определения их роли в поддержании гомеостаза и в возникновении многих заболеваний [Векслер И.Г., 1985; Костюкова Н.Н., 1999; Крамарь Л.В., 2001; Finegold S.M., et al, 1983; Gialdroni-Grassai G., 1985; Van der Waaii D., 1996; Hamilton-Miller J.M.T.,1997].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Раскрыть закономерности и механизмы нарушений гомеостаза естественных микробиоценозов человека в условиях техногенного загрязнения на примере взаимоотношений макроорганизма с C.diphtheriae (ротоглоточный микробиоценоз) и бифидобактериями (кишечный микробиоценоз); на основании полученных данных обосновать принципы коррекции и профилактики дисбактериозов.

Задачи исследования:

— определить частоту встречаемости и характер изменений микрофлоры
кишечника у детей дошкольного возраста с клиническими проявлениями
кишечного дисбактериоза, проживающих в разных промышленных городах
Восточной Сибири;

оценить изменения иммунного статуса у лиц с длительным носительством токсигенных коринебактерий дифтерии;

исследовать содержание естественных антител к индигенной микрофлоре кишечника (бифидо- и лактобактериям) и коринебактериям дифтерии в сыворотках крови людей, проживающих в городах Восточной Сибири с разным уровнем техногенной нагрузки;—

— разработать иммунодиагностикумы на основе антигенов бифидо-,
лактобактерий и нетоксигенных коринебактерий дифтерии для определения
антимикробных антител в РПГА.

получить кроличью иммунную сыворотку с антителами к поверхностным антигенам бифидо- и лактобактерий;

выявить общие закономерности иммунореагирования макроорганизма на антигены различных микробов - симбионтов человека;

изучить (in vitro) влияние иммунных кроличьих и естественных антител человека к антигенам бифидобактерий на адгезивную активность этих микроорганизмов;

— провести сравнительную оценку (in vitro) влияния некоторых растительных
препаратов на адгезивность индигенной микрофлоры кишечника;

разработать схему иммунокоррекции (санации) лиц с длительным носительством на слизистых верхних дыхательных путей токсигенных коринебактерий дифтерии;

на основе полученных микробиологических, иммунологических и популяционных исследований патогенетически обосновать наиболее оптимальные пути профилактики кишечных дисбактериозов.

Научная новизна:

Впервые дана характеристика микроэкологических нарушений в кишечнике детей с клиническими проявлениями кишечного дисбактериоза, проживающих в промышленных городах Восточной Сибири.

Впервые установлена взаимосвязь между типом взаимоотношений макроорганизма с некоторыми микробами-симбионтами и выраженностью иммунного ответа организма на антигены этих микробов.

Впервые показано, что естественные антитела против антигенов бифидобактерий препятствуют их адгезивному процессу.

Впервые определены фоновые показатели содержания в сыворотке крови людей нормальных антител к C.diphtheriae, позволяющие оценить состояние организма с учетом региональной специфики.

Предложена научная концепция формирования устойчивых кишечных
дисбактериозов у населения, как следствие срыва иммунологической
толерантности по отношению к микробам-симбионтам, что позволяет
патогенетически обосновать меры по повышению эффективности

иммунопрофилактики кишечных дисбиозов.

Приоритетными являются результаты исследований, обосновывающие комплексное применение биомодулятора «Вакцины Кодивак» (п/к и интраназально) для санации дифтерийного носительства.

Впервые при изготовлении антигенного эритроцитарного диагностикума для определения антибактериальных антител в качестве конъюгирующих компонентов применены синтетические карбоксил и азолсодержащие полимеры, позволяющие повысить чувствительность препаратов в 2-8 раз.

Практическая значимость работы:

Исследования проводились в рамках НИР института «Изучение экспериментально-производственных серий дифтерийной бактериальной вакцины и оптимизация технологического процесса ее серийного производства» (Гос.Рег. №01. 86. 00053573. 1992 ) , «Изучение популяционной структуры населения в регионах Восточной Сибири с различными экологическими условиями» (Гос.Рег. № 009004. 02.09.94), «Изучение устойчивости эпидемического процесса как биологической системы в условиях антропогенного загрязнения окружающей среды» (Гос.Рег. № 01.9.60 0022249).

Результаты натурных и экспериментальных исследований легли в основу полученных патентов:

Способ приготовления эритроцитарного иммунодиагностикума и способ оценки иммунорезистентности организма.- Патент РФ № 2142807 от 20.12.99.

Способ получения антител к коринебактериям дифтерии. - Патент на изобретение № 2129014 от 20 апр.1999 г.

Способ приготовления эритроцитарного антигенного диагностикума с применением бактериальных антигенов бифидо- и лактобактерий и полимерных кислот.- Решение о выдаче Патента РФ от 04.02.2002 на заявку № 9806367.

Разработаны, опубликованы и внедрены следующие методические рекомендации для врачей, научных работников, преподавателей:

- Вакцина Кодивак. Новые подходы в лечении носителей токсигенных
коринебактерий дифтерии.-Иркутск, 1995.-8 стр.

Оценка противодифтерийного иммунитета у носителей токсигенных коринебактерий дифтерии.- Иркутск. 2001.М.П.3.1.003-01.-6 стр.

Особенности формирования кишечного микробиоценоза у детей в современных условиях.- 2001г. Иркутск. 2001.М.П.3.1.004-01.-16 стр.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

  1. У детей с клиническими проявлениями кишечного дисбактериоза, проживающих в промышленных городах Восточной Сибири, установлены количественные и качественные изменения микроэкологии кишечника, характеризующиеся дефицитом основных представителей индигенной микрофлоры, диссоциацией нормальной кишечной палочки, высоким удельным весом аутоштаммов бифидобактерий с низкой антагонистической активностью.

  2. Выявлена взаимосвязь между носительством токсигенных коринебактерий дифтерии и изменениями в иммунном статусе (как в клеточном, так и гуморальном звеньях иммунитета). При этом уровень естественных антибактериальных антител к C.diphtheriae в сыворотках крови людей является одним из критериально значимых показателей иммунорезистентности организма.

  3. Низкий уровень (либо отсутствие) в сыворотках крови антител к антигенам фоновых микроорганизмов индигенной микрофлоры кишечника (бифидо- и лактобактерий) является общей закономерностью и свидетельствует об иммунологической толерантности к этим микробам-симбионтам. Естественные антитела к антигенам бифидобактерий ингибируют адгезивный процесс этих микроорганизмов.

  4. Научно обоснованным и эффективным принципом коррекции и профилактики нарушений микробиоценозов человека является применение биопрепаратов, корригирующих дисбиотические

расстройства у населения: биомодулятора «Вакцины Кодивак» для коррекции антибактериального иммунитета к дифтерии, препаратов-пробиотиков для предотвращения «срыва» иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре кишечника.

Апробация работы

Результаты исследований по теме диссертации доложены на: Всесоюзной конференции «Методология, организация и итоги массовых иммунологических обследований» (Ангарск, 1987); научно-практической конференции «Фундаментальные науки медицине и здравоохранению» (Иркутск, 1989); XXYII Всесоюзном Обществе эпидемиологов и паразитологов им.И.И.Мечникова (Алма-Ата, 1989); Всесоюзной конференции «Методологические .и методические проблемы оценки состояния здоровья населения » ( С.-Петербург, 1992); I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992); III объединенной научной сессии НИИ и вузов г.Иркутска медико-биологического профиля «Последствия и прогноз взаимодействия человека с окружающей средой» (Иркутск, 1992); Всероссийской научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, предусмотренных профилактическими прививками» (Пермь,1993); V Объединенной научной сессии НИИ и ВУЗов медико-биологического профиля (ИркутскД993); научной международной конференции «Экология и общественное здоровье» (Новокузнецк, 1994); Выездной сессии общего собрания СО РАМН «Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере» (Владивосток, 1996); Российско-Японском международном медицинском симпозиуме (3-8 сентября 1996 г., г. Иркутск); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы и методические аспекты оценки и прогнозирования здоровья населения» (г.

Ангарск, 1997); Международном симпозиуме «Питание XXI века: медико-
биологические аспекты, пути оптимизации» (Владивосток, 1999); научной
конференции «Техногенное загрязнение и инфекционная патология» (Иркутск,
2001); Научной конференции с международным участием, посвященной 90-
летию ИЭМ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН «Инфекции человека в начале XXI века:
эволюция, новые проблемы, перспективы контроля» (Иркутск, 2002); научно-
практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения
профессора Е.В.Талалаева «Оценка ; современного состояния

микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» (Иркутск, 2002); Южно-Сибирской международной научной конференции «Экология Южной Сибири» (Абакан, 2001); международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы -современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); VIII Съезде Всероссийского Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов ( Москва, 2002); на научной конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2003); международной конференции «Пробиотйки, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004 г.).

Работа обсуждена на заседаниях Ученого совета и совещаниях сотрудников Института эпидемиологии и микробиологии НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН, на заседаниях Ученого совета Президиума Научного Центра медицинской экологии ВСНЦ СО РАМН, областного Центра ГСЭН.

Результаты исследований использованы и внедрены:

- В практическую и научно-исследовательскую работу специалистов здравоохранения: врачей-инфекционистов, эпидемиологов, иммунологов, микробиологов, педиатров лечебно-профилактических учреждений и службы санитарно-эпидемиологического надзора г. Иркутска и Иркутской области.

Полученные новые данные используются в учебном процессе кафедры эпидемиологии и инфекционных болезней и кафедры детских инфекционных болезней Иркутского ГИУВа. Акты внедрения приложены к диссертации.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 52 научные работы, в том числе 20 журнальных статей и 7 статей в научных сборниках, материалы исследований защищены 3 патентами РФ, разработаны и внедрены в практику здравоохранения 3 методических письма. Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов. Работа изложена на 301 странице, иллюстрирована 35 таблицами, 34 рисунками, 2 фотографиями. Библиографический указатель включает 286 наименований отечественных и 165 зарубежных источников литературы.

Лабораторные и клинические исследования проведены непосредственно автором настоящей работы на базе лабораторий и клиники института эпидемиологии и микробиологии ВСНЦ СО РАМН, а также Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н Габричевского (зав. лаб. Е.А. Шмелева). Кроме того, использованы некоторые архивные материалы городской бак.лаборатории г.Ангарска, детских районных поликлиник г. Иркутска.

Автор выражает искреннюю признательность за консультативную, практическую и организационную помощь в работе над диссертацией и ее оформлением академику РАМН В.И.Злобину, д.б.н., профессору Е.А.Шмелевой, к.м.н., ст.н.с. А.Г.Леонтьевой, к.м.н., ст.н.с, ученому секретарю ИЭМ ВСНЦ РАМН В.М.Коган, директору ИЭМ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, академику РАМН М.Ф.Савченкову, к.м.н. В.А.Астафьеву.

Роль симбионтных микроорганизмов в процессах иммуномодуляции макроорганизма

Естественная микрофлора человека играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и неспецифических защитных реакций в жизнедеятельности макроорганизма [Калмыкова А.И., 2001; Мухина Ю.Г., 1999; Шендеров Б.А., 2001].

Хорошо известна иммуномодулирующая функция микрофлоры кишечника. Становление иммунного ответа формируется в первые часы неонатального периода под влиянием микрофлоры [Куваева И.Б., Ладодо К.С., 1991].

Клинические и лабораторные данные многих авторов свидетельствуют об определенном параллелизме изменений при нарушении иммунного статуса и дисбактериоза кишечника при различных патологических состояниях. По наблюдениям медиков [Lidbeck A. et al., 1992], у детей с дисбактериозами в раннем неонатальном периоде процесс нормального становления иммунитета нарушается в основном за счет нарушения синтеза IgM и лизоцима, а также снижения активности макрофагов. Все эти изменения приводят к частым заболеваниям в течение первого года жизни: конъюнктивитам, пиодермии, ОРВИ и кожным проявлениям аллергии [Абдумаджидова Ш.У., 1989; Зеленова Е.Г.и соавт., 1992; Лебеденко А.А., 1987].

Выявлены явно выраженные тенденции к существованию сильной обратной связи между проявлениями дисбактериоза кишечника и нарушениями в системе иммунитета, а также связи выраженности клинической симптоматики с интенсивностью и структурой лабораторно подтвержденных признаков нарушений в кишечном бактериоценозе и иммунном статусе [Korshunov V.M. et al., 2001; Федотова Т.А. и соавт., 200І]. При изучении показателей гуморального иммунитета у больных с тяжелой формой дисбактериоза выявлено снижение концентраций в сыворотке крови IgA и IgG, а также фагоцитирующей активности лейкоцитов. Допустимо и снижение уровня slgA.

В многочисленных источниках подчеркивается роль симбионтов кишечника в стимуляции неспецифических механизмов защиты организма [ Белобородова Н.В., Белобородое СМ., 2000; Белобородова Н.В., Осипов Г.А., 1999; Duchmann R. et al., 1999; Kikuchi-Hayakawa H.et al. 1998; Mishra A.et al., 1999; Naaber P. et al., 2000; Yasui H. et al., 1999]. Всасываясь в желудочно-кишечном тракте, продукты распада микробных клеток обусловливают образование нормальных антител: агглютининов и опсонинов [Kaila М. et al., 1992; Kimura К. et al., 1997; Mahida Y.R., et al., 1997].

Исключение нормальной микрофлоры в экспериментах приводит недоразвитию лимфоидной ткани таких животных и снижению функциональной активности лимфоцитов. Снижение иммунологической функции лимфатических узлов проявлялось также меньшим содержанием в них плазматических клеток и, соответственно, уменьшением продукции иммуноглобулинов. Размер селезенки у безмикробных животных уменьшен почти в два раза, лимфопоэз выражен слабо. Без всякого сомнения, наибольшее влияние отсутствие микрофлоры оказывает на гистологическую структуру кишечника, который, помимо пищеварительной, выполняет важные иммунологические функции [Красноголовец В.Н., 1989; Панин А.Н.и соавт., 1998; Чахава О.В. и соавт., 1982; Boman H.G. 2000; Elson CO. et al. 1995; Kato I. et al., 1988; Kimura K. et al., 1997; Link-Amster H. et al., 1995; Rolfe R.D., 2000]. Исследователи отмечают истончение стенки тонкого и толстого кишечника у безмикробных «животных, уменьшение числа ворсинок и клеточных элементов (особенно лимфоцитов, плазматических и тучных клеток). В них снижается количество клеток, продуцирующих глобулин. По сравнению с обычными животными, безмикробные особи характеризуются более низким содержанием общего белка, а-, р- и у - глобулинов [Калмыкова А.И., 2001; Чахава О.В. и соавт., 1992].

В сыворотке безмикробных животных содержится мало иммуноглобулинов А и G, полностью отсутствуют иммуноглобулины М и нормальные антитела. Вследствие этого, у них ослаблена бактерицидная активность сыворотки крови [Buts J.P., 1990; Kaila М. et al., 1992].

Нормальная микрофлора стимулирует выделение макрофагами литических ферментов и способствует процессам переваривания фагоцитированных частиц, дифференцировке гистиоцитов-макрофагов [Kimura К. et а!., 1997]. Животные-гнотобионты демонстрируют недоразвитие иммунной системы, выражающееся в сниженном количестве иммунокомпетентных клеток в лимфоидных тканях, угнетении клеточного звена иммунитета, включая Т- и В-лимфоциты и макрофаги, а также в повышении чувствительности к инфекциям. У безмикробных животных понижено содержание лизоцима в сыворотке крови [Насонова Т.А., Мальцев В.Н., 1983; Подволоцкая А.Б., 2000; De Simone С. et al., 1992].

Данные нарушения могут быть устранены при конвенционализации животных-гнотобионтов, т.е. при подселении нормальной микробной флоры кишечника [Чахава О.В. и соавт., 1992; Woolverton CJ. et al., 1992]. Таким образом, микроорганизмы нормальной микрофлоры кишечника являются иммуномодулирующими агентами.

Пероральное введение убитых бифидо- и лактобактерий приводит к повышению устойчивости конвенциональных мышей к сальмонеллезнои инфекции, причем данный эффект сопровождается увеличением числа Ig-продуцирующих клеток в lamina propria тонкой кишки. Таким же свойством в отношении стимуляции Ig-продукции обладают препараты клеточной стенки бифидобактерий и ультразвуковой растворимый антиген [Коршунов В.М. и соавт., 1996; Шкарупета М.М. и соавт., 1989].

Объекты исследований

Бифидобактерии - штамм Bifidobacterium bifidum I., выделенный из сухого коммерческогоvпрепарата " Bifidobacterium siccum" ", сер. 0518, выпуска 1998 г., производства ФГУП "Аллерген", г. Ставрополь; Bifidum longum, выделенный из закваски для приготовления кисломолочного препарата «Бифифит» (Восточно-Сибирский технологический институт, г. Улан-Уде); аутоштаммы бифидобактерии, выделенные из копрологических проб детей раннего возраста (до 3-х лет) с клинической симптоматикой «дисбактериоз кишечника», подтвержденной бактериологически — 182 штамма. - Лактобактерии - штамм Lactobacterium plantarum из сухого коммерческого препарата «Lactobacterium siccum». - Музейный штамм нормальной E.coli (ЭПК-028/57), и аутоштаммы (3 шт.) нормальной E.coli, выделенные из копрологических проб детей раннего возраста.

-Эталонный штамм Staphylococcus aureus 209, аутоштаммы S.aureus (10 шт.), выделенные из копрологических проб детей раннего возраста. Вышеперечисленные микроорганизмы использовались при постановке адгезии, конструировании диагностикумов (бифидобактерии и лактобактерии), изучении биологических свойств. Всего в процессе работы было подвергнуто анализу результаты более 1500 микробиологических исследований, идентифицировано более 7000 штаммов бактерий, из них 1800 анаэробных и около 5000 аэробных микроорганизмов.

2. Образцы крови разных групп людей и животных (табл. 2.1.).

- Образцы крови здоровых детей разных возрастов г. Иркутска (177 человек), г. Усолье-Сибирское (315 человек), Иркутск+Слюдянка (285 человек из организованных коллективов), города Читинской области: Балей — 110 детей, Краснокаменск (пос. Октябрьский) — 78 детей, 33 взрослых.

- Образцы крови здоровых взрослых лиц г. Иркутска (639 человек), Усолье-Сибирское (1300 человек).

- Сыворотки взрослых пациентов ожогового центра г. Иркутска (100 человек),

- Образцы крови лиц с диагнозом "носитель токсигенных коринебактерий дифтерии" (г. Иркутск, дети -180 человек, взрослые - 27 человек).

3. Копрологические пробы детей от 1 мес. до 6 лет с клиническим диагнозом "кишечный дисбактериоз" - 905 проб, а также детей 2-10 лет с диагнозом носительство токсигенных коринебактерий дифтерии - 28 проб. Мазки из зева на сопутствующую микрофлору были взяты у детей с диагнозом носительство токсигенных коринебактерий дифтерии - 28 проб.

4. Материалы бак. лабораторий гг. Иркутска и Ангарска по исследованию детей от 0 до 7 лет на кишечный дисбактериоз - 747 анализов.

5. Лекарственные растения. Кашкара. Рододендрон - род, семейство Вересковых (Ericaceae). По отношению к стрептококкам, стафилококкам и патогенной кишечной флоре препараты растения (жидкий экстракт, настойки и настои) обладают сильным бактерицидным действием. Хороший эффект отмечен при приеме настоя или отвара листьев кашкары при спастическом колите, энтероколите, энтеритах, в т. ч. и стафилококкового происхождения

[Телятьєв В.В., 1985]. Курильский чай. Пятилистник кустарниковый - Penthaphylloides fruticosa (L), Дазифора кустарниковая - Dasifora fruticosa (L). Экспериментально доказана антимикробная активность курильского чая и Р-витаминное действие суммы флавоноидов, выделенных из надземной части растения. Водный отвар растения в 1%-ой концентрации обладает бактерицидным действием на возбудителей кишечных инфекций. Применение водного отвара при дизентерии также дало положительные результаты. По наблюдениям детских врачей, является хорошим средством для устранения дисбактериоза, в т.ч. стафилококковой этиологии [ Минаева В.Г. ,1991, Телятьєв В.В., 1985]. 6. Животные. Кролики породы "Шиншилла" были приобретены в Ветеринарной лаборатории г. Иркутска (12 голов) для получения гипериммунных сывороток при разработке диагностикумов.

7. Вакцина "Кодивак" (дифтерийная бактериальная вакцина), производства Предприятия бактерийных препаратов Московского НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского была любезно предоставлена автором препарата, д.б.н. Е.А.Шмелевой для конструирования диагностикума с антигенами коринебактерий дифтерии с целью определения антибактериальных противодифтерийных антител. Специальные серии вакцины использовались для санации носителей токсигенных коринебактерий дифтерии.

8. Формалшшзированные эритроциты человека 1(0)гр. Rh(+) и формалинизированные эритроциты барана использовались при конструировании иммунодиагностикумов.

Биохимическая внутрипопуляционная гетерогенность E.coli и формирование кишечных дисбиозов

. В отечественной медицинской литературе довольно редко встречаются материалы по «региональным» особенностям представителей нормальной микрофлоры кишечника. Особенно это касается проблемы диссоциации нормальной кишечной палочки и распространенности гемолитических форм эшерихий. С этой точки зрения вышеприведенные материалы свидетельствовали о неравнозначности экологической обстановки в различных местах проживания детей раннего возраста в городах В Иркутской области. Это послужило побудительным мотивом проведения более тщательного микроэкологического анализа материалов исследований.

Кишечные палочки определялись в микрофлоре всех обследуемых детей (100%). Однако, наряду с полноценными эшерихиями, весьма часто встречались культуры со сниженной ферментативной активностью, а также наделенные признаками патогенности. Учитывая известное постоянство соотношения «аэробы/анаэробы» для кишечной микрофлоры (1:1000), отражающее фактор аутостабилизации кишечного микробиоценоза, количественная и качественная характеристика кишечной палочки была проведена в зависимости от возраста детей и содержания бифидобактерий.

У детей г. Иркутска характеристика нормальной кишечной палочки на фоне разного количественного содержания бифидобактерий оказалась различной. В группе детей до 1 года при достаточном количестве бифидобактерий нормальная E.coli выявлялась только у 68% лиц; при дефиците бифидобактерий - у 51%; у остальных наблюдалось количественное ее снижение с качественными изменениями. В возрастной группе детей от 1 года до 5 лет при достаточном (lg КОЕ/г 10) количестве бифидобактерий у 58% лиц отмечались только количественные изменения (снижение уровня) нормальной кишечной палочки, а у остальных - наличие атипичных форм. При дефиците (lg КОЕ/г 8) бифидобактерий в значительном количестве наблюдалось снижение содержания кишечной палочки с атипичными формами. У детей старше 5 лет в 100% отмечалось снижение уровня E.coli (lg КОЕ/г 6), независимо от количественного содержания бифидобактерий.

Как оказалось, при таком подходе довольно сложно было проследить зависимость количественного и качественного содержания нормальной кишечной палочки от физиологичного либо дефицитного содержания бифидобактерий. Также сложно говорить о степени устойчивости данной биологической системы (кишечный микробиоценоз) по таким микробиологическим параметрам. Хотя тот факт, что, при дефиците бифидобактерий у детей до 5 лет отмечалось уменьшение аномальных форм нормальной кишечной палочки, можно расценивать и как тенденцию к стабилизации кишечного микробиоценоза.

Согласно современным представлениям, отдельные параметры нормы микробиоценоза достаточно широки, и общую закономерность необходимо рассматривать не как незыблемый постулат, а лишь приближение, достоверность которого зависит от множества факторов, в том числе внутренних взаимосвязей как в симбиозе, так и системе «хозяин-микрофлора», метаболической активности симбионтов, наличия у них признаков патогенности, аномалии. Поэтому следующим этапом нашей работы было оценить популяционную структуру, или степень разнообразия, эшерихий по биохимическим показателям и гемолитическим свойствам. Нормальная кишечная палочка после бифидобактерий и лактобактерий также относится к основным представителям облигатной микрофлоры кишечного микробиоценоза и характеристики этого микроорганизма часто бывает вполне достаточна для клинических целей.

Исходя из этого, при анализе материала мы применили подход с использованием индекса разнообразия Шеннона [Одум Ю., 1975] (рис. 4.2.1).

Всего было проанализировано более 1000 клонов эшерихий по 4-м признакам: лактозоположительная, лактозонегативная, со слабоферментными свойствами и гемолитическая кишечная палочка. Как мы и предполагали, индекс Шеннона в исследуемых возрастных группах оказался достаточно высоким и незначительно колебался от 0,31 до 0,35. Поскольку мы располагали материалами по биохимической гетерогенности E.coli в старших возрастных группах, мы посчитали нужным проследить дальнейшую возрастную динамику этого показателя. Индекс был просчитан для групп 7-14 лет (п=32), 15-20 лет (п=18), 21-27 лет (п=15), 28-40 лет (п=19) и 41-60 лет (п=17).

Похожие диссертации на Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири