Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус чумы плотоядных (Canine Distemper Virus,CDV), представитель рода Morbilhvirus семейства Paramyxovindae, явился причиной эпизоотии байкальских тюленей Phoca sibmca, приведшей к гибели 10-15 тысяч животных в течение осени 1987 - весны 1988 гг (Grachev et al, 1989, Lichoshway et al, 1989) Практически одновременно, в 1988 г, в морях Северной Европы началась массовая гибель тюленей Phoca vitulma, но причиной этой эпизоотии послужил морбилливирус, близкородственный CDV, впоследствии описанный как самостоятельный вид Phocme distemper virus (PDV) (Osterhaus, Vedder , 1988, Mahy et al. 1988) Морбилливирусные инфекции у ластоногих были впервые зарегистрированы именно во время этих эпизоотии До 1988 г род Morbilhvirus объединял четыре вида вирусов measle virus (MV), nngerpest virus (RPV), peste-des-pestits-ruminants virus (PPRV) и canine distemper virus (CDV) Считалось, что морбилливирусы инфицируют строго ограниченный круг млекопитающих (видоспецифичны), в который представители ластоногих не входили
После затухания морбилливирусных эпизоотии у ластоногих 1987-1988 г. ситуации на Байкале и в морях Северной Европы развивались совершенно по-разному Так, процент серопозитивных к PDV взрослых шотландских тюленей снизился с 72% в 1988г до 0% в 2000 г (Thompson et al, 2002). Вирус не регистрировался до повторной эпизоотии в 2002 г, которая началась, как и первая, на о Анхольт и оказалась не менее разрушительной (Jensen et al, 2002, Muller et al, 2004) Варианты PDV 2002 г незначительно отличались от варианта 1988 г и имели мутации в исследуемом фрагменте гена Р (370 н п ), либо молчащие, либо приводящие к замене одной аминокислоты в штамме PDV-l/DK/2002 (Muller et al, 2004)
В Байкале зараженность тюленей в течение всего периода составляла около 40%, причем инфицированные животные были нормальной упитанности без видимых признаков каких-либо нарушений, кроме того, зараженность тюленей не зависела от пола, возраста и места отлова (Беликов и др, 1999) Антитела к CDV были обнаружены у 85% животных (Ohashi et al, 2001) Выявлена значительная гетерогенность анализируемого фрагмента гена Р в популяции байкальской нерпы как в различные года, так и среди образцов головного мозга тюленей, добытых в течение одного года (Бутина и др, 2003). Такие существенные отличия в этих эпизоотических процессах указывают на существование различных механизмов циркуляции вируса в двух экосистемах Поскольку вероятность постоянного инфицирования байкальских тюленей от других животных чрезвычайно низка, появилось предположение о существовании природного резервуара морбилливирусов в экосистеме оз Байкал
Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось доказательство существования природного резервуара CDV в пойкилотермных
животных (брюхоногих моллюсках) Для этого необходимо было решить следующие задачи
-
Показать методом ОТ-ПЦР возможность присутствия РНК вируса чумы плотоядных в организмах пойкилотермных животных
-
Доказать, что вирус чумы плотоядных в организме брюхоногого моллюска сохраняет свою инфекционность для теплокровных животных Провести заражение чувствительных животных (хорьков) и получить изоляты вирусов на культуре клеток
-
Определить нуклеотидные последовательности фрагментов геномов вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы, брюхоногих моллюсков и полученных изолятов вируса чумы плотоядных Определить степень родства вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы и брюхоногих моллюсков
4 Продемонстрировать возможность репликации вируса чумы
плотоядных в организме пойкилотермного животного (брюхоногого
моллюска)
5 Показать, что вирус чумы плотоядных способен передаваться в
популяции брюхоногих моллюсков по поколениям
Научная новизна работы В представленной работе впервые показано, что вирус чумы плотоядных, представитель рода Morbillivirus, ранее считавшийся облигатным вирусом теплокровных, способен накапливаться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков Limnaea auncularia и Maakia herdenana) без потери инфекционности для теплокровных Использованы как молекулярно-биологические (ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности, масспектрометрия), так и вирусологические методы (заражение чувствительных животных, изоляция на культуре клеток MDCK - перевиваемой эпителиальной клеточной культуре почки собаки)
Впервые продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных реплицироваться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков) методом раздельной гибридизации вирусоспецифических кДНК на биотинмеченых праймерах, комплементарных матричной и вирионной РНК, иммобилизованных на стрептавидиновых планшетах
Впервые в результате длительного культивирования брюхоногих моллюсков L auncularia в условиях, исключающих дополнительную контаминацию в искусственной водной экосистеме (аквариуме) продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных передаваться в популяции моллюсков по поколениям
Впервые получены изоляты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L auncularia и М herdenana на культуре клеток MDCK, проведена их молекулярно-биологическая, иммунологическая и пептидная характеризация
Определены нуклеотидные последовательности участка кодирующей области гена фосфопротеина длиной 380 нуклеотидов для вариантов CDV от байкальской нерпы, L auncularia и М herdenana Показано, что варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства Практическая значимость работы. Разработанный в работе подход к изучению циркуляции морбилливирусов является абсолютно новым и может быть использован при исследовании экологии других одноцепочечных РНК-содержащих вирусов, в первую очередь - вируса гриппа Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах университетов Основные защищаемые положения:
-
Вирус чумы плотоядных способен накапливаться в оріанизмах брюхоногих моллюсков без потери инфекционное для теплокровных
-
Вирус чумы плотоядных способен реплицироваться в организмах брюхоногих моллюсков
-
Вирус чумы плотоядных способен передаваться в популяции брюхоногих моллюсков L auncularia по поколениям
-
Варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства
Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на 6 конференциях Зг International Symposium "Ancient Lakes Speciation, Development in Time and Space, Natural History" (Иркутск, Россия, 2002), 2nd International Conference "Marine Mammals of Holarctic" (Байкал, Россия, 2002), Всероссийская научно-практическая конференция "Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе" (Иркутск, Россия, 2003), Четвертая Верещагинская Байкальская конференция (Иркутск, Россия, 2005), 20lh Annual Conference of the European Cetacean Society (Gdynia, Poland, 2006), IX съезд гидробиологического общества РАН (Тольятти Россия, 2006) По материалам диссертации опубликовано 3 статьи Личный вклад соискателя. Молекулярно-биологические данные получены лично автором Заражение чувствительных к CDV животных проведено сотрудниками Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» под руководством к б н Шестопалова А М Изоляты CDV на культуре MDCK получены на базе ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, Иркутск, под руководством к б н Черногор Л И Пептидная характеризация изолятов проведена автором на базе Института аналитического приборостроения РАН, г Санкт-Петербург, под руководством к б н Подольской Е П
Структура и объем диссертации. Рукопись диссертационной работы состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (128 наименования, из
них 15 отечественных и 1 13 зарубежных). Работа изложена па 120 страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и 2 таблицы.
