Введение к работе
Актуальность проблемы.
Классическая чума свиней (лат. - Pestus suum; англ. - Hog cholera, Classical swine fever) - особо опасное инфекционное заболевание домашних свиней и диких кабанов [Vilcek, Nettlaton, 2006], которое характеризуется высокой контагиозностью и летальностью [Сергеев, 1993].
КЧС относится к списку А особо опасных инфекций и наносит громадный экономический ущерб свиноводству как развивающихся, так и развитых стран с хорошо организованным ветеринарно-санитарным надзором [Крупальник, Нагасингхе, 2006] Самые крупные эпизоотии произошли в период 1997-1998 гг., включая вспышки в Нидерландах, Германии, Бельгии и Италии. В Нидерландах около 0,7 млн. инфицированных свиней в 429 стадах были убиты. Кроме того, около 10,6 млн незараженных свиней уничтожили вследствие мероприятий по ограничению эпизоотии. В итоге суммарные экономические потери в Нидерландах составили около 2,3 млрд. долларов [Dong, Chen, 2007].
В России и странах СНГ для профилактики и борьбы с КЧС осуществляется поголовная вакцинация с использованием живых аттенуированных вакцин [Сергеев и др., 2005]. Эффективность и безопасность этих вакцин общепризнанны. [Сергеев и др., 2003; Qiu et. al., 2006]. Однако, современные серологические методы диагностики не в состоянии отличить вакцинированных свиней от переболевших, так как животные имеют одинаковый спектр вирусоспецифических антител. В настоящее время ученые многих стран проводят исследования, направленные на разработку маркированных вакцин, создание которых может решить данную проблему [Dong, Chen , 2007].
Гликопротеин Е2 вируса КЧС имеет наиболее важное значение в диагностике данного заболевания, поскольку вызывает образование наибольшего количества вируснейтрализующих антител при вакцинации или заражении. Кроме того, белок Е2 содержит главные антигенные детерминанты, ответственные за протективную активность и нейтрализацию вируса, и, в качестве субъединичной вакцины, обеспечивает защиту против КЧС [Hulst et. al., 1993].
Антигенная структура белка Е2 изучена недостаточно [Wensvoort, 1989; van Rijn, 1993, 1994]. Об отдельных детерминантах этого белка также известно относительно мало [Yu et. al., 1996; Lin et. al, 2000; Peng et. al., 2007]. Для научных и практических целей представляет существенный интерес детальное исследование тонкой антигенной структуры главного поверхностного гликопротеина вируса КЧС, так как данный белок может быть использован в качестве антигенного маркера при создании как субъединичных, так и живых рекомбинантных маркированных вакцин. Кроме того, исследование молекулярных механизмов взаимодействия вируса КЧС с клеткой-хозяином, в частности, изучение природных вирусных белков, необходимо для решения
теоретических проблем: локализации антигенных и иммуногенных детерминант, определения протективных эпитопов. Детальный анализ эпитопов важен для понимания особенностей взаимодействия вируса КЧС с иммунной системой хозяина, а также для разработки и усовершенствования диагностических тест-систем. Выявление более тонких антигенных различий и эпитопное картирование структурных белков возможно только с помощью моноклональных антител (МКА).
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы явилось получение и иммунохимическая характеристика панели моноклональных антител, специфичных к белку Е2 вируса КЧС, и изучение тонкой антигенной структуры данного белка путем картирования антигенных детерминант с помощью полученных моноклональных антител.
Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:
-
Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к гликопротеину Е2 вируса классической чумы свиней.
-
Определить иммунологическую активность, специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител.
-
Оценить возможность использования полученных моноклональных антител для обнаружения антигенов вируса КЧС методом «сэндвич»-варианта ИФА. Определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия моноклональных антител с антигеном Е2 вируса КЧС.
-
Провести топографическое картирование эпитопов белка Е2, распознаваемых полученными МКА, с помощью конкурентного ИФА.
-
Определить способность полученных моноклональных антител конкурировать с поликлональными антителами к вирусу КЧС за связывание с эпитопами на белке Е2. Оценить возможность использования полученных моноклональных антител для выявления антител к вирусу КЧС в сыворотках крови свиней методом конкурентного ИФА.
-
Картировать антигенные детерминанты белка Е2 вируса КЧС с помощью синтетических пептидов, используя в качестве антител-мишеней полученные к данному белку моноклональные антитела.
Научная новизна и практическая значимость.
-
Получена панель, состоящая из 28 моноклональных антител, специфичных к белку Е2 вируса КЧС.
-
На основе «сэндвич»-варианта ИФА разработан лабораторный метод для обнаружения вируса КЧС.
-
Установлено, что нативный белок Е2 вируса КЧС содержит не только конформационо-зависимые, но и линейные эпитопы, способные индуцировать иммунный ответ.
-
Установлена локализация и охарактеризовано 5 линейных В-клеточных эпитопов белка Е2 вируса КЧС, не описанных ранее.
5. Антигенная детерминанта 834-856 а о. белка Е2, в пределах которой с помощью МКА было локализовано 2 В-клеточных эпитопа, высококонсервативна среди различных штаммов вируса классической чумы свиней, но отличается от аналогичных участков белка Е2 других пестивирусов и может представлять интерес для разработки маркированной или субъединичной вакцины против классической чумы свиней.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Моноклональные антитела, полученные в ходе работы, специфичны к белку Е2 вируса КЧС и активно взаимодействуют с данным белком в различных иммунохимических реакциях.
-
Показана способность моноклональных антител выявлять природный белок Е2 в составе вириона вируса КЧС и конкурировать с антителами специфических сывороток крови за связывание с антигенными детерминантами белка Е2 вируса КЧС.
-
Разработан лабораторно-экспериментальный вариант диагностической тест-системы для обнаружения антигенов вируса КЧС на основе «сэндвич»-варианта ИФА, в котором в качестве специфических реагентов были использованы моноклональные антитела к нативному вирусу КЧС.
-
Установлено, что белок Е2 включает, по крайней мере, 8 иммуногенных эпитопов, из которых 5 являются линейными.
Апробация работы.
Основные положения работы были представлены на IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (12-16 марта 2007, Москва), VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (18-19 ноября 2007, Москва), VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (28-30 ноября 2007, Москва).
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 25 сентября 2008 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 4 докладов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации.
