Введение к работе
1.1 Актуальность темы
Африканская чума свиней (АЧС) - контагиозная, септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью, сверхострым, острым, подострым и хроническим течением. К АЧС восприимчивы домашние и дикие свиньи независимо от породы и возраста. Выжившие животные пожизненно остаются вирусоносителями [Коваленко Я. Р., 1965; Бакулов И. А., 1969; Сюрин В. Н., 1972].
Занос возбудителя АЧС в благополучные страны рассматривается специалистами как социальная и экономическая катастрофа. Это связано с огромным экономическим ущербом, причиняемым эпизоотиями данной болезни. [Бакулов И. А., 1969; Moreno M., 1978].
В официальных средствах массовой информации весной 2007 г. появились сведения о массовой гибели домашних свиней в Грузии. 7 июня 2007 г. референс - лаборатория МЭБ (Пирбрайт, Великобритания) поставила диагноз - АЧС. В результате последующих мониторинговых исследований, проведенных в 2007-2008 гг. на территории Чеченской республики РФ, в 21 случае выделен вирус АЧС от павших и отстрелянных диких свиней. Во второй половине 2008 г. развитие эпизоотического процесса АЧС характеризовалось новым этапом - заносом вируса на территорию Республики Северная Осетия - Алания и вовлечению в эпизоотическую цепь домашних свиней [Куриннов В. В., 2010].
В последующие годы вспышки болезни регистрировали еще в 17 субъектах Российской Федерации: республиках Кабардино-Балкария, Калмыкия, Дагестан, Ингушетия, Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской, Волгоградской, Астраханской, Ленинградской, Нижегородской, Оренбургской, Архангельской, Мурманской, Тверской, Курской и Воронежской областях [].
При анализе путей заноса вируса АЧС в благополучные регионы установлено, что основными путями и факторами передачи вируса АЧС являются контаминированные пищевые отходы и мясопродукты от инфицированных свиней.
Мясо и мясопродукты, как правило, поступают на реализацию в замороженном или охлажденном виде и, если животное было убито в инкубационный период болезни, то вирус АЧС может сохраняться в мясопродуктах длительное время и представлять большую опасность в распространении болезни.
В диагностике инфекционных болезней животных, на сегодняшний день, нашли широкое применение серологические методы (ИФА, РПИФ) и методы на основе анализа генома (ПЦР с электрофорезной детекцией, ПЦР в реальном времени), поскольку они позволяют анализировать в краткие сроки одновременно большое количество проб и применять приборные методы учета реакции [Вишняков И.Ф., 1992; Цыбанов С.Ж., 1995; Aguero M., 2003].
Проведение соответствующих мероприятий по ликвидации очагов болезни в наиболее сжатые сроки возможно только при своевременной постановке диагноза и контроле продуктов свиноводства, которые могут содержать вирус АЧС и транспортироваться на различные расстояния, в том числе и для торговли. Это обуславливает необходимость разработки и внедрения в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов индикации вируса АЧС, как в пробах органов инфицированных животных, так и в объектах ветеринарного надзора.
Поэтому актуальной задачей является разработка и усовершенствование методов индикации генома вируса АЧС в объектах ветеринарного надзора и внедрение их в практику исследований, а так же изучение сохранности вируса АЧС во внешней среде и продуктах животного происхождения.
1.2 Степень разработанности проблемы
Steiger Y. и Ackermann M. в 1992 г. был предложен гнездовой вариант ПЦР для выявления ДНК вируса АЧС, который по чувствительности был сравним с выделением вируса на культуре клеток. Aguero M. et al. (2003) разработали однораундовую ПЦР с последующей рестрикцией эндонуклеазой BsmAI для подтверждения специфичности реакции. В РФ метод выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР с электрофорезной детекцией был разработан в 1995 г. Цыбановым С. Ж. Но недостатком ее применения в диагностике является возможность контаминации продуктами реакции и получение, вследствие этого, ложноположительных результатов. Преимущества ПЦР в реальном времени заключаются в уменьшении риска контаминации реакции ампликонами, сокращение времени анализа и трудозатрат, а так же объективностью учета и интерпретации результатов реакции, т.к. они производятся с помощью программного обеспечении прибора.
Среди отечественных ученых проблему устойчивости вируса АЧС изучали Коваленко Я.Р. (1965), Миколайчук С.В. (1992), однако данные по индикации ДНК вируса АЧС в продуктах свиноводства и объектах ветеринарного надзора отсутствуют.
1.3 Цель и задачи исследования
Целью исследования являлась разработка и усовершенствование методов индикации генома вируса АЧС в объектах ветеринарного надзора, а так же изучение сохраняемости вируса АЧС в продуктах животного происхождения.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработать и усовершенствовать тест-систему на основе ПЦР в реальном времени для обнаружения ДНК вируса АЧС в различных вируссодержащих образцах, оценить ее чувствительность и специфичность.
-
Изучить сохраняемость вируса АЧС в продуктах убоя и пробах органов инфицированных животных.
-
Провести мониторинг АЧС на территории РФ и дать молекулярно-генетическую характеристику изолятов вируса АЧС, выделенных в период 2008 – 2011 гг.
-
Определить наличие генома вируса АЧС в иксодовых клещах, собранных на территории Южного федерального округа.
1.4 Научная новизна результатов исследования
-
Впервые в России на основании амплификации пяти вариабельных участков генома (B602L, KP86R, J268L, BtSj и ген I196L) дана молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ в период 2008-2011гг.
-
Впервые в России изучена сохраняемость вируса АЧС (штамм «Ставрополь 2009») в продуктах убоя и пробах органов инфицированных свиней при разных температурах хранения.
-
Разработан и усовершенствован метод выявления ДНК вируса АЧС на основе ПЦР в реальном времени с внутренним контрольным образцом.
1.5 Практическая значимость работы
-
На основе результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по дифференциации штаммов вируса африканской чумы свиней методом ПЦР», которые рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарной медицины РАСХН (29.10.2009 г.) и утверждены академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. (24.12.2009 г.).
-
Разработаны «Методические положения по выявлению генома вируса АЧС в образцах биологического материала и объектах ветеринарного надзора», которые рассмотрены на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (27.04.2011 г.) и утверждены академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. (10.11.2011 г.).
-
«Методические положения по проведению пассивного и активного мониторинга африканской чумы свиней», которые рассмотрены на секции Инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (23.09.2011 г.) и утверждены академиком секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым А.М. (10.11.2011 г.).
-
Изготовлено и поставлено в ветеринарные лаборатории страны свыше 500 наборов для выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени.
-
С помощью разработанных методов ПЦР в период 2009-2011 гг. исследовано более 59 тыс. проб патологического материала, отобранных от животных с подозрением на АЧС, из которых была выявлена 541 положительная проба.
-
С использованием метода ПЦР и последующим нуклеотидным секвенированием проведено генотипирование семи изолятов вируса АЧС, выявленных в различных регионах РФ в период 2008 - 2011 гг.
1.6 Апробация работы
Основные результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, заслушаны и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2009-2011 гг.).
Материалы диссертации доложены на: заседании Круглого Стола по АЧС (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии г. Покров, 2009 г.), II-ой Международной научно-практической конференции УГСХА (Ульяновск 2010 г.), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии г. Покров, 2011 г.), Международном семинаре «Workshop on laboratory diagnosis of african and classical swine fever» (Словения, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011 г.).
1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности
В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы разработки мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования – генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер предупреждения, диагностики и лечения вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по усовершенствованию методов ПЦР диагностики АЧС посредством разработки генно-инженерных конструкций и применению усовершенствованных тест-систем в лабораторной диагностике болезни, а так же исследования по изучению стабильности вируса АЧС в продуктах переработки свинины.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 4, 5, 8, 10.
1.8 Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
1.9 Объем и структура диссертации
