Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзорный анализ литературы 10
1.1. Таксономия бактерий рода Bacillus 10
1.2. Физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Bacillus 17
1.3. Феномен устойчивости спор к различным факторам окружающей среды 20
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 29
2.1. Физико-географическая характеристика озера Байкал и термальных источников Котельниковский, Хакусы, Змеиный .. 29
2.2. Физико-географическая характеристика озера Хубсугул... 35
2.3. Методы исследований 39
ГЛАВА 3. Распространение, биоразнообразие и физиолого- биохимическая характеристика представителей рода Bacillus в воде, донных осадках озера Байкал и термальных источниках
Прибайкалья 54
3.1. Пространственное распределение представителей рода Bacillus в воде и донных осадках озера Байкал 54
3.2. Биоразнообразие бактерий рода Bacillus, изолированных изводы и донных осадков оз. Байкал 71
3.3. Ферментативная активность штаммов рода Bacillus, выделенных из оз. Байкал 80
3.4. Ферментативная активность культивируемых бактерий рода Bacillus в термальных источниках Прибайкалья (Змеиный, Хакусы и Котельниковский) 84
ГЛАВА 4. Бактерии рода Bacillus в донных осадках оз. Хубсугул 89
4.1. Распределение и численность бактерий рода Bacillus в донных отложениях озера Хубсугул 89
4.2. Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий рода Bacillus 93
ГЛАВА 5. Роль микроорганизмов рода Bacillus в биодеградации сложных органических соединений и растворении соединений кремния 96
5.1. Деградация углеводородов бактериями рода Bacillus 96
5.2. Деградация бис-(2-этилгексил)фталата бактериями рода Bacillus 104
5.3 Роль представителей рода Bacillus в растворении соединений кремния 109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
ВЫВОДЫ 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124
ПРИЛОЖЕНИЯ 141
- Таксономия бактерий рода Bacillus
- Физико-географическая характеристика озера Байкал и термальных источников Котельниковский, Хакусы, Змеиный
- Пространственное распределение представителей рода Bacillus в воде и донных осадках озера Байкал
Введение к работе
Актуальность проблемы. Представители рода Bacillus вызывает большой интерес микробиологов по причине повсеместного распространения представителей этого рода бактерий, цикла развития, необычной устойчивости их спор к химическим и физическим агентам и патогенности.
В настоящее время проводится широкий спектр исследований представителей данных бактерий, хотя гетерогенность по физиологическим, экологическим и генетическим характеристикам затрудняет классификацию бактерий рода Bacillus. Для идентификации представлен обширный список фенотипических признаков.' Кроме того, в международном генном банке зарегистрирован 3779 фрагмент последовательностей гена 16S рибосомальной РНК, которые отнесены к роду Bacillus. Следует отметить, что полные геномы получены для 38 штаммов бацилл ().
Несомненно, огромный интерес представляет изучение механизмов устойчивости спор к различным физическим и химическим факторам. Споры с момента обнаружения были признаны самой выносливой среди известных форм жизни на Земле. В состоянии покоя споры показывают высокую степень устойчивости к инактивации различными физическими и химическими факторами, включая влажный пар, высушивание, ультрафиолетовое и гамма-излучение, вакуум и окисляющие агенты (Nicholson et al, 2000). Несмотря на инактивацию метаболизма, споры остаются способными к непрерывному контролю пищевого состояния их среды, и они быстро реагируют на поступление необходимых питательных веществ, прорастая и возобновляя вегетативный рост. Покоящиеся споры показывают невероятную долговечность и могут быть обнаружены фактически в любом типе среды обитания на Земле. Например, споры строго термофильного Bacillus spp. были изолированы из осадков холодных озёр (Nicholson et al, 2000). Имеются дискуссионные сообщения о том, что
жизнеспособные споры Bacillus sphaericus были восстановлены из кишки пчелы в Доминиканском янтаре, возраст которого от 25 до 40 миллионов лет (Fischman, 1995; Сапо, Borucki, 1995).
Группа спорообразующих бактерий в озере Байкал, озере Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья изучена недостаточно. Было показано, что эта группа бактерий составляет до 20% в составе микробного сообщества озера Байкал. Бактерии рода Bacillus в основном выделяли из придонных слоев воды и донных осадков (Максимова, Максимов, 1989). По результатам молекулярно-генетического анализа из глубоководной пробы воды, отобранной на центральной станции Южного Байкала, были получены всего 3 последовательности, отнесенные к роду Bacillus с невысоким процентом гомологии с ближайшими родственниками (Белькова и др., 1996).
Термальные источники - это особая экологическая ниша, сообщество ; микроорганизмов которых является уникальным. Несомненный интерес представляет потенциальная ферментативная активность этих термофильных бактерий. Так, например, из гидротермальных источников Змеиный и Горячинский были выделены специфичные эндонуклеазы рестрикции из Bacillus stearothermophilus (Репин и др., 2001). Очень подробно изучено микробное сообщество и его биологическая активность в гидротермах Прибайкалья (Бурятия) лабораторией института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Уде (Дармаева и Намсараев, 2002, Данилова и др., 2003, Зайцева, 2005, Шагжина, Балданова, 2005, Базаржапов и др., 2006). По данным, представленным Зайцевой СВ. и Шагжиной А.П., изолировали также и штаммы, отнесённые к роду Bacillus. Термальные источники Котельниковский, Хакусы и Змеинка ранее были изучены Бельковой Н.Л. и Тазаки К. (2003), где микробное сообщество представлено с точки зрения химических процессов.
В донных осадках озера Хубсугул бактерии рода Bacillus ранее не изучались. Была проведена работа по определению ферментативной активности донного микробного сообщества (Maximov, 2006).
Исходя из показанной особой устойчивости спор, исследование спорообразующих бактерий в экстремальных условиях высоких и низких температур представляет особый научный интерес.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - установить распространение, видовой состав и физиолого-биохимическую активность бактерий рода Bacillus в экосистемах озера Байкал, озера Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья.
Для выполнения данной цели были поставлены следующие задачи:
изучить распространение исследуемой группы бактерий в воде и осадках оз. Байкал;
установить закономерности распределения бактерий в районах нефтепроявлений и влияния реки Селенги, содержащей промышленные и бытовые стоки;
- исследовать численность, распределение и разнообразие бактерий рода
Bacillus в донных осадках оз. Хубсугул;
отработать метод культивирования и изоляции спорообразующих бактерий из термальных источников Прибайкалья;
сформировать коллекцию чистых культур бактерий рода Bacillus из исследуемых водных объектов и определить их видовой состав и ферментативную активность;
изучить активность чистых культур в процессах деградации различных органических соединений и в процессах биоминерализации в условиях лабораторного эксперимента.
Научная новизна. Впервые группа бактерий рода Bacillus показана в различных природных экосистемах озера Байкал, озера Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья. Проведено систематическое определение видового состава. Впервые бактерии данной группы выявлены в
8 термальных источниках, отработаны методы их изоляции при высоких температурах, определена ферментативная активность. Впервые установлена роль представителей этой группы в процессах деструкции «байкальской нефти», полициклических ароматических углеводородов, фталатов и биоминерализации соединений кремния.
Практическая значимость. Сформирована коллекция культур бактерий рода Bacillus, изолированных из озера Байкал, Хубсугул и термальных источников. Их способность деградировать различные органические соединения - нефть, полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), фталаты - и высокая ферментативная активность могут быть использованы в практических целях. Кроме того, бактерии рода Bacillus могут быть использованы в экологическом мониторинге как показатели поступления органического вещества.
Защищаемые положения:
1. Бактерии рода Bacillus обнаружены во всех исследуемых природных
объектах, составляя значительную долю в культивируемом гетеротрофном
сообществе оз. Байкал, оз. Хубсугул и термальных источниках Прибайкалья.
Видовой состав бактерий рода Bacillus в оз. Байкал представлен тремя
известными в науке филогенетическими группами данного рода (В. subtilis
группа I, В. alvei группа И, В. brevis группа III), а в оз. Хубсугул - одной {В.
subtilis группа I).
2. Бактерии рода Bacillus обладают большим биологическим
потенциалом и принимают активное участие в процессах деструкции
сложных органических соединений и биоминерализации соединений
кремния.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на I микробиологическом конгрессе Европейского микробиологического общества, проходившем в Любляне, Словения (июнь-июль, 2003), на международном Байкальском микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ»,
9 проходившем в Иркутске (сентябрь, 2003), на научно-практическом совещании «Перспективы нефтегазоносности Байкала и Западного Забайкалья», г. Улан-Удэ (октябрь, 2003), на межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», г. Иркутск (октябрь, 2004) , посвященной 90-летию со дня рождения проф. А. Г. Гриневич, на Четвёртой Верещагинской Байкальской конференции, г. Иркутск (сентябрь-октябрь, 2005), на международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», г. Саратов (сентябрь, 2005) и на IX Съезде гидробиологического общества РАН, проходившем в г. Тольятти (сентября, 2006). По материалам диссертации опубликовано 11 работ (из них 3 статьи в рецензируемых журналах).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (126 источников, из них 42 - зарубежных) и 8 приложений. Объем работы составляет 163 страницы машинописного текста, включающего 5 таблиц, 34 рисунка и 8 приложений.
Таксономия бактерий рода Bacillus
В 1835 X. Г. Еренберг впервые описал бактерии, назвав их «Vibrio subtilis». В 1872 году Ф. Кон переименовал их в Bacillus subtilis. Данные бактерии были представителями большого и разнообразного рода, описанного Ф. Коном и относящегося к семейству ВасШасеае. Отличительным признаком этого семейства является образование эндоспор, которые могут быть круглыми, овальными или цилиндрическими. Споры -высоко преломляющие структуры, образованные внутри вегетативных клеток. Они впервые были описаны Ф. Коном для Bacillus subtilis, а позднее Р. Кохом у патогенной для позвоночных бактерии В. anthracis, Ф. Кон показал тепловую устойчивость спор В. subtilis, а Р. Кох впервые на примере В. anthracis описал полный цикл спорообразования: от вегетативной клетки до споры и от споры до вегетативной клетки. По причинам необычной устойчивости спор к химическим и физическим агентам, цикла развития, повсеместного распространения представителей этого рода и патогенности В. anthracis род Bacillus до сих пор вызывает большой интерес микробиологов.
Со времени открытия бактерий наличие эндоспоры использовали в классификации как первый признак, характерный для исследуемого рода. Семейство ВасШасеае впервые было систематизировано К. Фишером в 1895 году и объединяло бактери, образующие эндоспоры. Особенностями бактерий рода Bacillus, по которым его отличают от других представителей семейства ВасШасеа, являются: аэробная природа, которая может быть строгая или факультативная, палочковидная форма и продукция каталазы. Кроме того, к этому семейству относятся рода, представители которых также имеют палочковидные формы, а именно Sporolactobacillus, являющиеся микроаэрофилами, и каталазо-отрицательные; Clostridium - анаэробы, невосстанавливающие серу; Desulfotomaculum - анаэробы, восстанавливающие серу. С другой стороны, род Sporosarcina, также относящийся к семейству Bacillaceae, представлен кокковыми формами бактерий.
Проанализировав результаты исследований ученых за 107 лет, Р. Гордон со своими коллегами в 1981г. внесли большой вклад в классификацию бактерий рода Bacillus, на основе которой построена современная систематика. Ранее классификация была основана только на двух характеристиках - аэробном росте и формировании эндоспоры. Следует отметить, что по этим признакам можно группировать вместе многие бактерии, обладающие различными физиологическими признаками и обитающие в разнообразных экологических условиях. Эта гетерогенность по физиологическим, экологическим и генетическим характеристикам затрудняет классификацию бактерий рода Bacillus.
Физиолого-биохимическая активность этих микроорганизмов впечатляет: они способны разрушать субстраты, получаемые из растительных и животных остатков (включающие целлюлозу, крахмал, белки, агар, гидрокарбонаты и многие другие); они - продуценты антибиотиков, гетеротрофные нитрификаторы, денитрификаторы, азотфикзаторы, свинец-преципитаторы, окислители селена, окислители и восстановители марганца, факультативные хемолитотрофы, ацидофилы, алкалофилы, психрофилы, термофилы. Несмотря на наличие широкого разнообразия физиологических типов, многие исследователи отмечали, что наши знания экологии спорообразующих бактерий недостаточны. Воздушное распространение покоящихся спор может объяснить появление представителей рода Bacillus в различных местах обитания (Slepecky, Hemphill, 1992).
По данным Р. Гордона (1981), первоначально род Bacillus был представлен 145 видами бактерий (по Slepecky, Hemphill, 1992). Определение ГЦ состава ДНК позволило уточнить характеристику видов и сделать ее более достоверной. В настоящее время в определителе бактерий Берги представлены 40 видов спорообразующих бактерий, описание которых включает ГЦ состав ДНК (Краткий определитель бактерий Берги, 1980). Однако постоянно описываются новые виды бацилл, которые могут быть не внесены в настоящее время в определитель Берги, но достоверно известно, что эти виды генетически и фенотипически отличаются от известных представителей рода Bacillus. Это такие виды, как В. pulvifaciens, описанный Л.К. Накамурой в 1984г., В. alginolyticus и В. chrondrotinus - два альгинат-разлагающих вида в 1987г., В. smithii в 1988г., В. thermoleovorans -облигатно-термофильные, углеводород-утилизирующие бактерии, В. benzoevorans - бактерии, деградирующие ароматические кислоты и фенол, и В. gordonae - бактерии, разлагающие ароматические соединения (по Slepecky, Hemphill, 1992)
Кроме того, отдельно в категорию "Инсектицидные виды" выделены более 200 видов рода Bacillus, которые недостаточно описаны или потерянны их исходные штаммы. Эти виды могут быть восстановлены и внесены в определитель Берги после их ревизии и более детального изучения. Штаммы данной категории были выделены из мертвых или больных насекомых. Типичные представители - это В. popilliae, В. lentimorbus, В. larvae, B.thurgiensis (Stahly et al., 1992).
Физико-географическая характеристика озера Байкал и термальных источников Котельниковский, Хакусы, Змеиный
Озеро Байкал, самое глубокое и древнее пресноводное озеро на нашей планете, расположено в северо-восточной части Центральной Азии (5546 и 5129 с.ш.). Оно условно подразделяется на три части: Южный Байкал - до Селенгинского мелководья, Средний - приольхонская часть - до Академического хребта, протянувшегося от полуострова Святой нос до о. Ольхон, и Северный Байкал - самая протяженная: от п-ва Святой нос до северной оконечности озера в районе пос. Нижнеангарск (Кожов, 1962).
Байкал находится в рифтовой зоне и имеет тектоническое происхождение. Озеро появилось в результате разломов, сдвигов и образования складок в земной коре, поэтому глубина Байкала достигает рекордных для пресных водоемов отметок - 1637 м, что является его уникальной особенностью. Длина Байкала - 636 км, максимальная ширина -79 км, а минимальная ширина - около 26 км. Длина береговой линии - около 2000 км, площадь водосборного бассейна - около 23000 км . Глубоководные участки (более 250 м) занимают 80.9% акватории, тогда как мелководные участки (до 20 м) - всего 7.2%, от 20 до 70 м - 6.8%, от 70 до 250 м - 5.7% (Намсараев, Земская, 2000).
В Байкал впадает более 300 рек и речек, из них крупнейшей является Селенга. Она собирает воды через свои многочисленные притоки с обширной территории восточной части Центральной Азии. Река Селенга имеет площадь бассейна 447060 км2 и вносит в оз. Байкал около 50% всего речного стока. Воды, заполняющие обширный район Селенгинского мелководья, существенно отличаются от «собственно байкальских вод» (Голдырев и др., 1971).
Из других крупных рек необходимо упомянуть Верхнюю Ангару (длина 640 км), а также Кичеру, которые при впадении в Байкал образуют широкую и низкую дельту, заканчивающуюся Северо-Байкальским сором.
Озеро Байкал относится к типичным олиготрофным водоемам. Содержание органического вещества в водах Байкала низкое и составляет в верхнем слое воды 4.0-4.5 мг О/л, затем содержание органического вещества понижается, составляя около 3.0 мг О/л на глубине 1200-1400 м. В придонных слоях воды содержание органического вещества резко возрастает, достигая 8-Ю мг О/л, а в грунтовых растворах верхнего слоя донных отложений - 20-30 мг О/л. Минимальные концентрации органического вещества отмечены в зимний подледный период в январе-феврале и летом - в июле. Максимумы приходятся на апрель и сентябрь-октябрь, то есть проявляются вслед за окончанием массовой гибели фитопланктона (Вотинцев и др., 1975).
Озеро Байкал характеризуется своеобразным температурным режимом, который обусловлен не только климатическими условиями, а прежде всего глубиной озера и резким преобладанием глубинной зоны над мелководьями (Кожов, 1972). Сезонные изменения температуры толщи вод озера Байкал t охватывают лишь верхний слой воды, до глубины 200-250 м. Ниже его температура воды практически постоянна круглый год - 3.3-3.6С. Прогревание верхнего слоя вод начинается сразу же после установления ледяного покрова (февраль-март) за счет проникновения через него солнечной радиации. В связи с этим начинается подтаивание ледяного покрова снизу и поступление в верхний слой расплавов льда. Подледное прогревание, наряду с увеличением освещенности и поступлением талых вод, служит толчком для развития в этом слое фитопланктона и, как следствие, большого количества бактерий. После вскрытия озера ото льда проходит 40-50 и более дней, прежде чем весь верхний 20-метровый слой воды прогреется до 3.3 4.0С, а температура всей толщи воды озера практически уравняется, - наступает весенняя гомотермия. Вся толща вод в температурном отношении представляет собой единое целое. В Южном Байкале она приходится на третью декаду июня. Летнее прогревание в Южном Байкале длится от весенней гомотермии (обычно от конца июня до середины или конца августа). Поверхностный слой воды прогревается до 12-15С. На обширных мелководьях в июле-августе вода нагревается до 17-18С, в глухих заливах и сорах - до 22-24С (Кожов, 1972).
В период зимней стагнации Байкал покрыт льдом с января по апрель включительно. Для этого периода характерна обратная стратификация температур, наличие температурного скачка и развитие в марте-апреле холодолюбивого фитопланктона, сосредоточенного в слое 0-50 м (Кожов, 1962). Количество легкоокисляемого органического вещества нарастает от начала до конца периода в верхних горизонтах до 50 м (Вотинцев, 1961). После освобождения озера из-подо льда во второй половине мая наступает период весенней циркуляции и весенней гомотермии. Начинается интенсивное ветровое перемешивание. Развивавшиеся подо льдом водоросли отмирают и вместе с водными массами увлекаются вглубь. По данным К.К. Вотинцева (1961), содержание органического вещества выравнивается по всей толще, оставаясь несколько повышенным на поверхности.
class3 Распространение, биоразнообразие и физиолого- биохимическая характеристика представителей рода Bacillus в воде, донных осадках озера Байкал и термальных источниках
Прибайкалья class3
Пространственное распределение представителей рода Bacillus в воде и донных осадках озера Байкал
Водная толща озера Байкал заселена большим количеством микроорганизмов, которые играют важную роль в процессах круговорота веществ и энергии. Микроорганизмы занимают ведущее место в процессах самоочищения озера, минерализуя органические вещества, участвуя в круговороте биогенных элементов. В качестве основных факторов, определяющих развитие и активность микроорганизмов, можно указать на вертикальное распределение температур, проникновение света, количество растворенного органического вещества, кислорода, усваиваемых форм азота и других биогенных элементов (Горленко и др., 1977; Громов, Павленко, 1989).
Анализ публикаций за последние 20 лет показал, что группа спорообразующих бактерий, обитающих в Байкале, изучена не достаточно подробно. Однако таксономические исследования микробного сообщества выявили такой существенный факт: что, довольно многочисленная группа представителей рода Bacillus составляет до 20% от культивируемого гетеротрофного сообщества (Максимова, Максимов, 1989).
Изучение пространственного распределения исследуемой группы бактерий рода Bacillus в микробном сообществе озера Байкал связано с необходимостью определения их доли в культивируемом микробном сообществе, а также роли в экосистеме озера.
Сезонные изменения бактериопланктона, связанные с особенностями годовых циклов и совокупностью биотических и абиотических факторов, определенным образом отражаются на пространственном распределении бацилл в водной толще и донных осадках озера. Изучение пространственного распределения необходимо связывать с периодами зимней и летней стагнации, весенней и осенней циркуляции, когда устанавливается гомотермия, так как с этими этапами тесно связана динамика органических веществ в толще вод озера Байкал (Максимова, Максимов, 1972).
Изучение пространственного распределения культивируемых гетеротрофов и бактерий рода Bacillus проводилось в августе 2003 г. и июле 2004 г. (прилож. 1). Распределение представителей исследуемого рода в поверхностном слое оз. Байкал представлено на рисунке 2. В 2004 г. в поверхностном слое воды число спорообразующих бактерий значительно увеличилось, минимальное значение составило 64 кл/мл на разрезе Листвянка - Танхой, в то время когда в 2003 г. минимальные значения были около нуля (разрезы Анга - Сухая, Ухан - Тонкий, Болдаково - Ольхонские ворота). Максимальное значение в 2004 г. зарегистрировали на разрезе Ухан - Тонкий, где численность была равна 1314 кл/мл, а в 2003 г. максимальное значение составило 760 кл/мл на разрезе Академический хребет. На Северном Байкале в поверхностном горизонте воды изучаемая группа бактерий доминировала и составляла 42-72% от общей численности культивируемого гетеротрофного сообщества. В Среднем Байкале этот показатель в среднем составил 30%, в то время как в Южном Байкале он минимален и на разрезе Маритуй - Солзан составил 4%. По данным 2004 г. бактерии рода Bacillus максимально были сконцентрированы в поверхностных слоях водной толщи, в то время как в 2003 г. бактерии этой группы были отмечены в основном в придонных слоях. В Южном Байкале по данным 2003 г. бациллы были распространены неравномерно. На разрезах Маритуй - Солзан и Листвянка - Танхой бактерии рода Bacillus были отмечены- в поверхностных (до 50 метров глубины) и в придонных слоях водной толщи в среднем 14 и 30 % в гетеротрофном сообществе, соответственно (рисунок 3). Развитие гетеротрофов на глубине до 50 м, по-видимому, было связано с концентрацией органического вещества, которое образуется в результате массового отмирания холодолюбивого комплекса фитопланктона.
