Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Слияние биологических и модельных мембран (обзор литературы) 8
I. Определение слияния; основные направления и методы изучения 8
2. Слияние мембран при экзоцитозе 10
3. Слияние мембран в некоторых модельных и полумодельных системах 24
3.1. Общие проблемы изучения слияния 24
3.2. Слияние липосом с клетками 26
3.3. Слияние липосом 27
3.4. Слияние везикул с плоскими бислоями 28
3.4.1. Реконструкция фрагментов биомембран на плоском бислое 28
3.4.2. Слияние липосом с плоскими бислоями 32
Глава II. Материалы и методы исследования 39
I. Применение потенциодинамического метода для исследования взашлодействия липосом с ШМ 39
2. Материалы и методы формирования ШМ и получения липосом 51
3. Другие методы 52
Глава III. Результаты экспериментов и их обсуждение... 56
1. Изменение разности поверхностных потенциалов плоских бислоев при взаимодействии их с липосомами 56
1.1 Зависимости от времени при постоянной концентрации липосом 56
1.2. Зависимости от концентрации липосом ... 62
2. Механизм взаимодействия липосом с БЛМ... 69
2.1. Происхождение ДТ$ : липосомы или мономеры?.. 69
2.1,1. Зависимости А % от концентрации различных форм существования липида в растворе 69
2.1.2. Изменение А% в присутствии фильтра, непроницаемого для липосом... 75
2.1.3. Опыты с изменением ионной силы 77
2.2. Причины необратимости Л% 81
2.2.1. Проверка эффективности перфузии 82
2.2.2. Влияние липосом на необратимость 84
3. Слияние липосом с БЛМ 90
3.1. Влияние Са на взаимодействие липосом с нейтральной БЛМ 91
3.2. Влияние Са на взаимодействие липосом с заряженной БЛМ. 94
4, Взаимодействие с ЕЯМ липосом, содержащих грамицидин А 106
5. Сопоставление полученных результатов с литературными данными 110
Заключение 116
Основные результаты и выводы 120
Литература 122
- Слияние мембран при экзоцитозе
- Материалы и методы формирования ШМ и получения липосом
- Зависимости от концентрации липосом
- Влияние липосом на необратимость
Введение к работе
Эволюция современной биологии неразрывно связана с использованием представлений и методов других наук, которое роадает самостоятельные научные дисциплины. Примером такой дисциплины является биоэлектрохимия, возникновение которой было обусловлено необходимостью исследования механизмов биологических процессов, в основе которых лежат электрохимические закономерности. Помимо таких традиционных уже направлений биоэлектрохимии, как изучение механизмов дыхания, фотосинтеза, генерации нервного импульса, рецепции, к настоящему времени оформились и другие, одним из которых стало изучение мембранных взаимодействий. Функции таких взаимодействий в живом организме весьма многообразны. Образование клеточных контактов в тканях А,2/, оплодотворение /3,4/, формирование мышечных волокон / 5 /, воспалительные / 6 / и некоторые другие процессы / 7 / протекают через взаимодействие клеточных (плазматических) мембран. Взаимодействие внутриклеточных везикул с плазматической мембраной играет важнейшую роль в химической передаче нервного импульса /8 - II/, в секреции гормонов и пищеварительных ферментов ДО - 12/, наконец, в регуляции состава самой плазматической мембраны /II - 13/. Патологические изменения в клетках и тканях при некоторых вирусных заболеваниях или при развитии опухолей также могут быть связаны с взаимодействием мембран /14/.
Известно несколько типов взаимодействий /1,2/: обмен компонентами мембран, клеточная адгезия, слияние. Наиболее интенсивно исследуется слияние; это объясняется не только огромной биологической значимостью процессов, включающих этот способ взаимодействия, но и широкими перспективами, которые открывает слияние мембран в искусственных условиях для решения многих практических задач клеточной биологии, иммунологии, генетики /14,15/.
В последнее время стало очевидно, что важную роль в слиянии биологических мембран играет взаимодействие двойных электрических слоев, существующих на границах мембраны с окружающими её растворами Д6Д7/; это особенно наглядно иллюстрируют работы по электростимулируемому слиянию мембран различных типов (напр., /18/). Кроме того, появились основания полагать, что во многих случаях слияние биологических мембран включает взаимодействие их чисто липидных участков ДІД9/. Эти выводы стимулируют применение электрохимических методов для исследования слияния и других форм взаимодействия на искусственных фосфолипидных мембранах. Такие мембраны могут быть сферическими (лнпосомы) или плоскими (бислойные липидные мембраны или ЕПМ) /20,21/; их можно рассматривать как модели биологических мембран, содержащие только липидный матрикс, без белковых компонентов и надмем-бранных структур. С методической точки зрения использование модельных мембран имеет ряд преимуществ - состав, структуру, оптические, механические, электрические и другие свойства таких мембран легко контролировать; в случае плоских бислоев для изучения доступны обе поверхности мембраны; такие мембраны гораздо более стабильны в искусственных условиях, что существенно повышает воспроизводимость результатов.
Целью настоящей работы является исследование взаимодействия и реализация слияния липосом с плоскими бислоями на основе использования электрохимического (потенциодинамического) метода. Взаимодействие мембран в такой системе интересно как близкий аналог взаимодействия внутриклеточной везикулы с плазматической мембраной; кроме того, слияние этих мембран может быть использовано как способ реконструкции функциональных систем биомембран на плоском бислое.
Работа состоит из трех глав и заключения. Глава I (обзор литературы) посвящена анализу результатов исследований слияния биологических и модельных фосфолипидных мембран. Рассматривая слияние биологических мембран в естественных физиологических процессах, мы уделили основное внимание результатам электронно-микроскопического изучения изменении морфологии мембран в процессе слияния, а также базирующимся на них гипотезам о механизме слияния; именно этот круг работ дает основу для оценки роли липидного матрикса в слиянии биологических мембран и имеет поэтому первостепенное значение для исследований механизма слияния на чисто липидных модельных мембранах.
Обсуждая далее общие проблемы в изучении слияния на некоторых модельных и полумодельных системах, мы сосредоточились на вопросе о достоверности факта слияния. Это связано с тем, что слияние мембран в таких системах, как правило, недоступно непосредственному наблюдению, и регистрируются только его следствия: изменения формы, состава, проводимости, емкости и других характеристик мембран. Поскольку в реальных условиях наблюдаемое изменение характеристик всегда является результатом комплекса различных взаимодействий, основная трудность состоит в том, чтобы экспериментально выделить слияние из совокупности протекающих процессов. Успех в решении такой задачи зависит прежде всего от того, насколько хорошо изучены различные формы взаимодействия, то-есть, в какой мере выяснен механизм взаимодействия мембран. В то же время, анализ литературы по взаимодействию липосом или мембранных везикул с плоскими бислоями показывает, что сведения о различных формах взаимодействия здесь весьма ограничены, и в то же время, остро стоит вопрос об адекватности методов регистрации слияния.
В настоящей работе мы исследовали механизм взаимодействия липосом с плоскими бислоями и на этой основе осуществили их слияние. Для этого впервые был применен один из электрохимических методов изучения строения двойного электрического слоя, а именно, потенциодинамическии метод, модифицированный с учетом особенностей лишщной мембраны. Изложение принципов применения потенщодинамического метода для исследования взаимодействия липосом с ЕШ дано в главе П.
В главе Ш приведены результаты экспериментов; в §§ I - 4 включено также обоснование постановки ряда опытов и обсуждение некоторых результатов, необходимое для понимания логики нашего исследования. В §5 полученные нами результаты сопоставляются с литературными данными.
В Заключении кратко суммированы основные итоги настоящей работы и указаны возможности их практического использования. Здесь дана также оценка эффективности потенциодинамического метода как инструмента для изучения взаимодействия мембран.
Слияние мембран при экзоцитозе
Экзопитоз есть конечная стадия процессов секреции, на которой происходит выделение секрета в экстраклеточную среду путем слияния секреторной гранулы с клеточной мембраной (см.например, /ЗІ/). В организме млекопитающих механизм слияния этих мембран изучается в процессах химической передачи нервного импульса (освобождение медиатора) /8,9,Ы/, а также секреции гормонов, ферментов и других веществ экзокриннымии эндокриннымижелезами ДО,II/ и клетками системы иммунной защиты /33/. Представляют интерес также исследования экзоцитоза при оплодотворении /3,4/, в простейших организмах /12,34/ и зооспорах /35/. Стимулом к слиянию может быть электрически или химически индуцированная деполяризация клеточной мембраны /3,8,9,11,36/, воздействие на неё извне гормона /2,11/ или антигена /33/. Б некоторых случаях /3,12/ природа стимула неизвестна. Интересно отметить, что один из перечисленных стимулов участвует в совершенно различных физиологических процессах. Это деполяризация мембраны, вызывающая: а) освобождение медиатора из синаптичес кого окончания нервной клетки, что обеспечивает передачу сигнала между нервными клетками, или между нервом и мышцей; б) секрецию катехоламинов, АТФ и белка из клеток коры надпочечников; катехоламины в организме действуют одновременно как гормоны, регулирующие деятельность внутренних органов, и как нейромеди-аторы, передающие сигнал между нервными клетками / 8 / и в)слияние половых клеток и секрецию ферментов из кортикоидных гранул яйцеклетки / 3 /. С другой стороны, естественно предположить, что если существует единый механизм слияния биомембран, то его звенья нужно искать среди факторов не специфических, но характерных для процессов слияния различной природы. Таким образом, деполяризацию мембраны следует рассматривать как возможное звено в последовательности событии, составляющих единый механизм слияния.
С этой точки зрения не лишено вероятности, что среди различных последствий воздействия на клетку гормона или антигена есть и деполяризация клеточной мембраны, которая и вызывает собственно слияние гранулярной и клеточной мембран в процессе секреции. Характерной чертой процессов экзоцитоза является тот факт, что для освобождения секрета под воздействием стимула необходимо увеличение концентрации Са + в цитоплазме. Увеличение концентрации внутриклеточного Са + происходит путем входа его извне через Са -каналы /9,34/, освобождения из связанного состояния в клеточной мембране /2,11,31/ или выхода в цитоплазму из внутриклеточных органелл /2,3,9/. Са + вызывает экзоцитоз самостоятельно /3,9,11/ или в сочетании с цАМФ /2,31/. Известно, что присутствие Са + необходимо для слияния мембран как при других биологических процессах (слияние мио-бластов / 5 /, слияние макрофагов при воспалении тканей / 6 /), так и во многих случаях при химически - /23/ или вирус - инду -цированном /22/ слиянии клеток іґ) Vit 10 , а также при слиянии искусственных фосфолипидных мембран /24,29/. Поэтому можно, вероятно, согласиться с Гинджеллом и Гинсбергом Д7/, которые считают ионы кальция универсальным фактором слияния. Рассматривая процесс слияния биологических объектов в самом общем виде, можно выделить четыре его основные стадии; применительно к экзоцитозу они выглядят следующим образом /35,38/ (рис.1): 1.
Сближение секреторной гранулы с плазматической мембраной. 2. Образование контакта между мембраной гранулы и плазма-леммой. 3. Собственно слияние мембран. 4. Выход содержимого гранулы в экстраклеточную среду и смешение компонентов обеих мембран. Отметим здесь принципиальное различие слияния мембран как объектов в целом и стадии 3 в этом процессе, на которой происходит образование канала (поры), соединяющего их внутренние объемы. Это различие мы стремились подчеркнуть на рис.1, выделив стадию образования канала и изобразив её возможные механизмы в нижней части рисунка. Механизмы образования канала (то есть, собственно слияния мембран) можно разделить на три группы (А-В), в зависимости от способа решения центрального вопроса о роли лшшдов и белков в процессе слияния (см,также /39/. Основополагающими для каждой из этих групп являются данные электронной микроскопии об изменениях морфологии мембран при экзоцитозе. А. Дипидные механизмы базируются на результатах электронно-микроскопических исследований экзоцитоза методом замораживания скалывания в тучных клетках /40-42/, околоушной железе /11,19/, нейрогипофизе Д9,43/, В-клетках островков Лангерганса /44,45/, - -а также на тонких срезах в тучных клетках /Л/ и при акросом-ной реакции у позвоночных /4,19/. Анализ микрофотографий тонких срезов в тучных клетках позволил Паладе /46/ предположить,что слияние происходит в результате образования плотного контакта обеих мембран и постепенного вытеснения мембранных слоев из области контакта с образованием сначала пенталаминарной, а затем триламинарной структуры, называемой также диафрагмой. Применение метода замораживания - скалывания с предварительной химической фиксацией образца позволило выявить новые детали в процессе слияния. Исследования на тучных клетках /40-42/, а также в ряде других систем /19/ показали, что в области контакта секреторных гранул с плазматической мембраной происходит резкое уменьшение концентрации интрамембранных частиц(ИМЧХ
Поскольку считается Д9/і что ИМЧ представляют на криофрактограмме мембранные белки или белоксодержащие компоненты, отсюда следует, что слияние мембран происходит по чисто липидным участкам бислоев. Линейные размеры таких участков колеблются от 0,1 до 0,4 мк и следовательно, область контакта охватывает большое число липид-ных молекул. На зооспорах было показано также /35/, что на ранних стадиях экзоцитоза контакт липидных бислоев приводит к образованию триламинарной структуры в результате вытеснения цито-плазматических монослоев клеточной и гранулярной мембран. Такая структура была обнаружена и в более поздних работах на миоблас-тах /47/ и клетках корневого чехлика ячменя /37/. Предполагалось Д9,35,37,46,47/, что триламинарная структура является промежуточной стадией слияния липидных бислоев, и её быстрый коллапс х/ приводит к выходу содержимого гранулы в экстраклеточную среду . Некоторые авторы называют образование триламинарной структуры слиянием, а её коллапс - делением липидных бислоев (напр. 1/0; соответственно, стадия 3 на рисунке I называется не слиянием, а слиянием-делением ( fusion - fission ).
Материалы и методы формирования ШМ и получения липосом
ЕШ формировали из растворов в н-декане следующих липидов: яичного лецитина (ЯЛ) фирмы Koch-Light или Харьковского завода), диолеоиллецитина (ДОЛ, CaCSiochem), фосфатидилэта-ноламина (ФЭ, из E.coCL.Koch-Liqht ) и фосфатидилсерина (ФС, из мозга быка). Использовали ФС фирмы Koch-Li jht , а также хроматографически чистый, любезно предоставленный Э.В.Дятло-вицкой (Институт биоорганической химии им.Шемякина, г.Москва) и В.В.Лысенко (Институт физиологии им.Богомольца, г.Киев). Мембраны получали также из смесей ЯЛ:ФС, Д0Л:ФС, ФЭ:ФС (везде 5% ФС) и ЯЛ: холе стерин (10$ ХОЛ,МетсК ). Формирование ЕПМ проводили по методу Мюллера в прямоугольной тефлоновой ячейке на отверстии 0 I мм в вертикальной перегородке, разделяющей два буферных раствора (2 мМ КСб +5 мМтрыс-Сб, рН = 7,6) объемом по 10 мл.
Контроль за формированием БШ проводился по изменению емкости мембраны, а также визуально через бинокулярный микроскоп МБС-2. Величина удельной емкости определялась по величине емкостного тока при малой амплитуде напряжения (+ 30 мв); при этом вторым членом в уравнении (2а) можно пренебречь, и тогда Ст= —= . . образование ЕПМ из нанесенной на отверстие капли липидного раствора занимало обычно не более 5-Ю мин. В большинстве опытов начальная разность гидростатических давлений компенсировалась введением буферного раствора с соответствующей стороны BUM; момент компенсации определялся по мини-мальному значению емкости, которое составляло 0,22 0,34 мкф/см , Эксперимент начинали через 10-15 мин после полного почернения мембраны.
Для приготовления липосом использовали раствор ФС в хлороформе или в бензоле. Растворитель выпаривали под вакуумом на роторном испарителе, затем липид суспендировался в буферном растворе. Многослойные липосомы получали встряхиванием взвеси липида до получения однородной суспензии. Концентрация липида в суспензии составляла от 2 до 20 мг/мл. Однослойные липосомн получали озвучиванием суспензии многослойных липосом на ультразвуковом генераторе УЗДН-І (частота 22 кГц, ток 700 ма) во льду периодами по 30 сек с интервалами 30-60 сек; озвучивание проводилось до прояснения суспензии (обычно 1,5-2 мин). По данным электронной микроскопии диаметр многослойных липосом составлял 0,5-2 мкм, что согласуется с литературными даннымио /173/; диаметр однослойных липосом составлял 250-500 А.для получения липосом, содержащих грамицидин А, спиртовой раствор антибиотика вводили в раствор ФС в неполярном растворителе. Из этой смеси готовили липосомы как описано выше.
Для выяснения степени прочности связи с БПМ заряженных ли-пидов или липосом, а также для удаления тест-ионов (см. I) проводили перфузию ci$ - или txan$ -отделения ячейки буферным раствором. Система для перфузии изображена на рис.6 б. Два стеклянных шприца объемом по 100 мл закреплялись по одной оси. Их поршни жестко соединялись между собой так, что раствор одновременно выталкивался из одного шприца и засасывался в другой. Шприцы соединялись с перфузионными вводами в ячейке и с емкостями для чистого и использованного буферов через трехходовые краны. Перфузионные вводы представляли собой те-флоновые стержни с внутренней полостью. Вблизи нижнего конца перфузии (б), а - изменение разности граничных потенциалов ЕШ из ЯЯ:ФС при введении с одной из сторон ОД мМ Са2+ или 0,3 мМ Ыу 2+. Концентрация ФС и ЕЛМ изменяется в интервале 0-15 вес %; 6 - система для перфузии. 1,1 - стеклянные шприцы; 2,2 -трехходовые краны; 3 - перфузионные вводы; 4 - пластинка из оргстекла; 5 - ячейка; 6,6 - емкости для набора и сброса буферного раствора. каждого стержня в боковой стенке находилось отверстие (0 2 мм), соединявшее внутреннюю полость с раствором в ячейке. Стержни жестко укреплялись на пластинке из оргстекла, в которой были сделаны прорези для электродов и отверстие для ввода в раствор веществ микропипеткой. Пластинка привинчивалась к ячейке сверху после заполнения её буферным раствором. Для большей эффективности обмена раствора перфузионные вводы укреплялись так, чтобы их нижние отверстия были направлены в противоположные стороны.
После двух-трехкратной полной перфузии на отверстии в ячейке формировали мембрану и снова проводили 1-2 пробные перфузии; в процессе перфузии отрабатывались условия, необходимые для минимизации колебаний емкости. Измерения электрических параметров мембраны в процессе перфузии оказались невозможными из-за сильных помех, для проведения измерений до и после перфузии необходимо было экранировать всю перфузионную систему металлической сеткой, а также использовать дополнительные зажимы, обеспечивающие полное прекращение контакта через воду между ячейкой и шприцами. Время полной перфузии составляло от 7 до 20 минут, в зависимости от стабильности мембраны.
В ряде опытов ЕЛМ была отделена от раствора в ci$ -отделении фильтром (Сынпор, 0 0,23 мкм). Фильтр плотно приклеивался пленкой ( PazafiCm ) к тефлоновой перегородке в области отверстия перед заполнением ячейки буферным раствором. При этом было существенно, чтобы между отверстием и фильтром могла образовываться прослойка раствора, так как в противном случае мем х Полной перфузией мы называем обмен раствора в ячейке, соответствующий разнице объемов между двумя крайними положениями поршня в одном из шприцов С 80 мл).
Зависимости от концентрации липосом
Типичное изменение Дг$ при последовательном введении липосом с одной стороны БЙМ показано на рис.II. Увеличение концентрации липосом с ci$ -стороны от 3 10 3 до 3 10мг/мл приводит к увеличению &% до некоторого максимального значения д ах, которое зависит от состава БПМ и составляет для бислоев из ЯП, ФЭ, ЯП : ФС и ФС, соответственно, 80-85,QQ, 35 и 10 мв (рис.12). В интервале 3 10 - 3 10 мг/мл д fc aX не изменяется. При последующем введении липосом с 1 ал$-стороны БПМ наблюда ется подобное же изменение A f$ , причем д fcax = Д ,тх. Таким образом, липосомы независимо взаимодействуют с каждой из сторон БПМ. Этот факт с учетом того обстоятельства, что при С 0 = const заметно уменьшается уже при наличии 5% ФС в БПМ по сравнению с нейтральными бислоями, свидетельствует о том, что при взаимодействии липосом с сИ -стороной этих мембран концентрация ФС (т.е. поверхностный заряд) на их tгал$-стороне не увеличился, что согласуется с результатами контроля по тест-иону (рис.8,10), а также с данными Коэна и Моронне для ЕЙМ из Фд /139,140/.
Итак мы можем заключить, что слияние в рассматриваемых условиях не происходит, т.к. заряженные липиды липосом не переходят на tiant -сторону БПМ. В то же время, они присутствуют на cl$ -стороне, о чем говорит появление на этой стороне отрицательного поверхностного потенциала. В зависимости от того, какой из вариантов одностороннего взаимодействия (или их комбинация) имеет место (рис.2), заряженные липиды появляются на сії -стороне только в виде молекул в ci$ -монослое БПМ (варианты А, Э), только в виде липосом (В, без обмена лішидами, иР) или в виде молекул и липосом одновременно (В с обменом липи-дами, и С). При этом as -сторона БПМ может быть плоской (А, ) или может состоять из плоских и выпуклых участков (B,C,F ). В последнем случае неясно, заряд каких участков измеряется - потенциодинамическим методом. Для решения этого вопроса мы из-меряли величину поверхностного потенциала \ при наличии липосом с обеих сторон БПМ из ЯЛ в присутствии нонактина (см. напр./176/). При этом мы исходим из того, что если часть поверхности БПМ не имеет контакта с раствором (например, на участках, где адсорбированы липосомы), то проводимость её в присутствии антибиотика определяется зарядом свободных (то есть - 67 -плоских) участков бислоя, к которым открыт доступ ионов КГ1", образующих комплекс с нонактином. Следовательно, можно судить о вкладе этих участков в измеряемые нами значения Аi$ , сравнивая их с соответствующими значениями ц , определенными по проводимости модифицированной БЛМ. Оказалось, что на БЛМ из ЯЛ для выбранной концентрации липо г4 Л/ сом (Слс= 6 10 мг/мл) значение «$ , полученное с нонактином в серии из 10-ти опытов, совпадает в пределах экспериментальной ошибки со значением , определенным при той же концентрации липосом штенциодинамическим методом ( =д =52- 2мв).
Хорошее согласие наблюдается и с данными Коэна и Мэронне для БЛМ, модифицированной другим антибиотиком - моназомицином/140/. Полученная этими авторами зависимость плотности поверхностного заряда плоского бислоя из ФЭ от концентрации липосом из ФС приведена на рис. 13(кривая I). Мы сравнили ее с такой же зависимостью, полученной нами потенциодинамическим методом для немо-дифицированной БЛМ из того же липида(кривая 2). Значения 6 s , соответствующие величинам Ац , рассчитаны нами по теории Гуи-Чапмена (уравнение (4)). Из рисунка видно, что зависимости близки; небольшое расхождение может быть вызвано различием начальных зарядов плоских мембран. Таким образом, можно сделать авывод, что значение ATJ , измеряемое нами потенцио динамическим методом, определяется плотностью поверхностного заряда плоских участков cii -стороны БЛМ, то есть, концентрацией в них заряженных липидов липосом. Следующий раздел посвящен выяснению пути доставки этих липидов в плоскую мембрану.
Влияние липосом на необратимость
Влияние липосом на необратимость А% легко обнаружить, если провести перфузию в отсутствие липосом на поверхности БЛМ (рис.19). Для этого суспензия Ю вводилась в раствор, отделенный от БЛМ фильтром, непроницаемым для липосом, но проницаемым для мономеров. Как видно из рисунка, в присутствии фильтра перфузия уменьшает Д 1$ до значения, соответствующего фоновой концентрации мономеров: Д7 = 3 - 15 мв (кривая I). Для сравнения приведен результат перфузии при той же Cj1, но в отсутствие фильтра; в этом случае Д7«. при перфузии не из-меняется(кривая 2). Заметное влияние фильтра на изменение Д% при перфузии наблюдалось как на нейтральных, так и на слабо заряженных плоских мембранах. Таким образом, ясно, что необратимость А% обусловлена присутствием липосом. Подобный же результат дает введение сахарозы, которая может воздействовать на адсорбированные липо сомы двумя путями: і 1 1 1 1 1 T к 1 gO 00 120 утщ / чэ oi—о,,, о О—#г&— —У It W х 2. /182/ и 2) вызывая осмотическое сжатие липосом /183/. При этом можно ожидать, что прочность связи липосом с поверхностью ЕПМ уменьшится, и они либо сами уйдут в раствор, либо их можно будет удалить последующей перфузией. Как видно из рис.20, на БЯМ из ЯП как при малых (3 ПГ мг/мл, кривая I), так и при больших (3 10 мг/мл, кривая 2) концентрациях ФС сахароза и последующая перфузия вызывают заметное уменьшение д т$ : от 40 до 3-х мв (кривая I) и от 85 до 10 . :мв (кривая 2), При боль-ших концентрациях ФС (1,2 6 10 мг/мл) требуется обычно 2-3 введения сахарозы для снижения л ( до 3 12 мв. Концентрация сахарозы в ячейке зависит от концентрации ФС. При концентрациях ФС 1,2 - 6 10 "3 МГ/МЛ ДЛЯ изменения А\$ достаточно 8 - 20 мМ сахарозы; при концентрациях ФС в интервале 8 Ш 3-г 60 10 3 мг/мл необходимо уже не менее 30 мМ сахарозы.
Изменения Л ig при введении тест-иона в начале (tec s)1 и в конце опыта ( ttcms ) практически одинаковы: Д Д it ; следовательно, воздействие сахарозы не вызывает перехода липо х В начале опыта стороны БЛМ симметричны, и значения ДТ при введении тест-иона с ci$ - и:.;. ііго/іЗ-стороньї одинаковы. Поэтому в некоторых случаях в силу необходимости или для упрощения опыта тест-ион вводился сначала с сі$ -, а в конце опыта - с ігапї-оторош. В данном случае начальное введение с сі-S -стороны вызвано тем, что в дальнейшем ходе опыта требуется перфузия сій -стороны, а одновременно nejb фузировать і г an -сторону ( и следовательно, удалить тест-ион с ігал5 -стороны), наша система не позволяет (см. Гл.П, 3). липидов на tta/iS-сторону БПМ. Качественно такие же результаты получены на ЕПМ из Я1:ФС (рис.21); здесь, однако, при всех концентрациях ФС для изменения А% достаточно одного введения сахарозы до концентрации 10-15 мМ, что может указывать на меньшую прочность связи адсорбированных липосом с заряженной ЕПМ, чем с нейтральным би-слоем. Итак, описанные здесь опыты показывают, что на поверхности ЕЯМ присутствуют необратимо адсорбированные липосомы, которые не вносят прямого вклада в величину А% , но проявляют себя косвенно, препятствуя свободному выходу мономеров ФС из cl$-- мо но слоя БПМ в раствор. Б отношении механизма взаимодействия в целом, можно далее заключить, что в исследованных нами системах: заряженные липо-сомы-нейтральная (слабозаряженная) БПМ протекают следующие процессы: 1. диффузия молекул липосомальных липидов через . водную фазу и встраивание их в монослой ЕПМ; 2. Адсорбция липосом на поверхности ЕЯМ; при этом не происходит обмена липидами в области контакта мембран.
Адсорбированные липосомы прочно (необратимо) связаны с нейтральной ЕПМ. Б случае слабозаряженной ЕПМ прочность связи меньше, что может объясняться увеличением равновесного расстояния между мембранами при увеличении плотности их поверхностного заряда (см.Д7, 169/). Для реализации слияния в нашей системе особую важность имеет тот факт, что после введения липосом в cts -отделение ячейки как на нейтральной, так и на слабозаряженной БЇЇМ возникает градиент концентрации липосомальных липидов, при котором может происходить их диффузия из cl$ -монослоя в tzan ,
