Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние применения бактериальных препаратов для борьбы с личинками комаров 13
1.1. Особенности экологии личинок комаров 13
1.2. Роль комаров как переносчиков возбудителей болезней на территории России 17
1.3. Характеристика энтомопатогенных бактерий Bacillusthuringiensis 20
1.3.1. Классификация белков Bt 21
1.3.2. Характеристика белков, синтезируемых штаммами Bt 26
1.3.3. Структура Cry - эндотоксинов 26
1.3.4. Характеристика Cyt - эндотоксинов 27
1.3.5. Наличие других токсинов в Bt 28
1.3.6. Вегетативные инсектицидные белки 28
1.4. Штаммы В. thuringiensis, активные по отношению к личинкам комаров 29
1.4.1. Механизм действия 31
1.5. Характеристика энтомопатогенных бактерий Bacillus sphaericus 37
1.5.1. Механизм действия кристаллических токсинов Bsph 40
1.6. Резистентность насекомых к бактериальным препаратам 43
1.7. Клонирование гтов Bt vi Bsph 48
Глава 2. Методика исследований и объем биологическогоx материала , - 20
Глава 3. Биологическая характеристика энтомопатогенных видов и штаммов бактерий 63
3.1. Выделение, характеристика и активность новых штаммов бактерий 63
3.1.1 .Bacillus thuringiensis 63
3.1.2. Создание рекомбинантного штамма 73
3.1.3. Bacillus sphaericus 79
3.1.4. Продолжительность ларвицидного действия споро-кристаллических комплексов бактерий Bti и Bsph в лабораторных условиях 86
3.1.5. Brevibacillus laterosporus 96
Глава 4. Экспериментальное исследование взаимоотношений энтомопатогенных бактерий с простейшими водных экосистем 111
4.1. Инсектицидная характеристика энтомопатогенных бактерий после инкапсуляции их в простейшие 113
4.1.1. Бактерии Bacillus thuringiensis ssp. israelensis 113
4.1.2. Бактерии Bacillus sphaericus 122
4.1.3. Рекомбинантный штамм Methylobacillus flagellatum с клонированным геном синтеза Сгу4В токсического белка Bti... 127
4.1.4. Бактерии Brevibacillus laterosporus 133
4.2. Продолжительность действия бактерий Bti и Bsph после инкапсуляции их инфузорями Tetrahymena pyriformis 138
4.2.1. Продолжительность действия смеси Т. pyriformis+ Bti... 140
4.2.2. Продолжительность действия смеси Т. pyriformis+ Bsph . 145
4.3. Взаимодействие энтомопатогенных бактерий с простейшими в питательных средах для их культивирования 147
4.4. Испытание инкапсулированного споро-кристаллического комплекса Bti в Т. pyriformis в полупроизводственных условиях . 156
Заключение 159
Выводы 164
Практические рекомендации 166
Список литературы 169
- Роль комаров как переносчиков возбудителей болезней на территории России
- Штаммы В. thuringiensis, активные по отношению к личинкам комаров
- Продолжительность действия бактерий Bti и Bsph после инкапсуляции их инфузорями Tetrahymena pyriformis
- Испытание инкапсулированного споро-кристаллического комплекса Bti в Т. pyriformis в полупроизводственных условиях
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ущерб, наносимый кровососущими насекомыми здоровью людей огромен. Они являются массовыми кровососами, а также переносчиками возбудителей ряда болезней. В настоящее время на Земле около 2 млрд. человек живут в эпидемически опасных зонах, где распространены малярия, желтая лихорадка, лихорадка Денге, энцефалиты и другие трансмиссивные болезни, переносчиками возбудителей которых являются кровососущие комары. Существует около 3000 видов комаров, из которых более 100 являются переносчиками возбудителей болезней человека. В России наибольшее эпидемическое значение имеют комары рода Anopheles, т.к. ситуация в последние годы с заболеваемостью малярией значительно осложнилась. Помимо малярии на территории страны зарегистрированы арбовирусные трансмиссивные лихорадки Карельская, Синдбис и Западного Нила, переносчиками которых являются комары pp. CulexnAedes (21,24, 46).
В настоящее время основным средством борьбы с кровососущими насекомыми остаются химические инсектициды, к которым у насекомых достаточно быстро развивается устойчивость, что требует либо повышения дозировок, либо ротации инсектицидов. Не обладая избирательностью действия, химические инсектициды вызывают гибель не целевых, зачастую полезных организмов. Накопление инсектицидов в природных компонентах (воде, почве и др.) делает их экологически опасными. Указанные недостатки обуславливают необходимость поиска новых экологически безопасных методов борьбы с кровососущими насекомыми. Для борьбы с взрослыми комарами альтернативы химическим препаратам до сих пор нет, однако для уничтожения личинок все шире применяют биологические препараты.
Использование бактериальных препаратов против насекомых, имеющих медицинское значение (в первую очередь против комаров и мошек), началось в конце 70 годов XX столетия. Связано это было с открытием бактерий Bacillus thuringiensis ssp. israelensis (Bti). Позднее было показано, что бактерии Bacillus sphaericus (Bsph) также могут быть использованы в качестве средств борьбы с личинками комаров.
Основным преимуществом биологических препаратов при сравнении с химическими является избирательность действия. Препараты на основе Bti используют на протяжении более 20 лет, и за это время не было зафиксировано ни одного случая их отрицательного воздействия на другие организмы. Не отмечено также возникновения у насекомых устойчивости к этим препаратам. Учитывая способность Bti к синтезу 4 типов белковых токсинов, вряд ли возможно прогнозировать появление устойчивости и в дальнейшем. Несколько иная картина выявляется при использовании препаратов, изготовленных на основе Bsph. Сохраняя высокую избирательность действия, определяемую двумя белками, составляющими бинарный токсин, препараты на основе Bsph при длительном применении в некоторых случаях приводят к появлению резистентных популяций комаров, что было выявлено в Индии, Бразилии, Франции. Тем не менее, отказываться от использования препаратов на основе этой бактерии нецелесообразно, т.к. их перспективность связана с длительным остаточным действием как в водоемах с чистой, так и загрязненной водой. Устойчивость насекомых к препаратам на основе Bsph возможно преодолеть ротацией с Вґ-содержащими препаратами и другими ларвицидами.
К недостаткам бактериальных инсектицидов следует отнести относительно непродолжительное остаточное действие. Отсутствие
воспроизводства бактерий Bti в природных условиях диктует необходимость повторных обработок водоёмов. Bsph способна воспроизводиться в окружающей среде на погибших личинках комаров, что делает препараты на их основе в ряде случаев более предпочтительными. Однако, следует отметить более узкий спектр инсектицидного действия Bsph, что не позволяет примененять их для борьбы с комарами p. Aedes и вынуждает увеличивать дозировки для воздействия на личинок p. Anopheles.
По экспертным оценкам в дальнейшем доля биологических препаратов для борьбы с кровососущими комарами должна увеличиваться за счет совершенствования препаративных форм, снижения стоимости и разработки рациональной тактики их применения (84, 85, 169, 189, 288). Приведённые соображения подтверждают актуальность проведенных исследований.
Цель и задачи исследования. Поиск и отбор новых активных видов и штаммов энтомопатогенных бактерий и совершенствование биологического метода борьбы с личинками кровососущих комаров. Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:
• провести отбор новых более эффективных штаммов бактерий Bti и Bsph;
• осуществить поиск бактерий, обладающих ларвицидной активностью, в других таксонономических группах;
• оценить эффективность инсектицидного действия рекомбинатнтного штамма с клонированным геном синтеза ларвицидного токсина;
• выявить факторы, влияющие на сохранение и продолжительность ларвицидного действия Bti и Bsph в водной среде;
• изучить особенности взаимодействия энтомопатогенных бактерий с простейшими в водных экосистемах;
• создать биологическую систему, обеспечивающую длительное сохранение ларвицидных свойств энтомопатогенных бактерий.
Научная новизна результатов исследования. В результате проведенных исследований нами впервые:
• Выявлены и охарактеризованы новые штаммы бактерий Bti и Bsph, эффективность которых превышает известные ранее штаммы.
• Создан рекомбинанатный штамм Methylobacilhis flagellatum с клонированным геном синтеза Сгу4В токсического белка Bti, эффективный по отношению к личинкам малярийных комаров.
• Выделены 4 кристаллообразующих штамма Brevibacillus laterosporus, обладающих высокой ларвицидной активностью.
•- Определены факторы, влияющие на сохранение и продолжительность ларвицидного действия Bti и Bsph. Установлена значительная устойчивость споро-кристаллической смеси Bti в водной среде (24 недели).
• Охарактеризованы параметры пролонгирования действия энтомопатогенных бактерий в водной среде. Сроки действия Bti зависят от исходной концентрации споро-кристаллического комплекса и численности личинок комаров.
• Показано, что простейшие Т. pyriformis и Е. .moshkovskii потенциируют основные ларвицидные свойства энтомопатогенных бактерий Bti, Bsph, В. laterosporus и рекомбинантного штамма М. flagellatum (снижение эффективных концентраций и увеличение скорости действия).
• Выявлены различия в характере взаимоотношений простейших с разными видами энтомопатогенных бактерий при длительном контакте.
• Разработана методология создания симбиотической системы Г. pyriformis+ Bti, позволяющая без дополнительного введения бактерий поддерживать их активность на протяжении длительного времени (72 недели срок наблюдений).
Практическая ценность работы. Результаты исследований вносят вклад в решение важной медико-биологической проблемы - контроль численности комаров (переносчиков возбудителей инфекционных болезней) эффективными и экологически безопасными средствами. Значимость работы для практического использования заключается в следующем:
• Получены новые эффективные штаммы бактерий Bti и Bsph, пригодные для промышленного производства.
• Выделенные кристаллообразующие штаммы В. laterosporus могут быть использованы в качестве альтернативы биологическим ларвицидам, изготовленным на основе Bti и Bsph.
• Доказана возможность пролонгирования действия при инкапсуляции споро-кристаллического комплекса Bti в инфузории T.pyriformis. Однократное введение этого комплекса в условия изолированных природных водоемов обеспечивает гибель личинок комаров p.Anopheles на протяжении сезона потенциальной передачи малярии (10 недель).
• Предложена симбиотическая система «инфузории Т. pyriformis + бактерии Bti», сохраняющая ларвицидные свойства бактерий в течение 72 недель (срок наблюдений).
Материалы диссертации были использованы в педагогической работе на курсах, организованных ВОЗ для стран Европейского региона «Малярия и борьба с ней» (Москва, 2002г.) и для специалистов центров Госсанэпиднадзора Москвы и Московской области (2001-2002гг.), на курсах по систематике, морфологии, биологии, экологии переносчиков малярии Средней Азии и методам борьбы с ними (республика Таджикистан, г. Душанбе, 2004), а также на курсах усовершенствования для эпидемиологов, энтомологов ЦГСЭН на медико-профилактическом факультете ППОТОУ ММА им. И.М.Сеченова (2000-2004гг.)
Внедрение результатов исследования в практику. Материалы исследований по диссертации использованы в следующих нормативно-методических документах, разработанных с участием автора:
1. СанПин 3.2.1333-03 «Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации». Утверждены Министерством здравоохранения РФ 28.05.03 г. Зарегистрированы в Министерстве Юстиции РФ 09.06.03 №4662
2. Дезинсекция 3.5.2 «Борьба с комарами, выплаживающимися в подвальных помещениях» МУ 3.5.2.705-98. Минздрав России, Москва-1998
3. Профилактика паразитарных заболеваний 3.2. «Малярийные комары и борьба с ними на территории Российской Федерации» МУ 3.2.974—00. Минздрав России, Москва-2000.
4. Дезинсекция 3.5.2. Методы определения эффективности
инсектицидов, акарицидов, регуляторов развития и репеллентов, используемых в медицинской дезинсекции. МУК 3.5.2. - 1759-03
5. Методические указания «Эпиднадзор за паразитарными болезнями». МУК 3.2.1756-03
6. Получены патенты на изобретение:
• «Штамм бактерий Bacillus sphaericus, предназначенный для получения препарата, активного против комаров» Патент № 2080066, 1997
• «Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var.israelensis , предназначенный для получения препарата, активного против личинок комаров». Патент на изобретение № 2122791, 1998
7. Штаммы депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.
Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены и обсуждены со специалистами на чтениях, посвященных 60-летию кафедры медицинской энтомологии в РМАПО (1996), на Международном генетическом конгрессе в Бирмингеме (Англия, 1993), на рабочей встрече ВОЗ по генетическим изменениям ларвицидных бактерий, используемых для борьбы с переносчиками в Кордобе (Испания, 1996), на 9ой Международной конференции по бациллам в Лозанне (Щвейцария, 1997), на VII Съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997), заседании общества протозоологов (Москва, 1999), на 10он Международной конференции по бациллам в Бавено (Италия, 1999), на ежегодном координационном совещании (Annual Coordination Workshop US AID CDR/CAR and INTAS European Union, Ben Gurion, Israel, april-may, 1999), Субрегиональном совещании экспертов по проблеме пестицидов из числа стойких органических загрязнителей, интегрированным системахМ защиты растений и контролю сельскохозяйственных вредителей и переносчиков инфекционных заболеваний (Санкт-Петербург, 2000 г), на конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2002), в отделе биохимии Кембриджеского Университета (Англия, 2003), на Бюро отделения профилактической медицины РАМН (Москва, 2003), на Ученом Совете ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского ММА им. И.М.Сеченова, на коллоквиумах отдела медицинской энтомологии.
Диссертация апробирована на заседании Специализированной комиссии по предварительной экспертизе диссертаций в ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского ГОУ ММА им. И.М.Сеченова (протокол №77 от 18 ноября 2003 г.).
Публикации по теме работы. Результаты диссертации отражены в 26 печатных работах (из них 6 в зарубежных изданиях), 1 СанПиНе, 4 методических указаниях, 2 патентах.
Положения, выносимые на защиту.
1. Направленный поиск природных видов и штаммов энтомопатогенных бактерий, выделение генов токсинообразования, получение рекомбинантных штаммов - продуцентов биологических инсектицидов, перспективных для промышленного производства, позволяют расширить возможности, повысить эффективность биологического метода борьбы с переносчиками возбудителей болезней и кровососущими насекомыми. Изучение выделенных нами штаммов Brevibacillus laterosporus доказало способность некоторых штаммов продуцировать кристаллы, обладающие инсектицидной активностью, что делает этот вид потенциальным кандидатом для биологической борьбы с кровососущими комарами. В результате проведения комплексных исследований по выделению и изучению природных бактериальных изолятов, получению генов токсинообразования и создания рекомбинантного штамма Methylobacillus flagellatam с клонированным геном синтеза Сгу4В токсического белка Bti предложены новые, обладающие инсектицидной активностью штаммы Bacillus thuringiensis var.israelensis 1-5 и Л2 и штамм Bacillus sphaericus 16 - S25, включенные во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов, перспективных продуцентов биологических инсектицидов для борьбы с двукрылыми насекомыми.
2. Продолжительность действия биологических препаратов зависит от влияния ряда биотических и абиотических факторов. При этом выраженность воздействия одних и тех же факторов на различные биологические агенты существенно отличается. Сроки действия Bti и Bsph значительно варьируют в присутствии погибших личинок комаров и при увеличении исходной концентрации споро-кристаллической смеси. Наличие первого условия более важно для Bsph , а второго - для Bti.
Воздействие даже слабого неионизирующего излучения (микроволн и магнитных полей) приводит к снижению эффективности биологических препаратов. Поэтому антропогенные источники таких излучений могут опосредованно влиять на эффективность биологической борьбы с насекомыми.
3. Контакт простейших и энтомопатогенных бактерий потенциирует ларвицидные свойства последних. Обнаруженный феномен имеет универсальный характер образования симбиотической системы. При кратковременном контакте простейшие (Tetrahymena pyriformis и Entamoeba moshkovskii) увеличивают основные ларвицидные свойства энтомопатогенных бактерий Bti, Bsph, В. laterosporus и рекомбинантного штамма М. flagellatum (снижение эффективных концентраций и увеличение скорости действия). При длительном контакте инфузории Т. pyriformis пролонгируют инсектицидное действие бактерий Bti. Смесь Т. pyriformis и Bti в условиях изолированных природных водоемов на личинках малярийных комаров первой генерации обеспечила их отсутствие на протяжении сезона потенциальной передачи малярии (2 месяца). Взаимодействие Т. pyriformis и Bti в питательной среде позволило без дополнительного введения бактерий поддерживать активность симбиотической системы на протяжении длительного времени -72 недели (срок наблюдений).
Роль комаров как переносчиков возбудителей болезней на территории России
Для России наибольшее эпидемическое значение имеют комары р. Anopheles, так как ситуация в последние годы с заболеваемостью малярией значительно осложнилась. Проблема борьбы с малярией остаётся актуальной для многих стран мира. После успехов, достигнутых в 1950-1960 годы прошлого века по снижению заболеваемости в странах Азии, Америки, Европы, Австралии, наблюдается постепенный, но неуклонный возврат малярии на многие освобождённые от этой болезни территории. Маляриологическая ситуация на территории Российской Федерации в начале 1990-х годов была благополучной. После распада СССР в новых независимых государствах - Азербайджане и Таджикистане зарегистрирован рост заболеваемости трёхдневной малярией в результате передачи местными переносчиками, что привело к крупным эпидемиям на фоне экономического кризиса. Эпидемические вспышки малярии были зарегистрированы в Армении, Грузии, Киргизии, Узбекистане и Туркменистане. Активизация миграции населения (коммерсанты, сезонные рабочие, беженцы и вынужденные переселенцы) резко увеличила завоз трёхдневной малярии в Россию. Тенденция роста завозных и вторичных от завозных случаев сохранилась и в последующие годы: в 2000 г. зарегистрировано 800 больных и 31 паразитоноситель, среди которых 43 вторичных от завозных в 16 административных территориях; в 2001 г. - 898 больных и 9 паразитоносителей, из которых 134 - вторичные от завозных в 17 административных территориях (94 - в Москве и Московской области) (5). Из арбовирусных инфекций значительное количество заболеваний, возбудителей которых переносят комары, регистрируют в тропических и субтропических регионах.
В России зарегистрированы (21,24,43,46): Лихорадка карельская - болезнь впервые выявлена в Карелии в период вспышки, охватившей более 200 человек. Болели преимущественно сельские жители в летнее время в период активности комаров. Возбудителя передают комары p. Aedes и Culex. Лихорадка Синдбис — заболевания людей впервые выявлены осенью 1981 года в Карелии, а также в Финляндии (под названием болезнь Погоста) и Швеции (болезнь Окельбо). Отмечаются спорадические заболевания и небольшие вспышки. Болели преимущественно сельские жители в летнее время в период активности комаров. Возбудителя передают комары p. Aedes и Culex. Лихорадка Западного Нила - зоонозная арбовирусная природно-антропургическая (комариная) инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя. Болезнь эндемична во многих странах Азии, Европы (Средиземноморье, острова Бакинского архипелага в Каспийском море), в Африке. Регистрируются спорадические случаи и эпидемические вспышки. В 1999-2001 гг. отмечались вспышки этого заболевания на юге России: в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях. Возбудителя переносят комары p. Culex.
Снижение объёма противокомариных мероприятий, в связи с ликвидацией малярии в России, привело к повсеместному увеличению численности малярийных комаров. Возникла необходимость возобновления применения инсектицидных препаратов не только для обработки очагов болезни, но и в профилактических целях снижения численности переносчиков. Широкое и частое применение инсектицидов из разных химических групп (хлорорганические соединения, фосфорорганические соединения, карбаматы, пиретроиды) в течение многих лет привело к загрязнению внешней среды, возникновению резистентных популяций переносчика к этим группам соединений. Комитет экспертов ВОЗ в 1995 году (35) указывал на наличие резистентности к ДДТ у 55 видов Anopheles, к препаратам ФОС - у 31 вида, к другим соединениям у 20 видов, в основном, у популяций, обитающих в южных и юго-восточных регионах. Резистентность зарегистрирована у комаров p. Culex и Aedes. В настоящее время химические инсектициды рекомендуют для обработки помещений в целях уничтожения имаго эндофильных видов комаров. Применение ларвицидов остается важным компонентом противомалярийных программ. Использование ларвицидов позволяет подорвать численность популяции переносчика на начальном этапе его развития. После отказа от применения хлорорганических соединений (ДДТ), в качестве ларвицидов было рекомендовано использовать препараты группы ФОС (темефос, метатион, малатион) и регуляторы развития (метопрен, сумиларв, димилин).
Широкомасштабные исследовательские работы, предпринятые в ряде стран, по поиску биологических агентов привели к открытию высокопатогенной для личинок комаров бактерии Bacillus thuringiensis ssp. israelensis (186). Специфичность энтомопатогенного действия этих бактерий, безопасность для других организмов, находящихся в водоемах, отсутствие резистентности поставили Bacillus thuringiensis ssp. israelensis вне конкуренции по сравнению с имеющимися ларвицидами. Позже были выделены высокотоксичные штаммы Bacillus sphaericus. На основе обеих бактерий были разработаны препаративные формы (порошки, брикеты, таблетки и др.), предназначенные для обработки водоемов разных типов.
Штаммы В. thuringiensis, активные по отношению к личинкам комаров
Токсическое действие препаратов, изготовленных на основе Bti, проявляется по отношению к личинкам комаров из родов Aedes (93, 94, 313, 320), Culex (72, 167, 205) , Anopheles (26, 76,186, 244, 407), Culiseta (273), Psorophora (273), Coquillettidia (115). Личинки мошек сем. Simuliidae также оказались чувствительными к Bti. Через 5 лет после открытия препараты, изготовленные на основе бактерий Bti, стали использовать в онхоцеркозной программе в Западной Африке, поддерживаемой Всемирным Банком и Всемирной Организацией Здравоохранения. Борьба с личинками мошек Simulium damnosum проводится на территории 11 стран общей площадью 1 235 000 км (56, 264). Bti играет уникальную роль в этой программе и препараты на ее основе широко используют наряду с химическими инсектицидами: ежегодное потребление биологического препарата составляет 300 000 литров (89, 262, 264,411). Высокая эффективность препаратов на основе Bti была показана в разных странах: Индии (75, 78), Бангладеш (72), Малайзии (115), Кот-де-Вуар (202), Израиле (252) , Полинезии (261) , США (269, 272), Франции (228), Испании (207), Турции (61), Германии (86, 88, 92), Польше (393). Применяют препараты на основе Bti во многих противокомариных программах, как альтернативу химическим ларвицидам. Например, в Китае обработки против основного переносчика Anopheles sinensis привели к значительному снижению малярийного индекса (407).
Препараты на основе Bti успешно использовали в Кении, Индонезии, Перу, Эквадоре против личинок Anopheles gambiae, An. nigerrimus, An. sundaicus и An. albimanus (84, 89, 251). В Европейских странах бактериальными препаратами обрабатывают водоёмы, заселённые, в основном личинками p. Aedes и Culex. Интенсивная борьба с комарами проводится в туристических центрах (309, 328,393,418). Используются бактериальные препараты в форме смачивающихся порошков (146, 271, 272, 274), пасты (82) , ледяных гранул (86), гранул и брикетов (60, 76, 309, 364), таблеток (87, 90, 356). В России, нарабатываемые бактериальные препараты на основе Bti, используют, в основном, по эпидемиологическим показаниям для борьбы с личинками малярийных комаров. Площадь обрабатываемых водоёмов составляет 20000 га. Мощности нарабатывающих предприятий достаточно для производства необходимого количества препаратов и при увеличении спроса на них (26). Общая площадь ежегодно обрабатываемых водоёмов в странах Европы приведена в табл. 3 (89). Отсутствие токсического действия препаратов Bti на нецелевые гидробионты показано по отношению к беспозвоночным животным, относящимся к различным классам - Oligochaeta (54, 82, 89), Diptera (54, 82, 270), Cmstaceae (54, 177,181), Mollusca (82, 89), Coleoptera (54, 82,89, 96, 181), Lepidoptera (82, 96), Ephemeroptera (82,89,177), Hemiptera (54, 64, 89, 177, 297) Trichoptera (54, 89), Odonata (54, 89). Использование Bti безопасно для человека (290) и позвоночных животных (254, 336, 342, 343, 379).
Препараты на основе Bti воздействуют, помимо комаров и мошек, на некоторые виды личинок хирономид (57, 58, 59, 220). Не все виды хирономид чувствительны к Bti. Например, Chironomus plumosus был чувствителен к Bti, применённым в очень высоких дозах, которые не используют в полевых условиях (226). При использовании рекомендуемых концентраций для борьбы с личинками комаров, гибели хирономид не отмечали. Однако некоторые авторы (320) указывают, что личинки хирономид были чувствительны к препаратам Bti в полевых условиях. Ранее было установлено, что первичной мишенью для токсинов Bti является эпителий кишечника, где в щелочной і среде протеазы кишечника трансформируют протоксин в активный токсин. При этом протоксины Cyt 1Аа, Cry ПА, Cry 4А и Cry 4B расщепляются в активные пептиды 8-эндотоксинов 22-25 кДа, 30-40кДа, 48-49 кДа и 46-48кДа соответственно (125, 135, 316). Под действием этих токсинов эпителиальные клетки кишечника вакуолизируются и лизируются, в результате наступает быстрая смерть личинок. Личинки, обработанные токсинами Bti, через 1 час перестают питаться, через 2 часа уменьшается их активность, крайнее замедленное движение регистрируют через 4 часа и через 6 часов наступает полный паралич (126). Bti токсины обладают наиболее быстрым инсектицидным действием по сравнению с другими штаммами Bt, хотя симптомы, вызываемые Cry и Cyt токсинами Bti подобны тем, которые вызывают и другие штаммы Bt на других насекомых. Иммунохимические пробы показали, что и Cry и Cyt токсины связываются с различными мембранными компонентами кишечника личинки (162), поэтому механизм действия их различен (385,386). Cry-токсины связываются с рецепторами, расположенными на мембране (172, 173, 184). Во многих случаях связывание белка коррелирует с чувствительностью насекомых (370).
Протоксины Сгу4А и Сгу4В при воздействии протеаз кишечника личинок комаров образуют активные токсины с молекулярной массой 48-49 кДа и 46-48 кДа соответственно (67). Специфическая токсичность in vitro зависит от кишечного содержимого разных видов комаров, используемых для активации протоксина. Так, Сгу4В-токсин был активен по отношению к клеткам Ае. aegypti, когда активировался кишечным экстрактом из личинок комаров этого «вида и не проявлял активности к клеткам Ае. aegypti, когда обрабатывался протеазами кишечника личинок p. Culex (67). Белок CryllA расщепляется на два небольших фрагмента около 30 кДа (135). Эксперименты показали связывание данного белка с рецепторными белками 148 кДа личинок An. stephensi (173). Проводятся исследования по определению специфических рецепторов для Cry 4В (16,19). Было показано, что специфическое связывание москитоцидных эндотоксинов Сгу4В и CryllA обеспечивается белковым компонентом (с мол. массой 65 кДа) мембраны эпителия кишечника комаров Ае. aegypti. Интересно, что в отличие от рецепторов, связывающих эндотоксины, специфические для насекомых отряда Lepidoptera, этот белок не обладает аминопептидазной активностью. 27 кДа цитолитический белок CytlAa связывается с мембраной липосом, ненасыщенной фосфолипидами (379). Токсин, взаимодействуя с мембраной, вызывает нарушения фосфолипидных связей, затем возникает гипертрофия, разрушение мембраны и окончательный цитолиз. Инкубация CytlAa с липидами, выделенными из личинок Ae.albopictus, нейтрализовала их активность, в то же время инкубация с мембранами Bacillus megaterium,
Продолжительность действия бактерий Bti и Bsph после инкапсуляции их инфузорями Tetrahymena pyriformis
В экспериментах использовали 4-х дневную культуру инфузорий, которую перед смешиванием с бактериями предварительно отмывали от питательной среды стерильной водой, осаждая клетки центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 минут. Затем суспензировали в 20 мл воды и микроскопически подсчитывали число инфузорий в расчете на 1 мл. Число инфузорий в 1мл во всех опытах составляло 15 х 103 клеток простейших. Было проведено четыре серии экспериментов по изучению взаимоотношений инфузорий с бактериями Bti и Bsph. В первой серии экспериментов выясняли продолжительность инсектицидной активности смеси инфузории с каждой из бактерий. В 20 мл полученной суспензии тетрахимены, которая содержала всего 3 х 105 инфузорий, добавляли в разных опытах от 5x10 до 10 спор Bti и 10 -5x108 Bsph. Инфузории с споро - кристаллическим комплексом бактерий перемешивали в течение 2 часов на качалке и добавляли в опытные сосуды с 1 литром дехлорированной водопроводной воды, таким образом, концентрация инфузорий в опытных сосудах была постоянна (300 особей/мл), а концентрация бактерий колебалась от 5x103 до 10б спор/мл. Затем в сосуды раз в неделю подсаживали по 100 личинок. В девяти опытах использовали личинок Anopheles stephensi, в одном - Anopheles atroparvus. Результаты инсектицидного действия смеси T.pyriformis с Bti оценивали через 24 часа с удалением погибших личинок из опытного сосуда. При использовании Bsph результаты получали через 48 часов и опыты проводили в двух вариантах: 1) погибших личинок удаляли из сосуда через 48 часов; 2) мертвых личинок оставляли в течение всего опыта. Такая схема была выбрана потому, что мёртвые личинки играют решающую роль для увеличения срока действия этой бактерии.
В трёх опытах с Bti и одном с Bsph были перерывы в подсадках личинок в 14 и 19 недель. В этих опытах выясняли каким образом сохраняется активность бактерий и смеси бактерий с инфузориями после временного отсутствия личинок. При этом сосуды оставались в боксах плотно закрытые стеклом. Окончанием токсического действия препарата или смеси считали время, когда гибель личинок была менее 50%. Для выяснения влияния повторных обработок Bti на продолжительность ларвицидного действия как смеси так и чистого штамма был проведен специальный опыт: в один сосуд добавили СКК Bti в концентрации 5x103 спор/мл, а в другой - смесь инфузории с такой же действия в оба сосуда снова добавили такое же количество СКК Bti. В 3 серии был проведен опыт для выяснения возможности поглощения тетрахименой остаточного количества Bti в опытном сосуде. В этом случае в сосуд, где чистый штамм значительно снизил свою активность добавили тетрахимену в количестве 300 особей/мл. К каждому опыту ставился контроль. В сосуд с чистой дехлорированной водой подсаживали личинок с той же периодичностью и в том же количестве как и в опытные сосуды. В последней серии экспериментов изучали влияние обеих бактерий на выживаемость инфузорий. Для этого в 2 пробирки с 20 мл отмытой от питательной среды тетрахимены (3 х 105 особей) добавляли Bti или Bsph в концентрации 5x106 спор/мл. Затем в течение 10 суток отбирали образцы из каждой пробирки и оценивали численность и размеры тетрахимены. В качестве контроля использовали отмытую тетрахимену с такой же плотностью в воде. Изучение продолжительности инсектицидной активности смеси инфузорий с каждой из бактерий выявило различия в характере их взаимоотношений при длительном контакте. Результаты опытов представлены в таблице 34. При использовании низких концентраций Bti 5x103 и 104 спор/мл продолжительность действия смеси по сравнению с чистым штаммом практически не изменилась.
Лишь при использовании Bti в концентрации 105 спор/мл продолжительность действия смеси составила более 5 месяцев, в то время как продолжительность ларвицидной активности чистого штамма, как показано ранее (4) , при непрерывных подсадках личинок не превышает 2-Змесяцев. При наличии значительного перерыва в подсадках личинок продолжительность действия как чистого штамма, так и его смеси с тетрахименой (опыты № 5, 6, 7) оставалась примерно одинаковой (табл. 34).Таким образом только в опыте № 4 было отмечено значительное увеличение продолжительности инсектицидного действия смеси T.pyriformes+ Bti.
Неоднозначность полученных результатов объясняется, по-видимому, разным количеством свободных спор и кристаллов Bti, внесённых в опытные сосуды. Известно, что в результате фагоцитоза пищеварительные вакуоли (фагосомы) T.pyriformis заполняются спорами и кристаллами бактерий. Одна клетка инфузорий несет от 200 до 400 спор и кристаллов. При концентрации 5x10 - 10 спор/мл споры и кристаллы бактерий попадали в сосуды инкапсулированными в тетрахимене. В этих опытах каждая тетрахимена содержала незначительное число спор и кристаллов - 12,5 и 25 соответственно. При более высоких концентрациях в сосуды попадает тетрахимена, целиком заполненная спорами и кристаллами, и свободные споры и кристаллы.
Заполненные пищеварительные вакуоли путем экзоцитоза постепенно удаляются из клеток простейших и через 7 часов в выделенных фагосомах споры Bti начинают прорастать, образуя цепочки вегетативных клеток. Через 27 часов клетки начинают спорулировать, споруляция заканчивается полностью через 42 часа. В большинстве опытов тетрахимена начинала размножаться, активно питаться, захватывая при этом как внесенные, так и вновь образуемые в выделенных фагосомах споры и кристаллы Bti. Концентрация бактерий в опытных сосудах увеличивается. В опыте, где отмечалось самое продолжительное действие Bti в ассоциации с тетрахименой, образовалась устойчивая система, при которой сложились оптимальные условия как для размножения тетрахимены, так и бактерии Bti. При недостаточном количестве спор и кристаллов такой системы не образуется.
Испытание инкапсулированного споро-кристаллического комплекса Bti в Т. pyriformis в полупроизводственных условиях
Опыт в полевых условиях был заложен 21 июня 1996 года. Было подобрано 2 изолированных искусственных водоема, расположенные на территории филиала ботанического сада в г. Москве. Площадь обрабатываемых водоёмов составляла 2.1 м и 1.7 м . Объём воды водоема № 1 составлял 250, второго - 180 литров. После проливных дождей объем воды увеличивался до 305 и 220 литров соответственно. Площадь контрольного водоема составила 9,5 м . Водоёмы с травянистым дном, заросшие лимнеидами (хвощ, осока), элодеидами и нитчатками. Сопутствующая фауна была представлена личинками стрекоз, тритонами, водомерками, многочисленным зоопланктоном, рН воды - 5,8. Температура воздуха в течение проведения эксперимента колебалась от 18-27С, воды 15-21 С. водоёмах численность личинок An. messeae была высокой.
Личинки отмечались на всех стадиях развития, преобладали личинки IV возраста. На рис. 14 и 15 представлена численность личинок в водоёмах до обработки. 1 возраст II возраст III возраст IV возраст куколки Водоём № 1 обрабатывали смесью Bti + T.pyriformis (после 24 часовой совместной инкубации) из расчёта получения в водоёме концентрации Bti 5x104 спор/мл и числа T.pyriformis 150 клеток/мл, водоём №2 - 104 спор/мл Bti и 75 клеток/мл T.pyriformis. Т.к. выше указывалось, что гибель личинок при действии смеси наступает значительно быстрее, то результаты в этих опытах оценивали через 2 и 3 часа, далее через 48 часов, а затем в течение сезона 1 раз в неделю. Через 2 и 48 часов после проведения обработки из верхнего слоя водоемов брали пробы воды для определения титра Bti и числа инфузорий. Результаты опытов. Через 2 часа наблюдений в водоёмах отмечалась 77% и 74% гибель личинок. Но следует отметить, что все оставшиеся живыми личинки были мало подвижными. Через 3 часа личинки в обоих водоёмах полностью погибли. Число куколок осталось без изменений. Через часов в опытных водоёмах не обнаружено ни личинок, ни куколок. Личинки в водоёмах не появились до конца срока наблюдений - 25 августа.
Гибели сопутствующей фауны на протяжении всего срока наблюдений не отмечали. В течение первой недели проведения опыта из опытных водоемов брали пробы для определения концентрации Bti и числа инфузорий. Результаты представлены в таблице 38. Через неделю в водоёме №1 концентрация Bti уменьшилась в 4,5 раза, число инфузорий в 4,8 раза, однако оставалась достаточно высокой, чтобы вызывать гибель личинок I возраста, если они появлялись в водоёмах. Аналогичная картина отмечалась и в водоёме №2. В контрольном водоёме первоначальная численность личинок была невысокой - 41 особь на 1м . Преобладали личинки Ш-ГУвозраста. В последующие дни численность личинок также была невысокой от 30 до 57 особей на 1м , в пробах присутствовали личинки всех возрастов. Полупроизводственные испытания смеси T.pyriformis и Bti в условиях изолированного природного водоема на личинках малярийных комаров первой генерации обеспечили их отсутствие на протяжении сезона потенциальной передачи малярии (10 недель). В результате проведённого направленного поиска нами из природных образцов были выделены штаммы бактерий, проявившие инсектицидную активность по отношению к личинкам различных видов насекомых. На основании иммунологических и биохимических исследований, белкового состава кристаллических включений, спектра инсектицидного действия получено два новых штамма Л2 и 1-5, которые отнесены к Bt, подвиду israelensis. Высокая инсектицидная активность и стабильнось при пересевах в течение 10 лет позволяет рассматривать описанные штаммы в качестве перспективных продуцентов инсектицидов для борьбы с личинками комаров. Штамм Bti 1-5 запатентован и депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов. Выделенный и испытанный нами штамм Bsph 16-S25 высоко эффективен по отношению к личинкам Cx.pipiens и личинкам малярийных комаров An.stephensi и характеризуется относительно высокой способностью к хранению при повышенной температуре.
Данный штамм запатентован и депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов. Нами впервые выделены 4 кристаллообразующих штамма B.laterosporus. Чувствительность личинок комаров An.stephensi и Ae.aegypti к отмытому белку B.laterosporus была высокой: LC50 составляла 3-5 нг/мл. Известно, что у отмытых параспоральных кристаллов Bti LC50 для Ae.aegypti изменялось от 4 до 20 нг/мл, для An.stephensi — от 20 до 60 нг/мл. Следовательно, инсектицидная активность кристаллов B.laterosporus для личинок Ae.aegypti и An.stephensi близка к активности высокотоксичных энтомопатогенных штаммов Bti.
