Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Микробные ассоциации и их клиническая, эпидемиологическая и микробиологическая значимость 11-41
1.1. Роль микробных ассоциаций при ГСИ у больных хирургического и отоларингологического профилей 11-21
1.2. Виды и формы существования сообществ микроорганизмов 21-30
1.3. Эпидемиологические особенности ГСИ смешанной этиологии , 31-41
Глава 2. Материалы и методы 42-53
2.1. Материалы исследования 43-44
2.2. Методы исследования 44-53
2.2.1. Микробиологические методы исследования 44-51
2.2.2. Эпидемиологические методы исследования 51-53
2.2.3. Статистические методы исследования 53
Глава 3. Микробиологические особенности возбу дителей полиэтиологичных гнойно-септических инфекций 54-87
3.1. Характеристика микробного пейзажа при инфекциях смешанной этиологии у пациентов хирургического и отоларингологического профиля 54-66
3.2. Оценка антибиотикорезистентности выделенных культур 66-87
Глава 4. Изучениние межбактериальных взаимоотношений штаммов в микробном сооб ществе 88-97
4.1. Выявление ассоциаций со сцепленными ассоциантами..88 - 90
4.2. Изучение экологического сродства 90-94
4.3. Исследование явления антагонизма между микроорганизмами при сокультивировании 94-97
Глава 5. Эпидемиологические характеристики полиэтиологичных гнойно-септических инфекций по результатам проспективного наблюдения
5.1. Эпидемиологические особенности полиэтиологичных инфекций у пациентов хирургического и оториноларин- гологического профилей 98-117
5.2. Характеристика госпитальных ассоциаций и их циркуляции по результатам проспективного наблюдения 117-130
5.3. Параметры микробиологического мониторинга 131 - 133
Обсуждение результатов исследования 134-151
Выводы 152-153
Практические рекомендации 154
Список литературы 155-188
Приложения
- Виды и формы существования сообществ микроорганизмов
- Микробиологические методы исследования
- Оценка антибиотикорезистентности выделенных культур
- Исследование явления антагонизма между микроорганизмами при сокультивировании
Введение к работе
Актуальность темы
Проблема гнойно-септических инфекций (ГСИ) сохраняет свою актуальность, несмотря на позитивные сдвиги в борьбе с инфекционными заболеваниями (Стручков В.И., 1991, Яковлев СВ., 1999, Сидоренко СВ., 2001., Покровский В.И., 2001, Сёмина НА, 2002, Шкарин В.В., 2002, Меньшиков Д.Д., 2003). Гнойно-септические инфекции, в том числе внутрибольничного характера, составляют в некоторых хирургических и ЛОР учреждениях от 7 до 30 случаев на 100 пациентов.
При эпидемиологическом надзоре за ГСИ обычно недостаточно учитывается тот факт, что их характер может бьпь не только моно-, но и поли-этиологичным, т.е. в инфекционном процессе могут участвовать одновременно несколько возбудителей, так называемые микробные ассоциации.
Доля микробных ассоциаций в этиологии ГСИ составляет от 12 до 96% случаев среди различных ГСИ человека (Кулешов Е.В., 1996, Честною Т.В., 1999, Costerton J.W., 2000, Helset Г., 2001, Зубков М.Н., 2001, Талыпин-ский AM., 2001, Митрохин С.Д., 2002, Илюкевич Г.В., 2003). Ассоциации микроорганизмов в гнойном очаге могут включать до 14 видов микроорганизмов (Свегухин AM., 1999, ПальцынАА, 2000, СубороваТ.Н., 2002). Ряд авторов сообщают о более тяжёлом течении микст-инфекций (Вельский В.В., 1999, Ермоленко СВ., 2000, Гавриленко В.Г., 2001,) Современные научные исследования в этой области показывают, что между бактериями в сообществах существуют контакты различных типов, которые способствуют лучшей адаптации ассоциантов в воспалительных очагах, а также потен-циированию их патогенных свойств (Tetz V. V., 1999, Costerton J.W., 2000, WatnickP.,2000,).
Однако, в настоящее время практически отсутствуют данные о биологических свойствах и антибиотикорезистентности микроорганизмов, входящих в состав микробного сообщества, вызывающего ГСИ, их качественных и количественных характеристиках, межбактериальных взаимоотношениях. Не изучены особенности эпидемиологического процесса полиэтиологичных инфекций.
Таким образом, высокая частота полимикробных (смешанных, микст) инфекций, более тяжёлое клиническое течение, возможность совместного патогенного действия микробного сообщества, наряду с недостаточной изученностью микробиологических и эпидемиологических аспектов полиэтиологичных ГСИ, указывают на актуальность данной проблемы.
Цель исследования:
Изучение микробиологических и эпидемиологических особенностей полиэтиологичных гнойно-септических инфекций у пациентов хирургического и оториноларингологического профиля и разработка основ микробиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за госпитальными инфекциями.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИІЛНОТЕКА |
Задачи исследования:
Определить особенности возбудителей полиэтиологичных инфекций у хирургических и ЛОР пациентов: структуру, состав микробных ассоциаций, количественные и качественные характеристики ассоциантов.
Исследовать особенности межмикробных взаимоотношений в ассоциациях при смешанных инфекциях.
Изучить эпидемиологические особенности полиэтиологичных гнойно-септических инфекций сравнительно с моноэтиологичными инфекциями у пациентов хирургического и отоларингологического профилей.
Определить возможность внутрибольничного инфицирования пациентов сложившимися микробными ассоциациями, существование госпитальных ассоциаций и их циркуляцию на основе результатов проспективного наблюдения и микробиологического мониторинга.
Обосновать и разработать подходы к организации микробиологического мониторинга в хирургическом и ЛОР отделениях и методов анализа и оценки его результатов.
Научная новизна
Впервые на основе комплексного и углублённого исследования определены свойства микробных ассоциаций - возбудителей ГСИ у пациентов хирургических и отоларингологических отделений, включая видовую структуру возбудителей, спектр сочетаний микроорганизмов, фенотипы резистентности к антибиотикам, особенности межпопуляционных взаимодействий бактерий.
Впервые предложен коэффициент ассоциативности микроорганизмов как критерий степени их участия в смешанных сообществах и проведена его оценка у различных видов бактерий, выделенных при ГСИ у пациентов обоих профилей.
Впервые дана эпидемиологическая характеристика ГСИ полиэтиоло-гичной природы в хирургическом и ЛОР отделениях с определением уровня, структуры, динамики заболеваемости, выявления групп и факторов риска.
Впервые установлено существование госпитальных микробных ассоциаций, дано их описание, определены клинико-эпидемиологические характеристики обусловленных ими ГГСИ, выявлены особенности их циркуляции в хирургическом отделении.
Практическая значимость
Определена роль микробных ассоциаций в гнойно-септической патологии пациентов хирургических и отоларингологических отделений, изучены их свойства и особенности вызываемых ими ГСИ.
Обоснована необходимость и разработаны основы микробиологического мониторинга за полиэтиологичными ГСИ с учетом их особенностей в хирургическом и ЛОР отделениях в системе эпидемиологического надзора за госпитальными инфекциями.
Изучены свойства госпитальных микробных ассоциаций, позволяющие осуществлять их выявление и учет, анализ сложившейся эпидемиологиче-
ской ситуации и проводить адекватные лечебные и противоэпидемические мероприятия.
Внедрение в практику
Разработано и внедрено в практику информационно-методическое письмо «№1020» (утверждено ГОУ ВПО «НижГМА Минздрава России» от 7.10.2004г.)
Микробиологический мониторинг за полиэтиологичными инфекциями, внедрен в практическую работу бактериологической лаборатории МЛПУ «Клиническая инфекционная больница №2» и в работу лечебно-профилактических учреждений одного из районов города (Акт внедрения от 22.09.2004, №188)
Полученные данные используются в учебном процессе кафедры эпидемиологии ГОУ ВПО «НижГМА Минздрава России» и кафедры профилактической медицины ЦПК и ППС, при чтении лекций студентам, клиническим ординаторам, интернам, а также включены в программу работы постоянно действующей школы-семинара госпитального эпидемиолога ЛПУ Нижегородской области.
Положения, выносимые на защиту
Микробные ассоциации, выделенные при ГСП хирургических и ЛОР пациентов, характеризуются широким спектром микроорганизмов, разнообразными компонентными профилями и количественными характеристиками, особыми межбактериальными взаимодействиями, различным комбинационным составом ассоциаций, включая эпидемиологически и клинически значимые полирезистентные возбудители.
Полиэтиологичные ГСИ характеризуются значительным уровнем заболеваемости и высокой долей в структуре всех ГСИ, обладают микробиологическими и эпидемиологическими особенностями, отличающимися от моноэтиологичных инфекций и имеющие различия у пациентов хирургического и отоларингологического профилей.
Микробные ассоциации могут носить госпитальный характер, обусловливая внугрибольничное инфицирование пациентов, отличаются от негоспитальных микробных сообществ и способны к циркуляции в условиях стационара.
Апробация работы
Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании Проблемной комиссии по эпидемиологии, микробиологии и инфекционным болезням ГОУ ВПО «НижГМА Минздрава России» (2.09.2004).
Материалы диссертации доложены:
- на 4 Европейском конгрессе по химиотерапии и инфекциям во Франции
Париж, 4-7 мая 2002 г.
- на III - ем Международном медицинском форуме: «XXI век: новые и ста
рые инфекции» Г.Н.Новгород, 13-16 марта 2002 г
на 3-ей Российской конференции с международным участием «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики внутриболыгич-ных инфекций» - Санкт-Петербург, 18-19 сентября 2003 г.
на внутрибольничных конференциях МЛПУ «Клиническая инфекционная больница №2», «Городская больница №35»
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объём диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов иссле
дования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выво
дов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Список
литературы содержит 3 і О источников, из них/б / отечественных и^ ино
странных. Диссертация изложена на страницах, включает -fO рисунка,
таблиц.
Виды и формы существования сообществ микроорганизмов
В результате роста и жизнедеятельности бактерии могут формировать следующие структуры: изолированные колонии, бактериальный газон, ко-лониеподобные сообщества, биоплёнку. Эти структуры могут быть образованы как монокультурой, так и смешанным микробным сообществом (CMC) [138].
Достаточно хорошо изучена ультраструктура колоний CMC. Основание сообщества представлено клетками одного из микробов, и только они имеют непосредственный контакт с агаром. Верхушка сообщества образована клетками преимущественно второго микроорганизма. Бактерии у основания колонии формируют «языки», которые могут тянуться до самого верха, то есть имеются зоны совместного роста, между разными микроорганизмами отмечены контакты типа «плотного слипания» [138]. Предполагается наличие общих генетических программ у членов сообщества, контролирующих процесс их формирования и регуляцию жизни в таких условиях. То есть это — универсальная устойчивая форма микробного сообщества (23, 58, 103, 202, 260, 299, 307).
Формируя любые типы сообществ, бактерии создают дополнительные барьеры между клетками и внешней средой [137, 197, 265, 274]. В отличие от изолированно живущих клеток, бактерии внутри сообщества приобретают новые свойства [266, 293, 307]. Между клетками образуются контакты, через которые, как предполагается, могут передаваться некоторые молекулы. Разные типы контактов у изученных грамположительных и грамотрицательных бактерий формируются во всех плоскостях, образуя объёмную систему соединённых между собой клеток [138, 205]. Подобная «система» объединённых бактерий лучше приспособлена к быстрому реагированию в ответ на различные раздражители, чем такое же количество независимых изолированных клеток [17, 202].
Известно, что перенос генетической информации возможен между разными видами бактерий [17, 215, 259, 260, 285]. В.В.Тец и соавторы описали уникальный перенос генов между неродственными микроорганизмами [138], например: между грамотрицательными кишечными палочками и грамполо-жительными микрококками. В результате такого обмена образовались пиг-ментообразующие штаммы кишечной палочки и антибиотикоустойчивые микрококки. Авторы этих исследований не наблюдали в смешанном микробном сообществе передачи признака антибиотикоустойчивости между кишечной палочкой и золотистым стафилококком. Авторы описывают ещё одно интересное наблюдение: все штаммы из сообщества после рассева образуют колонии большего размера. То есть, после рекультивирования бактерии из CMC более активно развиваются и становятся более адаптированными к имеющимся условиям.
Исследования свойств бактерий в CMC указывают на существенное снижение их чувствительности к различным неблагоприятным факторам внешней среды, что связывают с наличием массивного матрикса, окружающего микроколонии. Показано, что выживаемость возрастает в течение 48 часов и в результате для кишечной палочки и стафилококка вне сообщества и внутри него выживаемость может различаться в сотни тысяч раз [138, 297]. Отмечается возможность выживания микробов CMC в присутствии бактерицидных доз препаратов, определённых классическими методами на изолированных бактериях. Этот факт имеет большое практическое медицинское значение, так как при разработке новых1 лекарственных и дезинфекционных средств, подбора их лечебных и дезинфицирующих доз требуется учёт существования CMC и биоплёнки как в объектах окружающей среды, так и в живом организме. В последние годы объектом большого интереса и интенсивного изучения стала так называемая биоплёнка (Евроконференция «Microorganismes ге-sponsables des infections nosocomials», 2000, Франция) [209]. Биоплёнка состоит из структур, образованных бактериями одного или чаще разных видов и объединённых самопроизводящимся полимерным матриксом [138, 197, 200,264,266, 273,276, 282, 307] Ряд исследователей утверждает, что многочисленные хронические инфекции не подвластны антибиотикам за счёт развития биоплёнки и перси-стенции бактерий в ней [185, 200, 224, 225, 292, 307]. Так, по данным Американского центра по контролю за заболеваемостью (CDC) 65 % бактериальных и грибковых хронических инфекций, которые лечатся врачами в развитых странах, относятся к хроническим биоплёночным инфекциям [199, 200, 300]. В 70-х годах прошлого века было доказано, что бактерии в биоплёнках существуют, и что основным компонентом бактериальной массы являются «оседлые», стационарные бактерии. И лишь в 80-90 годах при использовании современной «лёгкой» микроскопии и сканирующей техники было выявлено, что микроорганизмы в биоплёнке могут находиться в 2-х принципиально различных состояниях: стационарные «оседлые» клетки в составе самой биоплёнки - 99, 9% и в планктоническом, т.е. свободном состоянии - 0, 01% микробных клеток [279].
Биоплёночные инфекции могут вызываться отдельными видами бактерий, либо двумя и более, то есть смешанным сообществом бактерий, либо грибами. Подавляющее большинство входящих в биоплёнку микроорганизмов, находящихся в покоящемся состоянии, не размножаются [118, 200]. По не совсем понятным на сегодняшний день причинам в отдельных участках биоплёнки периодически возникают очаги пролиферации и «выброс» в ткани или в кровоток планктонных форм микроорганизмов, которые выходят из биоплёнок и поражают окружающие их ткани, вызывая воспалительную реакцию [106, 118, 199] Таким образом, функционирование биоплёнки может стать причиной распространения инфекции [200].
Планктонические бактерии могут адгезироваться на различных видах поверхностей: и живых, и не живых, чаще влажных, могут соединяться с многочисленными партнёрами и образовывать новую биоплёнку - защитную структуру жизнедеятельности [200, 300].
Микробиологические методы исследования
Микробиологическое обследование пациентов проводилось в рамках микробиологического мониторинга, являющегося одним из основных пара 45 метров информационного обеспечения в эпидемиологическом надзоре и представляющий из себя динамичную систему слежения за выделяющейся микрофлорой и её оценку [32, 94, 154, 155]. Микробиологический мониторинг включал в себя: 1. ведение карт динамического наблюдения, в которые вносилась вся информация о больном (результаты клинических наблюдений, проспективного анализа, бактериологических исследований). 2. анализ этиологической структуры возбудителей хирургического и ЛОР отделения. 3. анализ всей популяции выделенных возбудителей 4. выявление повторяющихся ассоциаций 5. сравнение характеристик культур в динамике за определённый промежуток времени в разных отделениях.
Забор материала, доставка и выделение культур. Первые этапы исследования осуществлялись согласно регламентированной отечественной методической литературы [90, 92]. Весь гнойный патологический материал от больных исследовался количественным методом. ,. -,-Для получения смывной жидкости и приготовления разведений использовался прибор «Vortex» (Германия). Первичный посев и выделение чистых культур микроорганизмов проводился общепринятым методом.
Видовую идентификацию культур проводили согласно определителю бактерий Берджи [93]. При видовой идентификации стафилококков, энтеро-бактерий, неферментирующих грамотрицательных бактерий, энтерококков, грибов рода Candida, Corynebacterium spp. и других использовался набор стандартных биохимических тестов. Методы внутривидового типирования. Различные виды типирования штаммов - возбудителей внутрибольнич-ных инфекций являются важнейшей частью лабораторного исследования при эпидемиологическом анализе госпитальных инфекций, сутью которых является выявление близкородственных изолятов [150]. 1. Определение чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам (антибиотикам). Постановку тестов и интерпретацию результатов проводили согласно Приказу № 250 [89], международным стандартам микробиологического исследования NCCLS [270], рекомендациям Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ), комитета антибиограмм французского общества микробиологов CA-SFM [195]. Исследование проводили диско-диффузионным методом на среде Мюл-лер-Хинтон и АГВ с использованием дисков Biomerieux, Sanofi Diagnostics Pasteur, Bio — Rad (Франция); Hi Media (Индия) и отечественных. Всего 37 наименований антибиотиков. Для стафилококков использовался набор дисков из 16 антибиотиков: бензилпенициллин, ампициллин, канамицин, нетилмицин, тобрамицин, гентамицин, амикацин, доксициклин, эритромицин, линкомицин, рифампи-цин, фузидин, цефалотин (цефазолин), пефлоксацин, ванкомицин. Для энтеробактерий применялся набор дисков из 23 антибиотиков: ампициллин, карбенициллин, амоксиклав, канамицин, гентамицин, тобрамицин, нетилмицин, амикацин, доксициклин, рифампицин, цефуроксим, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим, цефпиром, левомицетин, полимик-син, налидиксовая кислота, норфлоксацин, пефлоксацин, офлоксацин, ци-профлоксацин, меропенем. Для неферментирующих грамотрицательных бактерий-, в том числе P.aeruginosa, использовался набор дисков из 18 антибиотиков: карбенициллин, азлоциллин, тикарциллин, канамицин, гентамицин, амикацин, тобрамицин, нетилмицин, неомицин, рифампицин, полимиксин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, норфлоксацин, цефперазон, цефтацидим, цефпиром, меропенем. Для энтерококков мы применяли набор дисков из 14 антибиотиков: ампициллин, гентамицин (нагрузка 120 мкг), стрептомицин (нагрузка 300 мкг), тетрациклин, доксициклин, эритромицин, линкомицин, левомице 47 тин, рифампицин, ристомицин, ванкомицин, ципрфлоксацин, офлоксацин, меропенем. Для Corynebacterium spp. использовался набор дисков из 12 антибиотиков: бензилпенициллин, оксациллин, ампициллин, канамицин, гентамицин, тетрациклин, доксициклин, эритромицин, линкомицин, цефалотин, пефлок-сацин. 2. Определение резистентности стафилококков к метициллину (окса циллину). Выявление MR проводили методом скрининга согласно Методических рекомендаций А.В. Дехнича [33]. Для этого использовали агар Мюллер-Хинтона с добавлением 4% NaCI и 6 мг/л оксациллина. Бактериальную взвесь стафилококка готовили по стандарту мутности равного 0,5 по Мак Фарланду (1,5 10 8 КОЕ / мл). Стандартную суспензию, разведённую в 100 раз, наносили на поверхность агара с оксациллином. Штаммы S.aureus инкубировали при t 35 С в течение 24 часов, а КНС - в течение 48 часов. Появление видимого роста более 1 колонии на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину. 3. Выявление р лактамаз расширенного спектра действия (БЛРС) гра мотрицательных бактерий. Наличия БЛРС энтеробактерий определяли по Методическим рекомендациям [31]. В работе использован метод «двойных дисков», представляющий вариант классического диско-диффузионного метода определения чувствительности и позволяющего по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с цефалоспорином III или IV поколения напротив диска, содержащего клавулановую кислоту, обнаружить продукцию БЛРС. Взвесь бактериальных клеток, соответствующую мутности 0,5 по Мак Фарланду наносили на поверхность агара Мюллер-Хинтона. Диски с антибиотиками: цефтазидим (цефотаксим /цефтриаксон) - (30 мкг), цефпиром (30 мкг), амок-сициллин / клавуланат (20 /10 мкг) накладывали на подсохшую поверхность среды.
Оценка антибиотикорезистентности выделенных культур
В ходе микробиологического мониторинга был изучен удельный вес полирезистентных штаммов у пациентов хирургического и ЛОР отделения по годам (рис.1). У пациентов хирургического профиля за трёхлетний период наблюдался рост доли полирезистентных штаммов. В этом отделении темп (Т) среднемноголетнего прироста доли полирезистентных штаммов равен 8,2%. Т. е., имелась выраженная тенденция к росту.
В то же время у пациентов ЛОР отделения наблюдалась обратная выраженная тенденция снижения доли полирезистентных штаммов (Т = -11,3%). Причем, у хирургических пациентов доля этих штаммов была значительной в течение всех трёх наблюдаемых лет и выросла с 53,9%) в 1999 до 64% в 2001, т.е. на 10,1%. Среди культур ЛОР отделения снижение числа полирезистентных штаммов составило с 1999 по 2001 год 10,3%). Т.е., имелась разнонаправленная тенденция равной активности в хирургическом и ЛОР отделениях. В целом, отмечается преобладание полирезистентных культур среди возбудителей инфекции в хирургическом отделении и так же достаточно высокие цифры доли полирезистентных культур по ЛОР отделению. Причём, если в 1999 году доля полирезистентных штаммов была примерно одинакова по отделениям, то в 2000 и 2001 гг. доля полирезисте-нитных штаммов у хирургических пациентов была более значительной, по сравнению с ЛОР отделением, а разница высоко достоверной.
В ходе исследования был изучен удельный вес полирезистентных штаммов, входящих в состав микробных ассоциаций и монокультур. За период 1999 - 2001г. у пациентов хирургического профиля наблюдалась однонаправленная тенденция роста доли полирезистентных штаммов в обеих категориях: как среди ассоциантов (Т = 9%), так и среди монокультур (Т = 39,7%) (рис.2). Заметен значительно более выраженный темп роста удельного веса полирезистентных монокультур, который в 2001 практически сравнялся с удельным весом ассоциаций. В то же время у пациентов ЛОР отделения наблюдалась обратная тенденция снижения числа полирезистентных штаммов как среди ассоциантов, так и среди монокультур (рис. 3). Темп прироста доли полирезистентных штаммов (Т) в составе микробных ассоциаций составил -11,4%, что является выраженной тенденцией к снижению. В составе монокультур тенденция прироста доли полирезистентных штаммов вообще отсутствовала (Т = 0,1%). Наше исследование показало, что во все наблюдаемые годы и по обоим отделениям доля полирезистентных штаммов среди ассоциантов была всегда выше, чем среди монокультур (среднемноголетний показатель 64,7±8,4% и 49,1±6,2% соответственно). Доля полирезистентных штаммов в группах пациентов с ГСИ и ГГСИ Анализируя удельный вес полирезистентных штаммов в группах ГСИ и ГГСИ выявлено, что среди хирургических пациентов их доля составила 55,4±14,8% и 71,7±10,8% соответственно (р 0,05), среди ЛОР пациентов 45,9±11,8% и 61,6±17,2% соответственно (р 0,05). Период с 1999 по 2001 год характеризовался отсутствием тенденции к росту доли полирезистентных штаммов среди пациентов с ГСИ (Т = - 3,1%) (рис.4). Для второй группы пациентов с ГГСИ характерна другая тенденция, выражающаяся в значительном увеличении доли полирезистентных штаммов с 54,3% в 1999 году до 82,9% в 2001 году, что является выраженной тенденцией к росту (Т = 19,9%). Оценка изменения удельного веса полирезистентных штаммов в хирургическом и ЛОР отделениях по 3 годам не может дать полного представ ления о многолетней динамике, однако за этот период можно проследить колебания и тенденцию к росту или снижению этого показателя. Анализируя удельный вес полирезистентных штаммов среди пациентов ЛОР отделения с ГТСИ и ГСИ выявлено, что во все изучаемые годы число полирезистентных штаммов было значительно выше у пациентов с ГТСИ, особенно велика разница в 2000 году (рис,5). Так же, как снижение общего числа полирезистентных штаммов в целом по ЛОР отделению, прослеживается и тенденция снижения полирезистентных штаммов в обеих группах пациентов, хотя не везде равномерная. Для группы пациентов с ГСИ в ЛОР отделении темп прироста доли полирезистентных штаммов составляет Т = - 16,8% , что является выраженной тенденцией к снижению. То же самое можно отметить и по второй группе пациентов с ГГСИ, где Т прироста составляет - 7,9% и тенденцией к снижению, хотя и не такой активной. Т. о. общая тенденция к снижению резистентности штаммов ЛОР отделе ния формируется (обусловлена) обеими группами пациентов, и особенно значительно группой с ГСИ.
В обобщении можно сказать, что тенденция роста доли полирезистентных штаммов по хирургическому отделению обусловлена ростом доли полирезистентных монокультур, из которых в дальнейшем могут формироваться ассоциации, и за счёт ассоциантов из группы пациентов с ГГСИ. Общая тенденция снижения доли полирезистентных штаммов по ЛОР отделению происходила за счёт выраженного темпа снижения числа полирезистентных ассоциантов (возможно, за счёт активного распада ассоциаций) и за счёт выраженного темпа снижения полирезистентных ассоциантов с ГСИ. Фенотипы резистентности штаммов, выделенных из ассоциаций Учитывая общий высокий уровень резистентности микроорганизмов за наблюдаемый период, в ходе мониторинга были определены и изучены фенотипы резистентности наиболее значимых штаммов - ассоциантов в отношении отдельных групп антибактериальных препаратов: Р-лактамным антибиотикам (БЛА) , аминогликозидам (АГ), макролидам (М), фторхиноло-нам (ФХ), карбапенемам (КАРБ) и другим антибиотикам; составлены полные формулы фенотипа резистентности выделенных культур, а так же представлены наиболее часто встречающиеся комбинации фенотипов. При составлении полных формул фенотипов резистентности использовались данные по основным фенотипам резистентности бактерий, предложенные Французским Обществом Микробиологов (FSM) - Communique 2003 du Comite de rantibiogramme. Полирезистентными считали культуры, резистентные к 5 и более АБ группам, исключая природную резистентность.
Исследование явления антагонизма между микроорганизмами при сокультивировании
Методом отсроченного антагонизма «in vitro» были изучены взаимоотношения между 154 штаммами различных ассоциаций, полученными от пациентов хирургического профиля (Табл. 29) и 171 штаммом - от пациентов ЛОР профиля . В обеих группах хирургического и ЛОР профилей присутствовали все виды основных межмикробных взаимоотношений, рассматриваемых нами при анализе. Это свидетельствует о достаточно интенсивных взаимодействиях между членами ассоциаций в целом. В ассоциациях,-полученных от хирургических пациентов синергидные взаимоотношения между ассоциантами оказались в равных пропорциях в ГСИ и ГГСИ группах (по 28,3% и 28,8% соответственно) и это достоверно выше, чем такие же показатели по ЛОР отделению (3,5% и 5,3% сответст-венно) (р 0,001; р 0,001). Индифферентных (нейтральных) отношений не сколько больше было в группе пациентов с ГТСИ, по сравнению с пациентами с ГСИ. Выявлена значительно большая выраженность антагонистических отношений между микроорганизмами в группе пациентов с ГСИ, что составило 11,3%, по сравнению с группой ГГСИ - 2,9%.
Различия видов межмикробных взаимоотношений оказались ещё более существенны у микроорганизмов, выделенных от пациентов ЛОР отделения (Табл. 30). В отличие от пациентов хирургического профиля, у них более значительна доля антагонистических отношений в группе с ГСИ -18,6%, чем в группе с ГГСИ -3,5%. Более существенно выражены нейтральные отношения в группе пациентов с ГГСИ- 91,2%, по сравнению с группой ГСИ -77,9%. При анализе взаимного влияния симбионтов, выделенных от пациентов хирургического профиля, наблюдалось изменение зоны гемолиза, в частности его ослабление (однократные наблюдения у пар): P.aeruginosa уменьшал зону гемолиза у КНС и Proteus spp, КНС у C.freundii, E.faecalis у P.aeruginosa и S.aureus, Candida spp. у Staphylococcus spp., E.faecalis гем (-) у E.faecalis гем (+), Micrococcus spp. у S.aureus, P.mirabilis у P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae у MRSE. Наблюдалось усиление выработки пигмента P. aeruginosa после совместного роста с S. liquefaciens, с S. aureus. При наблюдении за симбионтами, выделенными от пациентов ЛОР отделения, было отмечено приобретение К. pneumoniae жёлтого пигмента при совместном росте с S.maltophilia; C.freundii приобретал перламутровый оттенок (пигмент) после культивирования с P.aeruginosa.
Визуальная оценка слизеобразования ассоциантов При работе с культурами от пациентов с затяжными инфекциями, не поддающимися лечению, при первичном посеве на плотных питательных средах выделялись штаммы с повышенным слизеобразованием. Обычно умеренное слизеобразование характерно для микроорганизмов, имеющих капсулу, таких как Klebsiella spp., Pneumococcus spp. и др. Колонии с повышенным слизеобразованием представляли из себя крупные, бесформенные, прозрачные или матовые, иногда с пигментом, слизистые капли, часто сливающиеся между собой. При дальнейшей идентификации выявлялась принадлежность культур к видам: E.coli (2 штамма), Klebsiella spp. (1 штамм), P.aeruginosa (2 штамма), выделенные от пациентов хирургического профиля. Обычно эти виды бактерий дают умеренный слизистый рост на плотных питательных средах в обычных условиях. Повышенное слизеобразование выявлено при первых генерациях микроорганизмов, изолированных из патологического очага, а также у ряда культур Staphylococcus spp. при выращивании их биомассы на специальных целлофановых мембранах для исследования спектров экстрацеллюлярных белков. Известно, что микрокапсула у S.aureus наиболее хорошо выявляется после обработки гомогенной антисывороткой, а так же в условиях экспериментальной инфекции. Капсульные варианты стафилококков наиболее часто выделяются от больных [156]. Капсулы, микрокапсулы и внеклеточная слизь бактерий построены из полисахаридов, участвующих во внутри- и межпопуляционных взаимодействиях бактерий [156]. Удельный вес штаммов стафилококков с повышенным слизеобразованием у пациентов хирургического профиля составил 20,5%, а у пациентов ЛОР профиля составил 19,5%. Способность к слизеобразованию была более выраженной у КНС и составила 23,4%, у S.aureus - 15,2% по обоим отделениям вместе. Возможно, описанные свойства штаммов являются фенотипическим проявлением принадлежности бактерий к биоплёночным вариантам микроорганизмов и имеют отношение к хронизации процессов у тех пациентов, у которых они были изолированы. Электронная микроскопия смешанного микробного сообщества Выполнена микроскопия смешанного микробного сообщества. На примере микробной ассоциации - E.coli u S.aureus (приложение 12) показано наличие контактов типа «плотного слипания» между грамотрицательными палочками и грамположительными кокками, свидетельствующее о тесных взаимоотношениях между разнородовыми культурами. Анализируя весь комплекс характеристик микробных ассоциаций можно констатировать: 1. возможный сцепленный характер ассоциантов и повышенный удельный вес таких ассоциаций в структуре пациентов с ГГСИ. 2. разнонаправленную тенденцию роста за трёхлетний период в хирургическом и снижения в ЛОР отделениях доли сцепленных ассоциаций в группе с ГГСИ, совпадающую с таковой тенденцией роста и снижения полирезистентных штаммов в этих отделениях. 3. высокая способность к сосуществованию в ассоциациях с другими микроорганизмами для наиболее эпидемиологически значимых микроорганизмов в периоды подъёма заболеваемости полиэтиологичными инфекциями. 4. существенно превалирующий удельный вес ассоциаций с нейтральными и синергичными взаимоотношениями в группах с ГГСИ пациентов обоих профилей над антагонистическими взаимоотношениями. 5. способность к повышенному слизеобразованию у микроорганизмов, а так же учёт высокой полирезистентности изучаемых штаммов, дают возможность прогнозировать возможный биоплёночный характер изучаемых инфекций полиэтиологичной природы с участием госпитальных штаммов.
В результате трёхлетнего проспективного наблюдения и микробиологического мониторинга установлен уровень заболеваемости гнойно-септическими инфекциями у пациентов хирургического и ЛОР отделений. Среднемноголетний показатель заболеваемости ГСИ составил 3,9±0,8 на 100 пациентов хирургического и 6,7±1,2 на 100 пациентов ЛОР профиля. Среднемноголетний показатель заболеваемости полиэтиологичными инфекциями составил 1,6±0,5 на 100 пациентов хирургического и 3,1 ±0,8 (р 0,05) на 100 пациентов ЛОР отделения. Удельный вес полиэтиологичных инфекций среди всех гнойно-септических инфекций в хирургическом отделении равен 41%, в ЛОР -46,3%.
