Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Писарев Дмитрий Иванович

Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого
<
Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Писарев Дмитрий Иванович. Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого : диссертация ... кандидата фармацевтических наук : 15.00.02 / Писарев Дмитрий Иванович; [Место защиты: ГОУВПО "Пятигорская государственная фармацевтическая академия"].- Пятигорск, 2005.- 146 с.: ил.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 11

1.1. Современное состояние исследований в области систематики, химии и фармакологии рода Juniperus L 11

1.1.1. Ботанические сведения о растениях рода можжевельник - Juniperus L. семейства кипарисовых - Cupressaceae Bartl 11

1.1.2. Химический состав представителей рода Juniperus L 16

1.1.3. Применение растений рода Juniperus L. в научной и народной медицине 19

1.2. Методы выделения и исследования эфирных масел 25

1.2.1. Методы выделения эфирных масел 25

1.2.2. Методы исследования эфирных масел 27

ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ 35

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 36

2.1. Объекты исследования 36

2.2. Биологические методы исследования 38

2.3. Методы обнаружения и идентификации биологически активных веществ 39

2.3.1. Качественные реакции 39

2.3.2. Газо-жидкостная хроматография и хромато-масс-спектрометрия .. 40

2.3.3. Бумажная хроматография 42

2.3.4. Тонкослойная хроматография 43

2.3.5. УФ-спектроскопия 44

2.3.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография 44

2.3.7 Атомно-абсорбционная спектрография 45

2.4. Методы количественного анализа 45

2.4.1. Весо-объёмный метод 45

2.4.2. Гравиметрия 45

2.4.3. Спектрофотометрия 45

2.4.4. Титриметрия 46

2.5. Технологические методы 46

2.5.1 Определение технологических характеристик сырья 46

2.5.2. Оценка качества и определение микробиологической чистоты 47

2.6. Фармакологические методы 47

2.6.1. Изучение острой токсичности 47

2.6.2. Изучение диуретической активности 48

ГЛАВА 3. Ресурсные исследования изучаемых растений 50

3.1. Изучение ресурсных возможностей м. длиннохвойного и м. казацкого 50

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3 57

ГЛАВА 4. Изучение биологически активных веществ объектов исследования 58

4.1. Изучение эфирных масел м. длиннохвойного 58

4.1Л Выделение и идентификация эфирных масел 58

4.1.2. Количественное определение эфирных масел 68

4.2. Изучение смолистых веществ м. длиннохвойного 69

4.2.1. Идентификация смолистых веществ 69

4.2.2. Количественное определение смолистых веществ 76

4.3. Изучение лигнанов м. длиннохвойного и м. казацкого 76

4.4. Изучение кумаринов и флавоноидов м. длиннохвойного и м. казацкого 82

4.4.1. Выделение кумаринов и флавоноидов 82

4.4.2. Идентификация кумаринов 85

4.4.3. Идентификация флавоноидов 85

4.4.4. Количественное определение флавоноидов 90

4.5. Изучение катехинов м. длиннохвойного 92

4.6. Изучение дубильных веществ м. длиннохвойного 93

4.7. Изучение органических кислотм. длиннохвойного 94

4.8. Изучение моно- и полисахаридов м. длиннохвойного 96

4.8.1. Изучение моносахаридов 96

4.8.2. Изучение полисахаридов 97

4.8.2.1 Выделение полисахаридов 97

4.8.2.2 Изучение состава полисахаридов 98

4.9. Изучение аминокислот м. длиннохвойного 98

4.10. Изучение элементного состава м. длиннохвойного 99

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4 101

ГЛАВА 5. Разработка фармакопейной статьи «можжевельника плоды - juniperifructus» 103

5.1. Внешние признаки 103

5.2. Микроскопические признаки 104

5.3. Качественные реакции 109

5.4. Числовые показатели сырья 111

5.5. Микробиологическая чистота сырья 113

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5 114

ГЛАВА 6. Разработка, анализ и фармакологические ис пытания экстракта из плодов можжевельника

6.1. Разработка и анализ жидкого экстракта из плодов можжевельни ка 115

6.1.1. Определение технологических характеристик сырья, используемого для изготовления экстракта 115

6.1.2. Определение коэффициента съема готовой продукции и расчёт эффективности процесса экстракции

6.1.3. Технология экстракта из плодов можжевельника 121

6.1.4. Сопоставление фактической и теоретической эффективности экс тракции 124

6.1.5. Оценка качества экстракта 125

6.2. Изучение фармакологической активности настоя и экстракта плодов м. длиннохвойного 127

6.2.1. Изучение острой токсичности 127

6.2.2. Изучение диуретической активности 129

Выводы по главе 6 132

Общие выводы 133

Список литературы

Введение к работе

Актуальность темы. В последние годы неизмеримо возросла актуальность лечения лекарственными растениями и лекарственными препаратами на их основе. Это в первую очередь обусловлено ростом токсико-аллергических заболеваний, терапевтических неудач от применения синтетических лекарственных средств. Многовековые традиции и опыт народной медицины убедительно доказывают целесообразность применения лекарственных растений при профилактике, поддерживающей или курсовой терапии ряда заболеваний. Народная медицина использует огромное количество лекарственных растений, значительная часть которых при надлежащем уровне их химической и фармакологической изученности могут применяться официально. К числу подобных растений относятся представители рода можжевельник.

Отечественная научная медицина ограничивается использованием плодов можжевельника обыкновенного, которые применяются при ряде заболеваний сердечно-сосудистой, мочевыделительной, дыхательной систем, а также входят в состав некоторых мочегонных сборов, в том числе по прописи Здренко. В настоящее время наша страна испытывает дефицит в этом ценном сырье, так как основные промысловые районы можжевельника на территории бывшего СССР остались в Беларуси и Украине. Решить данную проблему позволяет привлечение потенциала других видов можжевельников. В частности, на Кавказе произрастает очень близкий в систематическом отношении вид — можжевельник длиннохвойный - Juniperus oblonga Bieb. Здесь это растение широко распространено и образует обширные заросли. Сведения о химическом составе и фармакологических свойствах м. длиннохвойного весьма ограничены, хотя его плоды и хвоя успешно применяются в народной медицине, подобно м. обыкновенному. В связи с этим необходимость обеспечения сырьевой базы ценным видом сырья за счёт мало изученного м. длиннохвойного нам представляется весьма целесообразной.

Перспективным растением из рода Juniperus L. является и можжевельник казацкий. Хвоя этого вида используется в народной медицине как трихомона-цидное, цитостатическое, противовирусное средство, несмотря на известную токсичность растения. Такие ценные терапевтические эффекты связаны с наличием в нём лигнанов, производных 1 -фенилтетрагидронафталина и флавонои-дов. Кавказская популяция м. казацкого в этом направлении не была изучена.

Таким образом, обеспечение ценным сырьём отечественной медицины за счёт м. длиннохвойного и установление перспективности кавказской популяции м. казацкого является, несомненно, актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - научное обоснование возможности обеспечения сырьевой базы лекарственных растений за счёт ранее мало изученных видов рода можжевельник, произрастающих на Северном Кавказе.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи.

  1. Провести исследования по установлению мест произрастания и определению ресурсных возможностей исследуемых видов.

  2. Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ объектов исследования.

  3. Установить основные морфолого-анатомические диагностические признаки и товароведческие показатели сырья.

  4. Разработать НД на плоды можжевельника длиннохвойного и можжевельника обыкновенного.

  5. Выявить оптимальные условия получения экстракта из плодов можжевельника и его фармакологическую активность.

Научная новизна. Впервые определены районы наибольшего распространения м. длиннохвойного и м. казацкого на территории Северного Кавказа и их сырьевые возможности. Установлен химический состав основных групп биологически активных веществ м. длиннохвойного и состав лигнанов и флавоноидов м. казацкого. Изучены основные компоненты эфирных масел плодов и хвои м.

8 длиннохвоиного. Установлено, что главными компонентами являются: а-пинен, сабинен, Р-мирцен, гермакрен D, терпинен-4-ол. Определён состав смолистых веществ м. длиннохвоиного, впервые в плодах этого вида обнаружены: пимаро-вая, кауреновая, дегидроабиетиновая кислоты и дегидроабиетан, в хвое - пима-ровая кислота и 7-кетоферругинол; из фенольных соединений в плодах и хвое м. длиннохвоиного идентифицированы: дезоксиподофиллотоксин, апигенин, апигенин-7-глюкозид, изокверцитрин, рутин, скутелляреин-7-глюкозид, умбел-лиферон, (+)-катехин, (-)-эпикатехин, дубильные вещества конденсированного типа. Изучены полисахариды по фракциям: водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ) и гемицеллюлоза (ГЦ) и установлен аминокислотный и микроэлементный состав м. длиннохвоиного. Также обнаружены яблочная кислота и фруктоза в свободном виде.

Установлена близость химического состава и фармакологической активности плодов м. длиннохвоиного и м. обыкновенного, что позволяет рекомендовать плоды м. длиннохвоиного в качестве нового сырьевого источника ценного лекарственного растительного сырья - плоды можжевельника.

Предложены критерии оценки качества и идентификации плодов м. длиннохвоиного по его основным морфологическим и анатомическим диагностическим признакам.

Результаты химического изучения свидетельствуют о перспективности хвои м. длиннохвоиного, богатой эфирными маслами и полифенольными соединениями, для дальнейшего внедрения этого вида сырья в практическую медицину.

Впервые в хвое м. казацкого идентифицированы лигнаны: дезоксиподофиллотоксин, дезоксиподоризон и дезоксиизоподофиллотоксин, что свидетельствует о несомненной перспективности данного вида как источника этих соединений с цитостатической и противовирусной активностью.

На основе плодов можжевельника разработан жидкий спиртовый экстракт. Определены нормы качества экстракта и установлена диуретическая активность.

Практическая значимость. В результате проведённых ресурсных исследований определены запасы и установлены объёмы заготовок сырья м. длинно-хвойного и м. казацкого в районах наибольшего их распространения на Северном Кавказе. Показана возможность обеспечения практической медицины ценным лекарственным сырьём - плодами можжевельника за счёт близких по химическому составу и фармакологической активности плодов м. длиннохвойного и м. обыкновенного. На основании ресурсных, химических, морфолого-анатомических и фармакологических исследований разработан проект ФС «Можжевельника плоды - Juniperi fructus». Получен экстракт плодов можжевельника, проведена его стандартизация. Установлено диуретическое действие экстракта плодов можжевельника, значительно превышающее активность их настоев, что позволяет рекомендовать его для дальнейших клинических испытаний в качестве эффективного диуретического средства.

Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования плодов м. длиннохвойного наряду с плодами м. обыкновенного, а также в качестве сырья для производства экстракта плодов можжевельника.

Внедрение результатов исследования. Проект ФС на плоды можжевельника, находится на экспертизе в Институте стандартизации лекарственных средств ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора (письмо №1281 от 19.04.2005 г.), «Инструкция по сбору и сушке шишкоягод можжевельника длиннохвойного», утвержденная Всероссийским институтом лекарственных и ароматических растений (Москва, ВИЛАР, протокол №3 от 01.04.2005 г.).

Апробация полученных результатов. Основные результаты исследования доложены на научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии (2001 - 2005 гг.).

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- итоги ресурсных исследований плодов, хвои м. длиннохвойного и хвои м. казацкого;

результаты исследования химического состава биологически активных веществ м. длиннохвойного и м. казацкого флоры Северного Кавказа;

основное содержание ФС «Можжевельника плоды - Juniperi fructus»;

условия получения экстракта из плодов можжевельника жидкого (1:1) в качестве диуретического средства.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук; Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01200112164) в рамках проблемы «Фармация» секция №38 Учёного совета МЗСР РФ.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована 32 рисунками и 35 таблицами. Список литературы включает 145 источников, в том числе 17 - на иностранных языках.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ботанические сведения о растениях рода можжевельник - Juniperus L. семейства кипарисовых - Cupressaceae Bartl

Род Juniperus L. — можжевельник принадлежит к семейству Cupressaceae-Bartl. - кипарисовые, подсемейству Juniperoideae Endl. — можжевеловые. Это самый крупный род в семействе, объединяющий, по мнению большинства систематиков, около 70 видов, распространённых практически на всех континентах северного полушария. От других представителей семейства этот род отличается значительным полиморфизмом, что дало основание систематикам выделить в нём несколько подродов, секций и серий. Главным отличительным характеристическим признаком рода является наличие ягодообразной шишки, называемой шишкоягодой, образующейся в результате срастания чешуевидных мега-спорофиллов [6, 34, 43, 58].

Все представители рода Juniperus L. — небольшие, вечнозелёные ароматические деревца или кустарники, иногда стелющиеся, приспособленные к сухому климату и скудным почвам [6, 34, 44].

Систематика рода основана на различиях в строении вегетативных органов - листьев (хвои), и генеративных органов - шишкоягод [46].

Род Juniperus L. впервые был описан П. Турнефором в 1700 году, принявшим во внимание представителей только игольчатохвойных можжевельников, чешуйчатые можжевельники он выделил в род Cedrus. К. Линней в 1737 году объединил оба турнефоровские рода в один - Juniperus L. и привёл полное описание их генеративных органов, по которым они существенно не отличаются. В 1841 году Е. Спах обратил внимание на существенные различия внутри рода и выделил в нём две секции: Oxycedrus Spach. и Sabina Spach. С. Эндлихер в 1847 году выделил отдельно подсемейство можжевеловых {Juniperoideae Endl.), секцию Oxycedrus Spach. он разбил на две: Caryocedrus Endl. и Oxycedrus Endl., дал им названия и возвёл в ранг самостоятельных секций. Секцию Sabina Spach., определённую Е. Спахом, С. Эндлихер оставил без изменения [45].

Согласно общепринятой классификации [34, 46, 58], род Juniperus L. подразделяется на три секции (подрода) по следующим морфологическим признакам:

Секция 1. Oxycedrus Endl. — около 20 видов. Листья в мутовках по 3, игловидные, у основания не низбегающие. Шишки с единственной верхушечной семяпочкой, расположены в пазухах листьев, имеют 3 несросшихся семени. Почки с почечными чешуями. Сюда входят такие виды, как J. communis L., J. sibirica Burgsd., J. oxycedrus L., J. oblonga Bieb. и др.

Секция 2. Caryocedrus Endl. Листья в мутовках по 3, игловидные, не низбегающие. Шишки с 3 сросшимися между собой семенами. Единственный представитель - J. drupaceae Labill.

Секция 3. Sabina Endl. — около 50 видов. Листья у молодых растений и иногда у взрослых игловидные, в мутовках по 3, у взрослых большинство листьев чешуйчатые, попарно-супротивные, реже в 3 мутовках, у основания сросшиеся. Шишки без верхушечной семяпочки, расположены на концах веточек, с 1- 12 несросшимися семенами. Эта секция представлена - J. sabina L., J. excelsa Bieb. и др. [34, 46, 58].

Впоследствии было предложено множество различных классификаций рода Juniperus Х.,одна из наиболее крупных за последние 30 лет представлена в монографии М.И. Исмаилова (1974). В подроде Juniperus L. выделяются 3 секции: секция Oxycedroides Gauss. — средиземноморские мезотермные крупные деревья (3-5 видов), листья с двумя белыми устьичными полосками, шишкоя-годы красные или красно-бурые; секция Regioides Gauss. — евроазиатско - восточно-азиатские микротермные деревца и кустарники (4 — 6 видов), листья с одной белой устьичной полоской, шишкоягоды тёмно-синие; секция Recur-voides Gauss. - центральноазиатские микротермные кустарники и стланики (6 -8 видов), листья игольчатые, короткие, прижатые к побегам, шишкоягоды чёрные, односемянные. Подрод Sabina Spach. также делится на три секции, каждая из которой в свою очередь подразделяется на две серии: Folia denticulatae Engelm. - мелкозубчатые листья и Folia integrae Engelm.- цельнокрайние листья. Секция Policarpoides Ant. - мезотермные и олиготермные высокие деревья (20 - 25 видов), многосемянные можжевельники; секция Virginoides Gauss. -североамериканские мезо- и олгиотермные деревья (18 - 20 видов), многосемянные можжевельники; секция Pseudosabinoides Ant. (Monospermae) — центральноазиатские микротермные деревья, кустарники и стланики (18 — 20 видов), односемянные с чёрными шишкоягодами.

Достоинством данной классификации является то, что все виды, входящие в ту или иную серию и секцию, являются близкими между собой как морфологически, так и экологически и биологически [46].

Представители рода Juniperus L. распространены исключительно в северном полушарии. Благодаря экологической разрозненности, одни его представители произрастают в арктической зоне и альпийском поясе южных гор, другие на разных высотах горных хребтов субтропической и тропической зон. Здесь разные виды распространены от подножья хребтов до 4000 м над ур.м. и выше. Можжевельники встречаются на песчаных наносах морских побережий, на песках горных пустынь. Большинство видов рода сосредоточено в горах аридных областей. Их ареал распространяется от Арктики до Азорских и Канарских островов, Северной Африки, Эфиопии, гор восточной тропической Африки, также они встречаются в Гималаях, Китае, Северной Америке, Мексике и Вест-Индии. Многие виды играют большую роль в растительном покрове горного Крыма, Кавказа, Средней Азии (Копет-Даг, Памиро-Алай, Тянь-Шань) и примыкающих к ним территорий [34, 43, 44].

Газо-жидкостная хроматография и хромато-масс-спектрометрия

Для установления присутствия флавоноидов и кумаринов навески сырья массой 10,0 г экстрагировали спиртом этиловым 70% на водяной бане с обратным холодильником в течение 2 часов. Извлечения сгущали под вакуумом до густой консистенции и разбавляли трёхкратным количеством воды. Выпавшие осадки отфильтровывали, фильтраты обрабатывали органическими растворителями различной полярности, для чего их переносили в делительную воронку и экстрагировали последовательно хлороформом и этилацетатом. Полученные извлечения сгущали под вакуумом, растворяли в спирте этиловом 70% и проводили качественные реакции на кумарины (хлороформное извлечение) и фла-воноиды (этилацетатное извлечение). На кумарины - лактонную пробу и реакцию азосочетания [64], на флавоноиды - цианидиновую пробу [118].

Для подтверждения присутствия в сырье дубильных веществ использовали их способность хорошо растворяться в горячей воде. Для этого навески сырья в количестве 10,0 г заливали водой и настаивали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2-х часов. Извлечения фильтровали, дубильные вещества обнаруживали общепринятыми качественными реакциями. Для определения типа дубильных веществ проводили реакцию Стиасни [118].

Присутствие моно- и полисахаридов в сырье определяли реакциями с ан-троновым реактивом и реакцией Селиванова в водных извлечениях из сырья. Для подтверждения наличия гликозидных связей использовали реакцию с 20% спиртовым раствором а-нафтола [110].

Компонентный состав эфирных масел хвои и плодов м. длиннохеойного определяли в лаборатории аналитической фитохимии ботанического института им. В.Л. Комарова (БИН РАН) (г. Санкт-Петербург) под руководством кандидата химических наук А.Л. Шаварды. При этом использовали газохроматогра-фический метод на высокоэффективном газовом хроматографе HRGC-5300 Mega Series фирмы Carlo Erba Strumentasione, производства Италии. Разделение эфирных масел проводили на капиллярной кварцевой колонке SPB-5), полярная стационарная фаза- поли-[5%-дифенил-95%-диметилсилоксан]) длиной 15 м, с внутренним диаметром 0,53 мм и толщиной плёнки неподвижной фазы 0,5 мкм. Газ-носитель - аргон с постоянным потоком 1 мл/мин. Температура программировалась в диапазоне от 60 до 250 С, скорость подъёма - 2 С в минуту, скорость движения самописца - 5 мм/мин. Детектор пламенно-ионизационный FID-40, температура детектора - 250 С, температура испарителя - 230 С, вводимая проба - 1 мкл 1% раствора эфирного масла в гексане. Время анализа — 50 минут.

Расчёт индексов удерживания каждого анализируемого компонента проводили по формуле: І=І„ + ЮО-К - ) Ж) Ж+А )-ЯО где 1п — индекс удерживания реперного компонента (н-алкана), равный 1 ООп (п — число атомов углерода); tx, tn и tn+k — время удерживания исследуемого вещества и ближайших реперных н-алканов с числом атомов углерода п и n+k; f(tx) - интерполирующая функция, вычисляемая в линейно-логарифмических индексах удерживания. Масс-спектры отдельных компонентов, входящих в состав эфирных масел, регистрировались на газовом хроматографе - масс-спектрометре LKB-2091, производства Швеции, также в диапазоне от 60 до 250 С с энергией ионизации 70 эВ, током эмиссии 25 мкА и ускоряющим напряжение 3,5 кВ, температурой испарителя 230 - 250 С, температурой сепаратора 240 С, температурой источника ионов 250 С. Для идентификации индивидуальных компонентов использовали компьютерную базу данных масс-спектров, имеющуюся в распоряжении лаборатории.

Идентификацию смол и лигнанов проводили на хромато-масс-спектрометре Agilent Technology 6890N производства Швейцарии с масс-селективным детектором Agilent 5973. Использовалась капиллярная кварцевая колонка DB-5 MS (неполярный полимер поли-[5%-дифенил-95%-диметилсилоксан]) длиной 30 м, с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм. Температура колонки программировалась от 80 С (2 мин), 280 С (12 С/мин) - изотерма 10 мин, до 300 С (30 С/мин) -изотерма 5 мин. Температура инжектора - 280 С, температура интерфейса -290 С, газ носитель - гелий, поток газа через колонку 1 мл/мин., ионизация электронным ударом при 70 эВ. Хроматограммы регистрировались в режиме полного ионного тока. Идентификация компонентов проводилась при сравнении полученных масс-спектров с данными библиотек масс-спектров — NIST -500 тысяч органических соединений и WILEY-275 - 275 тысяч органических соединений. Регистрация, сбор и обработка данных проводились с помощью программного обеспечения «химическая станция».

Изучение смолистых веществ м. длиннохвойного

Для предварительного установления присутствия лигнанов в м. длинно-хвойном, навески сырья массой 10,0 г экстрагировали спиртом этиловым 70%. Извлечения сгущали под вакуумом и подвергали двухступенчатому хромато графированию методом ТСХ (см. п. 2.3.4.). В результате в плодах и хвое м. длиннохвойного было обнаружено одно пятно лигнановой природы, имеющее красный цвет после проявления, которое по значению Rf = 0,85, соответствовало дезоксиподофиллотоксину [89]. Подтверждение присутствия дезоксиподо-филлотоксина в сырье устанавливали хромато-масс-спектрометрически (про-боподготовка см. п. 4.2.1.).

Время удерживания дезоксиподофиллотоксина - 26,657 мин. (рисунок 19).

Выделение лигнанов из хвои м. казацкого осуществляли с помощью методики Хартуэлла [103]. Для этого 2,0 кг воздушно-сухой хвои м. казацкого мацерировали трёхкратно ацетоном. Извлечение сгущали на ротационном испарителе до густой консистенции и очищали гептаном до обесцвечивания органического растворителя. Оставшуюся сумму сгущали досуха под вакуумом, растворяли в спирте этиловом 96% и очищали, пропуская через колонку с алюминия оксидом, элюировали спиртом этиловым 96%. После отгонки растворителя остаток обрабатывали этилацетатом, нерастворившуюся часть отбрасывали. Этилацетатную фракцию сгущали под вакуумом до небольшого объёма, остаток обрабатывали о-ксилолом, оставляли в холодильнике до выпадения осадка и надосадочную жидкость декантировали. Полученный осадок - сумму лигнанов в количестве 0,5 г, растворяли в спирте этиловом 96% (рисунок 18). Лиг-наны идентифицировали методом хромато-масс-спектрометрии (см. п. 2.3.2.).

В результате установлено наличие трёх веществ лигнановой природы: де-зоксиизоподофиллотоксина (время удерживания 26,34 мин.; (m/z)max - 73 с 10тн. = 100%), дезоксиподоризона (время удерживания 25,46 мин.; (m/z)max. - 73, 256 с Іотн. = 60 и 70% соответственно) и дезоксиподофиллотоксина (время удерживания 26,85 мин.; (m/z)max. - 135, 181; с I0TH. = 100 и 95%) (рисунки 20 и 21).

Выделенные лигнаны вследствие наличия в их структуре тетрагидронаф-талинового ядра и лактонного цикла, подобно подофиллотоксину, способны проявлять цитостатическую активность [145].

Для выделения кумаринов и флавоноидов исследуемый воздушно-сухой материал (плоды, хвоя м. длиннохвойного и хвоя м. казацкого) в количестве 500,0 г обрабатывали хлороформом в аппарате Сокслета в течение 48 часов для удаления липофильных веществ. Высушенное сырьё заливали спиртом этиловым 70% до зеркала и мацерировали в течение суток. Извлечение сливали, и сырьё снова заливали экстрагентом. Всего было сделано пять сливов. После объединения сливов получили 3,0 л извлечения, которое фильтровали и сгущали на испарителе ротационном ИР-1МЗ до густой консистенции. Сгущенную сумму в количестве 200 мл разбавляли 4-кратным объёмом воды и оставляли на сутки в холодильнике. Выпавший после охлаждения смолистый осадок отфильтровывали. Фильтрат переносили в делительную воронку и обрабатывали несколькими порциями хлороформа до обесцвечивания слоя органического растворителя. Хлороформную фракцию обезвоживали натрия сульфатом безводным и сгущали на испарителе ротационном (фракция I). Чтобы выделить кумарины, фракцию I сначала подвергали омылению для удаления сопутствующих веществ. Для этого к ней приливали 50,0 мл 5% водного раствора калия гидроксида и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Далее фильтровали, разбавляли водой и многократно очищали эфиром диэтиловым. Щелочной остаток подкисляли кислотой хлористоводородной разведённой до кислой реакции по универсальному индикатору, и кумарины извлекали эфиром диэтиловым. Сгущенную эфирную сумму подвергали препаративному разделению в тонком слое силикагеля на пластинке «Сорбфил» в системе бензол -этилацетат (2:1). Полосу веществ, соответствующую кумаринам, снимали с пластинки и элюировали спиртом этиловым 96%. В результате было получено вещество кумариновой природы К і. Маточный раствор, полученный после обработки хлороформом, подогревали для удаления следов последнего, охлажда ли и экстрагировали этилацетатом. Этилацетатное извлечение сушили натрия сульфатом безводным и сгущали на ротационном испарителе (фракция II).

Для установления качественного состава агликонов флавоноидов полученной фракции проводили кислотный гидролиз. Для этого небольшую порцию фракции II разбавляли 10 мл спирта этилового 96%, приливали равный объём кислоты серной 10%. Гидролизную смесь нагревали с воздушным холодильником на кипящей водяной бане в течение 4-х часов. После охлаждения смесь разбавляли эквивалентным количеством воды, переносили в делительную воронку, и продукты гидролиза извлекали эфиром диэтиловым, порциями по 10 мл. Эфирную фракцию отгоняли досуха, разводили спиртом этиловым 96%, хроматографировали на бумаге в системе I и в тонком слое силикагеля в системах: бензол - этилацетат (2:1) и бензол - спирт метиловый (8:2) с достоверными свидетелями агликонов флавоноидов. Хроматограммы просматривали в УФ-свете и проявляли хромогенными реактивами: парами 25% аммония гидрокси-да, 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, 10% водным раствором натрия карбоната. В результате, в м. длиннохвойиом обнаружено три агликона: апигенин, кверцетин и скутелляреин, у ли казацкого — апигенин и кверцетин.

Микроскопические признаки

В соответствии с ныне действующим ОСТом 91500.05-001.00. для подтверждения подлинности сырья необходимо проведение качественных реакций.

1. К 5 мл водного извлечения прибавляли 1 мл 1 % водного раствора желе-зоаммониевых квасцов и встряхивали. Раствор при этом приобретал чёрно-зеленое окрашивание, а при стоянии выпадал темный, почти черный осадок (фенольные соединения).

2. К 2 мл спиртового извлечения по стенке пробирки приливали 1 мл 1% раствора п-диметиламинобензальдегида в кислоте серной 92%. На границе фаз образовывалось красно-вишнёвое кольцо (терпеноиды).

3. К 2 мл спиртового извлечения приливали 1 мл 1% раствора ванилина в кислоте серной концентрированной. На границе фаз образовывалось фиолетовое окрашивание (терпеноиды).

Для хроматографического анализа эфирное масло получали из воздушно-сухих плодов гидродистилляцией по методу 2 ГФ XI. Масло в количестве около 10 мг растворяли в 1,0 мл гексана и наносили на пластинку «Сорбфил» 20x10 см, параллельно наносили 10 мкл стандартного раствора а-пинена (1 мкг/мкл). Хроматографировали в системе гексан — этилацетат (95:5). После прохождения фронта подвижной фазы 18 см пластинку высушивали до удаления запаха растворителя, опрыскивали 10 мл реактива и нагревали в сушильном шкафу 10 о мин. при 100 С.

После проявления на хроматограмме должна быть зона с Rf 0,86 — 0,88 (сиреневого цвета), соответствующая по цвету и значению Rf а-пинена. Кроме того, обнаруживаются ещё 9 зон с Rf от 0,74 до 0,76 (сиреневого цвета); от 0,66 до

0,68 (жёлтого цвета); от 0,58 до 0,56 (жёлтого цвета); от 0,49 до 0,51 (розового цвета); от 0,45 до 0,47 (оранжевого цвета); от 0,33 до 0,35 (голубого цвета); от 0,22 до 0,24 (синего цвета); от 0,18 до 0,20 (синего цвета) и от 0,12 до 0,14 (синего цвета) (рисунок 30).

Приготовление реактива: 0,5 мл анисового альдегида растворяли в смеси 10 мл кислоты уксусной ледяной + 85 мл спирта метилового и добавляли 5 мл кислоты серной концентрированной.

Приготовление стандартного раствора а-пинена: 1 мл а-пинена помещали в стеклянный бюкс и растворяли в 1 мл гексана.

Для включения в разрабатываемую нормативную документацию плодов м. обыкновенного и м. длиннохеойного мы также определили их числовые показатели, как в цельном, так и в порошкованном виде, регламентируемые ОСТом 91500.05-001-00, а также дефекты сырья.

Содержание эфирного масла — оценку качества плодов и порошка как сырья для получения водных извлечений, экстракта жидкого и эфирного масла проводили по содержанию эфирного масла, которое составило: у м. длинно-хвойного 2,14±0,022% и 1,96±0,012%; У м. обыкновенного - 1,5±0,017% и 1,2±0,031% соответственно. Рекомендуем установить норму содержания эфирного масла в сырье не менее 1,0% (таблица 26).

Содероісание флавоноидов — оценку качества плодов и порошка, как сырья для получения настоя и экстракта жидкого, проводили также по содержанию флавоноидов. В плодах м. длиннохеойного их содержание - 0,91±0,0025% в порошке - 0,87±0,063%; в плодах м. обыкновенного - 0,82±0,0012%, в порошке -0,78±0,07 % Рекомендуем установить норму содержания флавоноидов в сырье не менее 0,5% (таблица 26).

Потеря в массе при высушивании (влажность) — потеря в массе при высушивании исследуемых образцов находилась в диапазоне 7,6 - 9,2%. ГФ XI (вып. 2, с. 290) регламентирует влажность не более 20%. Рекомендуем оставить данный показатель на прежнем уровне - не более 20% (таблица 26).

Зола общая — содержание золы общей в исследованных образцах находилось на уровне 3,0-3,3%. Рекомендуем оставить данный показатель на уровне, регламентируемом ГФ XI (вып. 2, с. 290) не более 5,0% (таблица 26).

Зола, нерастворимая в 10%-ном растворе кислоты хлористоводородной - для исследуемого сырья данный показатель вводится впервые. У м. длинно-хвойного он составил от 0,85% до 0,86%, для м. обыкновенного - 0,76%. Рекомендуем установить данный показатель на уровне не более 1,0% (таблица 26).

Дефекты сырья - у образцов определялось количество (%) побуревших плодов, зелёных плодов, органических и минеральных примесей (таблица 26). Рекомендуем установить количество побуревших плодов не более 6%, остальные показатели оставить на прежнем уровне (таблица 26).

Частиц, не проходящих через сито с отверстиями 1,0 мм — устанавливали для порошка плодов. В исследуемых образцах их содержание составило 2,36 - 3,8%. Рекомендуем оставить данный показатель на уровне, регламентируемом ГФ - не более 5,0%.

Похожие диссертации на Фармакогностическое изучение можжевельника длиннохвойного и можжевельника казацкого