Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1. Биофармацевтический анализ лекарственных средств 9
1.2. Роль глюкозаминогликанов в лечении остеоартроза 24
1.3. Характеристика хондроитина сульфата 35
Выводы по главе 42
Экспериментальная часть
Глава 2. Разработка методов количественного определения глюкозаминогликанов 43
2.1. Разработка методики количественного определения хондроитина сульфата методом спектрофотометрии 43
2.2. Разработка методики количественного определения хондроитина сульфата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ..53
2.3. Сопоставление методов 59
Выводы по главе 61
Глава 3. Изучение кинетики высвобождения in vitro хондроитина сульфата из твердых дозированных лекарственных форм 62
3.1. Подбор условий анализа для определения профиля растворения различных препаратов хондроитина сульфата 63
3.2. Результаты испытания теста «Растворение» различных твердых лекарственных форм хондроитина сульфата 68
Выводы по главе 80
Глава 4. Изучение относительной биодоступности хондроитина сульфата из различных лекарственных форм у экспериментальных животных (in vivo) 81
4.1. Материалы и методы исследования 82
4.2. Результаты сравнительного изучения относительной биодоступности различных лекарственных форм хондроитина сульфата у экспериментальных животных 84
Выводы по главе 96
Глава 5. Изучение биоэквивалентности таблеток хондроитина сульфата и капсул структум у здоровых добровольцев (in vivo) 97
5.1. Тактика исследования 98
5.2. Результаты сравнительного изучения относительной биодоступности различных лекарственных форм хондроитина сульфата у здоровых добровольцев 105
Выводы по главе 115
Общие выводы 116
Список литературы
- Роль глюкозаминогликанов в лечении остеоартроза
- Разработка методики количественного определения хондроитина сульфата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
- Результаты испытания теста «Растворение» различных твердых лекарственных форм хондроитина сульфата
- Результаты сравнительного изучения относительной биодоступности различных лекарственных форм хондроитина сульфата у экспериментальных животных
Введение к работе
Актуальность темы
Остеоартроз (ОА) - широко распространенное заболевание, встречающееся примерно у 10 % населения земного шара. Среди лиц 50 лет и старше почти половина имеет признаки этого заболевания [1, 22].
ОА - гетерогенная группа дегенеративных заболеваний суставов различной этиологии со сходными биологическими, морфологическими, клиническими проявлениями. Основным патологическим проявлением ОА является нарушение суставного хряща. Наряду с поражением хряща в патологический процесс при ОА вовлекаются другие компоненты сустава: субхондриальная кость, синовиальная оболочка, а также связки, капсула сустава, околосуставные мышцы.
Лечение О А направлено на решение следующих задач: уменьшение боли и воспаления, снижение частоты обострений и поражения новых суставов, улучшения качества жизни, замедления прогрессирования и предотвращения инвалидности [29, 68, 69, 74,81, 82, 86, 95, 108, 109, 112].
Новое направление в лечении ОА основано на применении хондропротекторов - естественных компонентов хрящевого межклеточного вещества (хондроитина сульфат, глюкозамина сульфат и гиалуроновая кислота) [95, 134].
В последние годы повышенный интерес вызывают новые генерические лекарственные препараты хондроитина сульфата. Оценка биоэквивалентности ("фармакокинетической эквивалентности") лекарственных препаратов является основным видом медико-биологического контроля качества воспроизведенных лекарственных препаратов, содержащих одно и то же лекарственное средство в дозе и лекарственной форме, аналогичным тем, которые соответствуют оригинальному лекарственному препарату. Исследования биоэквивалентности позволяют сделать обоснованные заключения о качестве сравниваемых
5 препаратов по относительно меньшему объему первичной информации и в более сжатые сроки, чем при проведении клинических исследований.
Исследования биоэквивалентности не рассматриваются как альтернатива испытаниям фармацевтической эквивалентности воспроизведенных препаратов по качественному и количественному составу лекарственных средств, оцениваемому по фармакопейным тестам, поскольку фармацевтическая эквивалентность не гарантирует эквивалентности фармакокинетической. Вместе с тем, исследования биоэквивалентности предполагают, что фармакокинетически эквивалентные (биоэквивалентные) оригиналу воспроизведенные препараты обеспечивают одинаковую эффективность и безопасность фармакотерапии, то есть, что они являются терапевтическими эквивалентами [18, 19].
Основными исследованиями, подтверждающими эквивалентность (неэквивалентность) препаратов являются: определение «Растворение» in vitro [4-7, 89], изучение биодоступности и фармакокинетики на людях и животных; сравнительные клинические исследования [19,30].
Таким образом, представляется актуальным изучение сравнительной биодоступности и биоэквивалентности различных лекарственных форм хондроитина сульфата.
Цель работы
Целью настоящей работы явилось изучение фармакокинетических параметров твердых дозированных лекарственных форм хондроитина сульфата.
Задачи исследования
Разработать методику количественного определения хондроитина сульфата методом спектрофотометрии в растворах и сыворотке крови.
Изучить хроматографическое поведение ХС методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и подобрать условия его количественного
определения в растворах и сыворотке крови.
Подобрать условия для проведения испытания «Растворение» твердых дозированных лекарственных форм, содержащих ХС.
Изучить кинетику высвобождения in vitro хондроитина сульфата из твердых дозированных лекарственных форм с различным составом вспомогательных веществ.
Определить относительную биодоступность различных лекарственных форм хондроитина сульфата у экспериментальных животных.
Изучить относительную биодоступность и биоэквивалентность препаратов хондроитина сульфата у здоровых добровольцев.
Научная новизна
На основе комплексного изучения физико-химических свойств, содержащих хондроитина сульфат, разработаны условия и методика количественного определения для проведения испытания «Растворение» для твердых дозированных лекарственных форм хондроитина сульфата.
Изучена сравнительная биодоступность и биоэквивалентность различных лекарственных форм с хондроитина сульфатом отечественного производства. На основе биофармацевтической оценки выбран наиболее оптимальный состав вспомогательных веществ нового генерического отечественного препарата, содержащего ХС.
Впервые изучены особенности фармакокинетики биодоступности нового отечественного препарата хондроитина сульфата на экспериментальных животных и здоровых добровольцах.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования
Разработаны методики количественного определения
глюкозаминогликанов методами спектрофотометрии и высокоэффективной
7 жидкостной хроматографии в растворах и сыворотке крови.
Подобраны условия проведения теста «Растворение» для твердых дозированных форм хондроитина сульфата.
Определены значения фармакокинетических параметров хондроитина сульфата при однократном пероральном применении таблеток и капсул с хондроитина сульфатом у лабораторных животных и здоровых добровольцев.
Методика количественного анализа хондроитина сульфата внедрена в работу отдела клинико-фармакологической экспертизы лекарственных средств Института клинической фармакологии ФГУ «НЦЭСМП» Росздравнадзора и рекомендована к использованию в работе территориальных управлений Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (акт внедрения от 16.04.2007 г.), а так же в Филиале «Клиническая фармакология» ГУ Научного Центра Биомедицинских Технологий РАМН при проведении фармакокинетических исследований (акт внедрения от 15.03.2007 г.) (приложения 1, 2).
Апробация диссертации
Апробация работы проведена на совместном заседании Ученого совета ФГУ «НЦЭСМП» Росздравнадзора и кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ГОУВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава (2 июля 2007 г.)
Основные положения и результаты работы докладывались и обсуждались:
на научно-практической конференции «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» (март 2006 г., г. Москва);
на XIII и XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2006 г., апрель 2007 г., г. Москва);
- на научно-практической конференции «Оптимизация фармакотерапии на
основе изучения активности ферментов биотрансформации и транспортеров
лекарственных средств» (декабрь 2006 г., г. Москва).
Публикации
По результатам проведенных исследований опубликовано 8 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов и приложений; включает библиографический указатель из 161 источника, в том числе 45 отечественных, 116 иностранных, иллюстрирована 41 таблицами, 26 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
методика количественного определения хондроитина сульфата методом спектрофотометрии в растворах и сыворотке крови;
условия количественного определения хондроитина сульфата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в растворах и сыворотке крови;
результаты изучения кинетики высвобождения in vitro хондроитина сульфата из твердых дозированных лекарственных форм;
результаты изучения относительной биодоступности различных лекарственных форм хондроитина сульфата у экспериментальных животных и здоровых добровольцев.
Роль глюкозаминогликанов в лечении остеоартроза
Остеоартроз (ОА) - широко распространенное заболевание, встречающееся примерно у 10 % населения земного шара. Среди лиц 50 лет и старше почти половина имеет признаки этого заболевания [2], которое встречается повсеместно. Значение вопросов лечения остеоартроза обусловлено не только его высокой распространенностью, но и теми социальными потрясениями, которые заболевание вызывает у пациента: резкое снижение двигательной активности приводит к выраженному снижению уровня качества жизни, социальной дезадаптации, потере трудоспособности, а в крайних формах и способности к самообслуживанию.
Интерес к этому заболеванию обусловлен также значительными финансовыми затратами со стороны как отдельного больного, так и общества в целом. В 1994 г. Центр по контролю и профилактике заболеваний США прогнозировал, что к 2020 г. в США больных с артритом будет больше, чем с любым другим заболеванием [114, 150]. Об увеличении распространенности ОА в нашей стране можно косвенно судить по оценке удельного веса этого недуга среди заболеваний опорно-двигательного аппарата на основании статистических данных о госпитализации и обращаемости за лечебной помощью [23-25]. По данным официальной статистики Российской Федерации, распространенность ОА за последние годы возросла на 35 %, а дегенеративные поражения позвоночника и суставов, по данным анализа статистических показателей по России [20], составляют более 75 % от всех болезней костно-мышечной системы, и распространенность их достигла 11,48 на 1000 взрослого населения.
ОА - гетерогенная группа дегенеративных заболеваний суставов различной этиологии со сходными биологическими, морфологическими и клиническими проявлениями и исходом. Основным патологическим проявлением ОА является разрушение хряща [58, 59, 78]. Наряду с поражением хряща в патологический процесс при ОА вовлекаются другие компоненты сустава: субхондриальная кость, синовиальная оболочка, а также связки, капсула сустава, околосуставные мышцы [58, 78]. В зарубежной литературе вместо термина «остеоартроз» используют более адекватный термин «остеоартрит», подчеркивающий важную роль воспалительного компонента в развитии и прогрессировании заболевания [61]. Действительно, в синовиальной оболочке, хряще и субхондральной кости при ОА отмечается увеличение экспрессии противовоспалительных медиаторов, даже в отсутствие классических признаков воспаления (нейтрофильная и макрофагальная инфильтрация и др.) [122, 124]. Лечение ОА должно быть направлено на решение следующих задач: - уменьшение боли и воспаления; - снижение частоты обострений и поражения новых суставов; - улучшение качества жизни; - замедление прогрессирования и предотвращение инвалидности и др. [43, 78]. В настоящее время принята классификация антиартрозных препаратов [20, 42, 121], которые подразделяют на три группы: 1) симптоматические препараты быстрого действия; 2) симптоматические препараты замедленного действия (Symptomatic slow acting drugs for osteoarthritis - SYSADOA); 3) препараты, модифицирующие структуру хряща. Однако проблема предотвращения прогрессирования потери хряща при ОА до сих пор остается нерешенной [13, 110, 129, 133].
До недавнего времени методы лекарственной терапии ОА ограничивались применением препаратов первой группы - ненаркотическими анальгетиками (парацетамол, реже - комбинированный препарат трамадол) и нестероидными противовоспалительными средствами (НПВС) [137-139]. Но НПВС, достаточно эффективно купируя симптомы ОА, часто дают побочные эффекты, в первую очередь в отношении желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [3, 12, 15, 41, 56, 115, 130, 132, 139,143].
Новое направление в лечении ОА основано на применении препаратов второй группы, к которым относятся естественные компоненты хрящевого межклеточного вещества — гиалуроновая кислота, глюкозамина сульфат и хондроитина сульфат (ХС). Предполагается, что эти препараты могут оказывать не только симптоматическое действие (уменьшение боли, улучшение функции сустава), но и замедляют прогрессирование ОА при длительном приёме [1, 9, 16, 17, 23, 33, 41, 147].
Хондроитинсульфаты (ХС) вместе с кератан-, дерматан-, гепарансульфатами и гепарином относятся к группе соединений, которые имеют общее название - сульфатированные гликозаминогликаны (ГАГ). Химический состав ГАГ, найденных в соединительной ткани (СТ) позвоночных, представлен в таблице 5.
Разработка методики количественного определения хондроитина сульфата методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Для разработки количественного определения хондроитина сульфата в водном растворе ВЭЖХ методом использовали: - субстанцию хондроитина сульфата (предоставленную ОАО «Нижфарм»); - высокоэффективный жидкостной хроматограф «Shimadzu» с УФ - детектором; - интегратор «Shimadzu»; - хроматографическую колонку: u-Bondapark Waters С-18; 3,9 мм х 300 мм; - ацетонитрил "Sigma" (для ВЭЖХ); - натриевую соль октансульфоновои кислоты, степень чистоты для ВЭЖХ, "Sigma"; - триэтиламин, чда; - фосфорную кислоту, 85% , чда. Условия хроматографирования
Исходя из УФ-спектра водного раствора хондроитина сульфата (рис. 4) для измерения методом ВЭЖХ была выбрана длина волны 200 нм. Оптимальной оказалась скорость потока 0,6 мл/мин. Температура колонки - 20С. Подвижная фаза: в мерную колбу вместимостью 1000 мл добавляли 1,2 г натриевой соли октансульфоновои кислоты, 10 мл концентрированного буферного раствора и 100 мл ацетонитрила. Содержимое колбы водой дегазированной доводили до метки и перемешивали. Полученный раствор фильтровали и дегазировали в течение 10 минут.
Объем введения - 20 мкл. Время регистрации хроматограммы - 10 минут. Время удерживания хондроитина сульфата - около 1,8 минут. Приготовление растворов Концентрированный буферный раствор
В мерную колбу вместимостью 1000 мл добавляли 100 мл триэтиламина и 80 мл воды очищенной дегазированной. Осторожно добавляли 80 мл фосфорной кислоты. Перемешивали и охлаждали до комнатной температуры (около 20С). Устанавливали рН=2,23, доводили объем водой очищенной дегазированной до метки.
Стандартные растворы хондроитина сульфата
В мерную колбу вместимостью 100 мл помещали 50 мг (точную навеску) хондроитина сульфата, добавляли 50 мл воды очищенной дегазированной и перемешивали. Доводили объем водой очищенной дегазированной до метки. Из полученного раствора путем разбавления водой очищенной дегазированной готовили стандартные растворы с концентрацией 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 и 500 мкг/мл.
С целью количественной оценки содержания хондроитина сульфата в образцах проб строили калибровочный график (рис. 7) зависимости площади пика от концентрации препарата в диапазоне концентраций 1 - 500 мкг/мл (табл. 13).
Для оценки пригодности хроматографической системы рассчитывали следующие параметры: коэффициент емкости (к% число теоретических тарелок (N), селективность (а) и степень разделения (R).
Для вычисления этих показателей использовали общие фармакопейные статьи USP27 и ВР2004. Формулы для расчета хроматографических параметров разделения представлены в таблице 14.
Так как рассчитанный коэффициент Стьюдента был меньше табличного значения как для СФ, так и для ВЭЖХ метода анализа (табл. 16), то полученные данными методами результаты не отягощены систематической ошибкой.
1. В результате исследования разработан метод спектрофотометрического анализа хондроитина сульфата, основанный на развитии метахроматической реакции сульфатированных глюкозаминогликанов с красителем — 1,9-диметилметиленовым синим. Оптическая плотность окрашенного раствора хондроитина сульфата регистрировалась при длине волны 500 нм. Зависимость оптической плотности от концентрации хондроитина сульфата носила линейный характер в диапазоне концентраций от 1 мкг/мл до 300 мкг/мл (г = 0,9939). Относительная ошибка спектрофотометрического метода количественного определения хондроитина сульфата с 1,9-ДМС находилась в диапазоне от 4,69 до 7,20%.
2. Разработан метод количественного определения хондроитина сульфата методом ВЭЖХ. Исходя из УФ-спектра водного раствора хондроитина сульфата была выбрана длина волны 200 нм. Зависимость площади пика от концентрации раствора хондроитина сульфата носила линейный характер в диапазоне от 1 мкг/мл до 500 мкг/мл (г = 0,999). Время удерживания препарата -1,3 минуты, число теоретических тарелок - 643,13. Относительная ошибка результата для ВЭЖХ метода количественного определения ХС находилась в диапазона от 3,54 до 7,59%.
3. Полученные СФ и ВЭЖХ методами результаты свободны от систематической ошибки. Проведение теста «Растворение» при разработке лекарственных средств в твердых дозированных формах позволяет выявить наиболее оптимальное соотношение и состав вспомогательных веществ, подобрать лекарственную форму.
В данной главе изучался профиль растворения различных препаратов хондроитина сульфата в сравнении с зарегистрированным оригинальным препаратом «Структум».
Результаты испытания теста «Растворение» различных твердых лекарственных форм хондроитина сульфата
Исследуемые лекарственные формы хондроитина сульфата: - капсулы Структум, 250 мг; - таблетки хондроитина сульфата, 250 мг; - капсулы хондроитина сульфата с микрокристаллической целлюлозой, 250 мг; - капсулы хондроитина сульфата с поливинилпирролидоном, 250 мг.
Условия проведения теста: Оборудование: «вращающаяся корзинка»; Скорость вращения: 75 об/мин.; Среда для растворения: вода очищенная; Объем среды: 1000 мл; Время отбора проб: 10, 15, 20, 30 и 45 мин.; Температура: 37±0,5С.
Концентрацию хондроитина сульфата (в процентах), высвободившегося из твердых дозированных лекарственных форм в среду растворения (рис. 10-14), рассчитывали по формуле (табл. 19-26): X (%) = Д сщш Щ 100% , До La. Vs где До - оптическая плотность стандартного раствора ХС; Дстр.- оптическая плотность испытуемого раствора ХС; ms - навеска стандартного образца хондроитина сульфата, мг; Vs - объем воды очищенной, в которой растворили навеску стандартного образца хондроитина сульфата, мл; Vcp.paerB- объем среды растворения, мл. La - заявленное содержание хондроитина сульфата натрия в одной капсуле, мг
Кинетика высвобождения хондроитина сульфата in vitro из различных лекарственных форм; 1 - таблетки хондроитина сульфата 250 мг, 2 -капсулы хондроитина сульфата с поливинилпирролидоном 250 мг, 3 - капсулы хондроитина сульфата с микрокристаллической целлюлозой 250 мг, 4 -капсулы «Структум» 250 мг
Через 10 минут из таблеток хондроитина сульфата 250 мг в среду растворения высвободилось 81,0 ± 5,9 %; из капсул хондроитина сульфата с микрокристаллической целлюлозой 250 мг - 55,7 ± 2,7 %; из капсул хондроитина сульфата с поливинилпирролидоном 250 мг - 49,3 ±3,0 %; из препарата «Структум» 250 мг - 68,6 ± 6,7%.
Через 15 минут процент высвобождения таблеток хондроитина сульфата 250 мг и капсул «Структум» практически сравнялся: 84,4 ± 3,6 % и 84,7 ± 5,3 %; из капсул с микрокристаллической целлюлозой высвободилось 69,7 ±9,1 %; из капсул с поливинилпирролидоном - 64,9 ± 2,5 %. Через 20 минут из таблетированной лекарственной формы хондроитина сульфата в среду растворения перешло 88,2 ± 1,0 %; из капсул с микрокристаллической целлюлозой - 74,7 ± 9,5 %; из капсул с поливинилпирролидоном - 70,7 ± 4,9 %; из капсул «Структум» в среднем - 91,6 ± 3,2 %.
Через 30 минут от начала растворения были получены следующие показатели: из таблеток хондроитина сульфата 250 мг в среду растворения высвободилось 96,1 ± 4,4 %; из капсул хондроитина сульфата с микрокристаллической целлюлозой 250 мг - 78,9 ± 5,2 %; из капсул хондроитина сульфата с поливинилпирролидоном 250 мг - 73,6 ± 1,1 %; из препарата «Структум» 250 мг - 97,2 ± 2,5 %.
Через 45 минут, в конечной точке растворения высвобождение из таблеток хондроитина сульфата и капсул «Структум» практически совпадает — около 100 % (98,6 % и 99,5 % соответственно), из капсул с микрокристаллической целлюлозой высвободилось 81,1 %, из капсул с поливинилпирролидоном еще меньше - всего 73,0%.
Сопоставимость полученных профилей растворения оценивалась с помощью коэффициента различия и коэффициента подобия (табл. 27), методика определения которых была одобрена Center for Drug Evaluation and research (FDA) и Human Medicines Evaluation Unit of The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA), в качестве критериев оценки подобия профилей растворения «in vitro». fi - коэффициент различия отражает процент ошибки между двумя кривыми по всем точкам времени и рассчитывается по формуле : fl = x 100, где n - число точек времени, Rj и Tj - процент растворившегося вещества из ЛС в каждый момент времени j; f2 - коэффициент подобия - это величина, представляющая собой логарифмическое преобразование значения суммы квадратов ошибок, рассчитанных по разности между испытуемым Tj и стандартным продуктом Rj во всех точках времени.
Результаты сравнительного изучения относительной биодоступности различных лекарственных форм хондроитина сульфата у экспериментальных животных
Целью настоящего исследования явилась оценка относительной биодоступности и биоэквивалентности двух препаратов хондроитина сульфата: экспериментальные таблетки хондроитина сульфата 250 мг отечественного производства и капсулы «Структум» 250 мг, производства фирмы «Пьер Фабр Медикамент Продакшн» (Франция) - препарат сравнения.
Клиническую часть исследования проводили на базе Института иммунологии Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Минздравсоцразвития России в соответствии с протоколом № В/Б0504, утвержденным специализированной комиссии по клинической фармакологии ФГУ НЦЭСМП, а так же согласно методическим указаниям «Проведение качественных исследований биоэквивалентности лекарственных средств», утвержденным Минздравсоцразвития России в 2004 году.
Исследование осуществляли открытым методом по перекрестной и рандомизированной схеме на здоровых добровольцах.
Сведения об испытуемых Для проведения фармакокинетического исследования таблеток хондроитина сульфата и Структум было отобрано 18 здоровых добровольцев, демографические и антропометрические характеристики которых представлены в таблице 32.
В качестве добровольцев были привлечены мужчины и женщины, добровольно изъявившие желание участвовать в испытаниях врачебно-экспертной комиссией.
Критериями включения в исследование являлись: -возраст 18-45 лет; - масса тела добровольцев не выходит за пределы 20% от «идеальной» массы тела для данного пола, возраста и роста; - отсутствие патологии желудочно-кишечного тракта, печени, почек, сердечнососудистой системы (предварительно проведенные клинико-лабораторные и инструментальные исследования не выявили наличия каких-либо заболеваний); - наличие информированного согласия добровольца на включение в исследование.
Добровольцы принимали внутрь натощак 3 таблетки хондроитина сульфата или 3 капсулы Структум (750 мг хондроитина сульфата). Спустя 4 часа после приема препарата испытуемые получали стандартный завтрак.. Отбор крови производился непосредственно перед и в течение 10 часов после приема препарата (по 10 образцов у каждого добровольца). Через 30 минут после отбора пробы крови центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин, полученную сыворотку хранили в пробирках Эппендорфа при температуре -20С до начала исследования.
Интервал времени между приемом двух исследуемых препаратов составлял 7 суток. Количественное определение глюкозаминогликанов, включая хондроитина сульфат и олиго- и полисахариды молекулярной массой менее 5 кДа, образующиеся в результате расщепления экзогенного хондроитина сульфата, в пробах сыворотки крови проводили методом ВЭЖХ с использованием хроматографического комплекса фирмы «Shimadzu» (Япония). К 1 мл сыворотки прибавляли 1 мл ТХУ, смесь встряхивали на механическом шейкере в течение 1 минуты, затем центрифугировали в течение 5 минут при 12 000 об/мин, отбирали надосадочную жидкость и добавляли раствор 1,9-ДМС. Через 10 минут аликвоту (100 мкл) вводили в хроматограф. Пробы готовили непосредственно перед анализом. Разделение проводили на колонке «ц - Bondapak С - 18» («Waters», США; 3,9 х 300 мм, 5 мкм) при температуре термостата колонки 25С. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и буферного раствора в соотношении 10:1 (об/об) с добавлением натриевой соли октансульфоновой кислоты (буферный раствор содержал 100 мл триэтиламина на 1000 мл воды с добавлением 85% фосфорной кислоты до рН 2,23). Скорость потока составляла 0,6 мл/мин, детектирование проводили при длине волны 200 нм. Калибровочный график хондроитина линеен в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкг/мл. Минимальная определяемая концентрация - 0,1 мкг/мл. Стандартная ошибка определения хондроитина при его концентрации от 1 до 50 мг/мл составляет 13,8%; при концентрации от 50 до 100 мкг/мл- 8,5%.
В связи с тем, что в крови человека присутствуют эндогенные глюкозаминогликаны, концентрацию экзогенного хондроитина в пробах крови определяли, вычитая из общей концентрации глюкозаминогликанов, полученной в результате анализа проб крови добровольца после приема препарата, уровень глюкозаминогликанов, установленный до приема каждого из препаратов у каждого добровольца.
Индивидуальные профили изменения концентрации (С) хондроитина в сыворотке крови во времени (t), зарегистрированные после приема таблеток хондроитина сульфата (Т) и Структум (R), характеризовали максимальной концентрацией лекарственного вещества (Стах, наибольшее из измеренных значений) и временем ее достижения (tmax), а также площадью под кривой «концентрация - время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы крови (t = 10 ч), рассчитанной методом трапеций (AUCioh).
