Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Багульник болотный - источник природных биологически активных веществ. (Обзор литературы) 10
1.1. Ботаническая характеристика багульника болотного (Ledum palustre L.): морфология и распространение, ресурсоведческий анализ 10
1.2. Сведения о химическом составе багульника болотного 12
1.3. Использование багульника болотного в народной и научной медицине 14
1.4. Степень фармакологической изученности багульника болотного 18
Глава 2. Характеристика объектов и методов исследования 22
2.1. Объекты исследования 22
2.2. Методы оценки биологической активности экстрактов из побегов багульника болотного 22
2.3. Методы химического исследования 29
2.4. Методы получения и стандартизации экстракционных препаратов из побегов багульника болотного 35
2.5. Статистическая обработка полученных результатов 39
Глава 3. Исследование биологической активности экстрактов из побегов багульника болотного 40
3.1. Острая токсичность 40
3.2. Антиоксидантная активность 42
3.3. Эффективность экстрактов из багульника болотного на моделях «свободнорадикальных» патологий 45
3.3.1. Антимутагенная активность 46
3.3.2. Протективные свойства на фоне интоксикации тетрахлорметаном 48
3.3.2.1. Антитоксическое действие 49
3.3.2.2. Выбор эффективной антитоксической дозы 50
3.4. Противовоспалительные свойства 53
3.5. Анальгезирующее действие 54
3.6. Антимикробная активность 55
Глава 4. Исследование химического состава экстракта из побегов багульника болотного на 40%-м этаноле 60
4.1. Анализ гексановой фракции 60
4.2. Анализ фракций после разделения экстракта на хроматографической колонке 61
4.3. Анализ хлороформной и этилацетатной фракций экстракта 64
Глава 5. Разработка методов стандартизации лекарственного растительного сырья для фармакопейной статьи «Побеги багульника болотного» 81
5.1. Определение морфолого-анатомических признаков исследуемых образцов багульника болотного 82
5.2. Определение показателей качества исследуемых образцов багульника болотного 87
5.3. Разработка методики качественного обнаружения флавоноидов в побегах багульника болотного методом ТСХ 89
5.4. Разработка методики количественного определения флавоноидов в побегах багульника болотного спектрофотометрическим методом 90
5.5 Определение микробиологической чистоты 98
5.6. Фитохимический анализ побегов багульника болотного 99
5.7. Изучение элементного состава багульника болотного, произрастающего на территории Сибири и Дальнего Востока 99
Глава 6. Разработка технологии получения экстракционных препаратов из побегов багульника болотного и их стандартизация 105
6.1. Изучение влияния ряда факторов на выход действующих веществ 105
6.2. Получение жидкого экстракта и его стандартизация 109
6.3. Получение сухого экстракта и его стандартизация 110
Список литературы 113
Приложение.
- Сведения о химическом составе багульника болотного
- Методы оценки биологической активности экстрактов из побегов багульника болотного
- Эффективность экстрактов из багульника болотного на моделях «свободнорадикальных» патологий
- Анализ фракций после разделения экстракта на хроматографической колонке
Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия в ведущих странах мира наблюдается тенденция к более широкому использованию в медицинской практике лекарственных средств растительного происхождения, преимущество которых заключается в мягкости действия, малой токсичности и редком индуцировании аллергических реакций, что особенно важно в случае заболеваний, требующих длительного лечения.
В этом плане наше внимание привлек багульник болотный, являющийся официнальным растением. Существующая фармакопейная статья на побеги багульника болотного базируется на результатах, полученных при исследовании образцов, произрастающих в Европейской части России.
В то же время, по данным литературы, на территории Сибири и Дальнего Востока существует огромный ресурсный запас данного растения, позволяющий проводить заготовку сырья в промышленных масштабах без нанесения ущерба как самому растению (используются побеги ежегодного прироста), так и экосистемам региона.
Государственная фармакопея регламентирует использование побегов багульника болотного в качестве отхаркивающего и противокашлевого средства, в то же время, в народной медицине спектр его применения значительно шире.
Побеги багульника болотного в виде настоя, отвара, масляного извлечения и в составе лекарственных сборов используются для лечения заболеваний органов дыхания, при диатезах, экземах, болезнях печени, при желудочно-кишечных и сердечно-сосудистых заболеваниях, для предупреждения эпилептических приступов и уменьшения удушья, в качестве противовоспалительного, ранозаживляющего, антисептического средства.
Ранее на кафедре фармакогнозии СибГМУ под руководством профессора Т.П. Березовской было проведено детальное исследование эфирного масла (Белоусова Н.И.), сравнительное химическое исследование фенольных соединений сибирских и дальневосточных видов рода багульник методом двумерной бумажной хроматографии (Клокова М.В.), скрининговое исследование некоторых видов фармакологической активности и химического состава полисахаридного комплекса багульника болотного (Белоусов М.В.).
Полученные результаты свидетельствуют о высоком, неиспользуемом официнальной медициной, ресурсе багульника болотного как продуцента БАВ с широким спектром фармакологической активности, что и актуализировало выбор объекта и цель наших исследований.
Цель исследования. Комплексное химико-фармакологическое исследование сибирских образцов багульника болотного с целью создания на его основе новых лекарственных средств.
Задачи исследования:
Оценить острую токсичность и провести исследование биологической активности суммарных экстрактов (экстрагент: вода, 40%-й этанол, 70%-й этанол) из побегов багульника болотного флоры Западной Сибири.
Изучить химический состав БАВ экстракта, проявившего максимально выраженную биологическую активность методами ВЭЖХ-МС, ГЖХ-МС.
Разработать методики качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в сырье и экстракционных препаратах из него.
Разработать способ получения экстракта из побегов багульника болотного, содержащего сумму флавоноидов.
Используя полученные данные, разработать проект новой ФС на побеги багульника болотного и ТУ на БАД к пище «Эрипал-Б».
Научная новизна. - Впервые проведено комплексное химико-фармакологическое исследование сибирских образцов багульника болотного, на основании которого разработаны изменения к существующей ФС на побеги багульника болотного.
Впервые выявлена антиоксидантная активность экстрактов из побегов багульника болотного, антимутагенные свойства и гепатопротективный эффект на фоне интоксикации тетрахлорметаном.
Впервые изучен химический состав экстракта из побегов багульника болотного на 40% этаноле методом ВЭЖХ-МС - установлено наличие 13-ти веществ флавоноидной природы и 2-х веществ кумариновой природы, неописанных ранее в литературе для исследуемого объекта, и описана их предполагаемая структура.
Показана целесообразность проведения стандартизации сырья и препаратов багульника болотного по содержанию флавоноидов. Разработаны унифицированные методики качественного и количественного анализа БАВ сырья, жидкого и сухого экстрактов из побегов багульника болотного.
Теоретически и экспериментально обоснована технология получения жидкого экстракта из побегов багульника болотного.
Практическая значимость.
Экспериментально обоснованы показания к использованию побегов багульника болотного в комплексном лечении ряда заболеваний.
Разработаны методики качественного и количественного анализа БАВ побегов багульника болотного с использованием метода ТСХ-анализа и дифференциальной спектрофотометрии.
Разработаны методики качественного и количественного анализа БАВ экстракта из побегов багульника болотного с использованием метода ТСХ-анализа и дифференциальной спектрофотометрии.
Разработаны проекты нормативной документации - ФС «Побеги багульника болотного» и ТУ на производство БАД к пище «Эрипал-Б».
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты исследования некоторых видов биологической активности суммарных экстрактов побегов багульника болотного.
Результаты изучения состава БАВ экстракта, обладающего максимально выраженной биологической активностью методами ГЖХ-МС и ВЭЖХ-МС.
Данные исследований по разработке подходов к стандартизации сырья и экстракционных препаратов багульника болотного.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедр фармакогнозии с курсом ботаники и экологии и химии СибГМУ и в рамках комплексной целевой программы СО АМН РФ «Здоровье человека в Сибири» (№ Гос.регистрации 01.9.2002479).
Апробация работы и публикации: Основные положения работы доложены и обсуждены на Международной научной конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002); на Ш-м конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2002).
Основное содержание диссертации опубликовано в 6 научных работах, из них 3 статьи в центральной печати и тезисы 3 докладов.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедре химии, кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, кафедре фармацевтической технологии и на кафедре микробиологии СибГМУ, а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: НИИ Органической химии СО РАН (г. Новосибирск). Сотрудникам данных подразделений и научных учреждений приносим искреннюю благодарность.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц, 40 рисунков. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методик исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, выводов, приложения и
9 списка литературы, включающего 215 источников, из которых 35 - зарубежные.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.
Сведения о химическом составе багульника болотного
В настоящее время детально изученным является эфирное масло багульника болотного, исследование которого началось ещё в 15 веке. В 1496 г Раухфус [194] получил эфирное масло из сырья багульника болотного, отметив при этом, что оно состоит из кристаллической и жидкой частей. Аптекарь Грассман [197] в 1831 г описал кристаллическую массу (стеароптен) и дал ей название "камфора багульника". Уже в 19 веке исследователи обратили внимание на разный состав эфирных масел багульника. Так, Майснер [42] кристаллической массы в нем не обнаружил. Работы конца 19 века и начала 20 века были посвящены изучению состава стеароптена. В 1883г B.Rizza [208] установил его формулу GsEbsO, а позднее стеароптен получил название ле-дола [214]. Первую структурную формулу ледола как трициклического сеск-витерпенового спирта предложил в 1949г. Н.П.Кирьялов [80]; стереохимия соединения была установлена позже [187, 210]. Известны методы количественного определения ледола в эфирном масле багульника болотного (ГЖХ) [124].
Применение физико - химических методов (различных видов хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, ИК -, УФ -, ПМР -, ЯМР ізС — спектроскопии, рентгеноструктурного анализа и др.) [88, 89, 124, 161, 188] дало возможность разделить эфирное масло багульника болотного на составляющие индивидуальные вещества и удалось идентифицировать 118 как мажорных, так и минорных компонентов.
Химический состав багульника болотного и в особенности его эфирное масло обладают выраженной химической изменчивостью в онтогенезе. Качественный состав образцов эфирного масла багульника болотного, собранного на территории Европы, практически не отличается [17, 82, 122, 123, 125, 214], в то время как сибирские и дальневосточные популяции по составу эфирных масел неоднородны [26, 28, 55, 82, 85, 204, 213].
Были выявлены четыре основных хемотипа багульника болотного, биосинтез терпенов у которых идет по выраженным биогенетическим направлениям. Первый хемотип характеризуется преобладанием терпенов ряда п - ментана и макрокомпонента лимонена (южные районы Томской обл., Курильские острова), второй - мирцена и соединений с аромадендреновым скелетом (северо-восток Томской обл., Хабаровский край), третий - наличием сабинена и др., бициклических монотерпенов (Забайкалье), четвертый - тер-пиненов и их производных - п - цимена, аскаридола (Восточная Сибирь, Камчатка, Амурская обл.) [25]. Наибольшее распространение по территории Сибири и Дальнего Востока имеет четвертый хемотип с главным компонентом п - цименом. Центром наибольшего разнообразия хемотипов багульника болотного, несомненно, являются восточные регионы, что объясняется, по-видимому, влиянием разнообразных климатических и природных факторов [23, 26].
Большинство европейских образцов багульника болотного, судя по литературным данным, относится ко второму хемотипу с макрокомпонентами мирценом, палюстролом и ледолом. Этот же хемотип произрастает в северо -восточных районах Томской области. В образцах его эфирного масла обнаружено до 31,6% палюстрола и 8,1% ледола [16, 21]. Эфирное масло багульника болотного из южных районов Томской обл. (первый хемотип), содержащее до 50% лимонена, обладает выраженным противовоспалительным действием и нетоксично, содержание в нем потенциального аллергена а — пинена - не превышает 1% [83]. Кроме эфирного масла в сырье б.болотного, по данным литературы [20, 26, 85] содержатся: полисахариды - водорастворимые полисахариды - 1,5%; пектиновые вещества 3%; флавоноиды: гиперо-зид (доминирующий компонент - около 70%), авикулярин, кверцетин, кемпферол, мирицетин, азалеатин (суммарное содержание - 2,95 ± 0,15%); кума-рины: эскулин, эскулетин, скополетин, умбеллиферон (суммарное содержание - 2,16 ± 0,1%); фенол окислоты: галловая, протокатеховая, п-оксибензойная, кофейная, п-кумаровая, о-кумаровая, феруловая, хлорогеновая (суммарное содержание - 65 мкг/ 1 г); фенологликозид арбутин - 0,45%; тритерпеновые соединения: урсоловая кислота, р-ситостерин, андромедоток-син, тараксерол, уваол; микроэлементы: марганец, медь, алюминий, серебро.
Большое разнообразие биологически активных соединений обуславливает проявление различных видов биологической активности и многогранность использования багульника болотного в народной медицине.
Методы оценки биологической активности экстрактов из побегов багульника болотного
Основным объектом исследования послужили побеги багульника болотного (Cormi Ledi palustris L.), собранные в фазу цветения и плодоношения в период с 1998 по 2003г в поселке Суйга Молчановского района Томской области.
Для проведения сравнительного исследования с целью определения показателей качества и изучения минерального состава использовали образцы сырья, собранные в различных регионах России: Приморский край, Уссурийский заповедник; Бурятия; горный Алтай (1-1,5 тыс.м.над уровнем моря); Томская область, с.Бакчар (отроги Васюганских болот).
Объектом химического и фармакологического исследований послужили экстракты, полученные из побегов багульника болотного с использованием экстрагентов различной полярности (вода, 40%-й этанол, 70%-й этанол). 2.2. Методы оценки биологической активности экстрактов из побегов багульника болотного
Скрининговые исследования биологической активности экстрактов были проведены на интактных животных и на моделях патологических состояний, которые являются широко распространенными и описанными в мировой научной литературе методами предварительной оценки БАВ.
Эксперименты были проведены на белых беспородных мышах самцах массой 18-22г и белых беспородных крысах-самцах массой 120-200г. Было использовано 600 мышей и 250 крыс. Экспериментальные животные содержались в пластмассовых клетках на древесных опилках, не более 8-10 особей на клетку, на стандартном лабораторном рационе, при свободном доступе к пище и воде в условиях естественного режима освещения.
Исследуемые соединения вводились внутрижелудочно и внутрибрю-шинно в виде суспензии на крахмальной слизи. Используемые токсиканты: тетрахлорметан 50% масляный раствор (1 мл/кг - внутрижелудочно); цикло-фосфан - 40мг/кг водный раствор (внутрибрюшинно). Анестезия - водный раствор гексабарбитала натрия 80мг/кг (внутрибрюшинно). Эвтаназия - животные умерщвлялись путем передозировки диэтилового эфира для наркоза или хлороформа.
Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные приказом МЗ СССР №755 от 12.08.77г, ФЗ «О защите животных от жестокого обращения» от 1.01.1997г, а также основанными на положениях Хельсинкского договора. Оценка острой токсичности.
Острую токсичность определяли, как рекомендовано [152], при внут-рижелудочном способе введения, на белых беспородных половозрелых мышах-самцах массой 18-22г. Суммарные экстракты и отдельные фракции вводили животным в желудок в виде суспензии на 1% крахмальном геле. Дозу исследуемых препаратов испытывали на группе из шести животных.
После введения исследуемого экстракта наблюдали за двигательной активностью и поведенческими реакциями животных. Регистрировали гибель животных. Наблюдения за животными проводили в течение двух недель после введения исследуемых экстрактов. Определяли среднюю летальную дозу LD50. Вольтамперометрический метод оценки антиоксидантной активности in vitro
Для оценки антиоксидантной активности исследуемых образцов использовали метод катодной вольтамперометрии, разработанный на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета [77, 196]. В качестве модельной реакции использован процесс электровосстановления кислорода (ЭВ02).
Данный метод измерения антиоксидантний активности основан на получении вольтамперограмм катодного восстановления кислорода с помощью полярографа или вольтамперометрического анализатора любого типа. Электрохимическая ячейка представляет собой стеклянный стаканчик с раствором фонового электролита и опущенными в него рабочим ртутно-пленочным электродом — пленка ртути на серебряной подложке, хлорид-серебряным электродом сравнения - и стеклоуглеродным вспомогательным электродом в случае использования водно-этанольных сред. В качестве фонового электролита использован ОДМ NaC104. Перемешивание раствора осуществлялось с помощью магнитной мешалки с последующим успокоением раствора.
Метод обладает хорошей чувствительностью (1(Г г/л - 10" г/л) и высокой точностью. Ошибка определения не превышает 7%.
Из глубины раствора идет диффузия кислорода к поверхности электрода. Кислород берет электрон от электрода и образуется супероксид, который мгновенно взаимодействует с протоном, вследствие чего образуется более стабильный активный радикал кислорода. На третьей стадии активный радикал кислорода вступает в реакцию с протоном, образуя перекись водорода, которая химически неустойчива и при избытке водорода превращается в воДУ
Эффективность экстрактов из багульника болотного на моделях «свободнорадикальных» патологий
Как было выше указано (раздел 3.2.), развитие многих заболеваний обусловлено активацией свободнорадикальных процессов, приводящих к повреждению клеточных структур. Соответственно, одним из путей профилактики и лечения подобных «свободнорадикальных» патологий является использование антиоксидантов [34, 66, 74, 148, 179]. Исходя из этих представлений, мы исследовали влияние экстрактов из багульника болотного, как ак тивных антиоксидантов (табл. 26, 27), на развитие химического мутагенеза и интоксикации тетрахлорметаном, в патогенезе которых существенная роль принадлежит ПОЛ. Напомним, что в механизме антимутагенного и гепато-протективного действия различных веществ синтетического и растительного происхождения существенное значение имеют их антиоксидантные свойства [13, 64, 65, 67].
Исследование антимутагенных свойств суммарных экстрактов из побегов багульника болотного проводили на модели химического мутагенеза (циклофосфан) с помощью экспресс-метода - микроядерного теста (раздел 2.2).
Внутрибрюшинное введение 40 мг/кг циклофосфана мышам сопровождается на 3-7 сутки эксперимента значительным (в 2,8-3,3 раза) повышением содержания в периферической крови эритроцитов с микроядрами (табл.5). Содержание эритроцитов с микроядрами в периферической крови мышей после внутрибрюшинного введения 40 мг/кг циклофосфана (М±т; п=10)
При этом сами экстракты багульника болотного при введении в желудок в дозе 100 мг/кг не индуцируют образования эритроцитов с микроядрами (табл.6).
Профилактическое однократное или курсовое введение в желудок мышам исследуемых экстрактов багульника болотного в форме суспензии на 1% крахмальном геле препятствует мутагенному действию циклофосфана (табл.7, 8).
Так, при однократном введении за 2 ч до инъекции циклофосфана все препараты снижали на 3-7 сутки уровень эритроцитов с микроядрами: экстракт из багульника болотного на 40% этаноле - на 37—51%, экстракт на 70% этаноле - на 38-51%, водный экстракт - на 19-43%, а-токоферол - на 37-50% по сравнению с контрольной группой животных, получавших только циклофосфан (табл.7).
Более выражен антимутагенный эффект экстрактов багульника болотного при профилактическом курсовом введении (в течение 7 дней до инъекции циклофосфана). На 3-7 сутки после введения циклофосфана на фоне применения экстракта на 40% этаноле снизилось количество эритроцитов с микроядрами в периферической крови в сравнении с животными контрольной группы, получавшими только циклофосфан, на 52-65%, на фоне применения экстракта на 70% этаноле - на 51-54%, на фоне водного экстракта - на 44—60%. а-Токоферол снижал количество эритроцитов с микроядрами на 47-61% (табл. 8).
Таким образом, все исследованные экстракты из побегов багульника болотного проявляют выраженную антимутагенную активность. Наиболее эффективным является суммарный экстракт на 40% этаноле, который в условиях профилактического 7-дневного введения, судя по показателям микроядерного теста, на 5-е и 7-е сутки после введения циклофосфана практически полностью предупреждает его мутагенное действие.
Известно, что печень, выполняя «барьерную» функцию, является основной мишенью для поражения различными ксенобиотиками, как правило, по свободнорадикальному механизму. В основе этого явления лежит так называемый «суицидный» или «летальный» окислительный метаболизм некоторых субстратов соответствующими изоформами цитохрома Р-450. К числу таких «суицидных» субстратов относится тетрахлорметан. Основным патогенетическим звеном в механизме его токсического действия является пере-кисное окисление полиеновых жирных кислот, входящих в состав мембранных фосфолипидов. При окислении тетрахлорметана в НАДФН-зависимой дыхательной цепи эндоплазматического ретикулума при участии цитохрома Р-450 образуется чрезвычайно реакционноспособный трихлорметильный радикал (СС1з"). Образование свободных радикалов и электрофильных метаболитов интенсивнее всего протекает в центральной зоне печеночных долек, где выше активность цитохрома Р-450. Повреждающее действие трихлорме-тильного радикала в конечном итоге приводит к развитию цитолиза и гибели гепатоцитов, нарушению нормального функционирования печени и всего организма [4, 5, 193, 198].
Анализ фракций после разделения экстракта на хроматографической колонке
Остаток после обработки гексаном делили на хроматографической колонке (полиамид) (раздел 2.3.). Целью колоночной хроматографии не ставилось выделение индивидуальных веществ, а лишь разделение суммарного экстракта на отдельные группы. Элюирование фенольных соединений из колонки проводили водой и этанолом различных концентраций: 20%, 40%, 70%, 80%. Фракции собирали по 8 - 10 мл и концентрировали. Контроль фракций проводили методом тонкослойной хроматографии в системе хлоро форм - этанол в соотношении 2:8; хроматограммы проявляли 5%-м раствором H2SO4 в 95% этаноле. Количество пятен и величина Rf служили основными критериями при объединении фракций. При элюировании водой было получено 29 фракций. На основании данных тонкослойной хроматографии фракции были объединены. В результате было получено 3 образца: 1 образец (фракция 1 - 5) - три пятна, Rf 1 = 0,73, Rf2 = 0,63, Rf3 = 0,53. 2 образец (фракция 6 - 11) - три пятна, Rf і = 0,44, Rf2 = 0,58, Rf3= 0,67. 3 образец (фракция 12 - 29) - два пятна, Rf 1 = 0,66, Rf2 = 0,79. При элюировании 20% этанолом были получены 32 фракции, объединенные в один образец (образец 4). 4 образец (фракции 1-32) - одно пятно , Rn = 0,79. При элюировании 40% этанолом были получены 34 фракции, объединенные в 3 образца. Фракции 1- 7 - одно пятно, Rfi = 0,79, поэтому их объединили с предыдущим образцом 4. 5 образец (фракции 8- 14) - три пятна, Rn = 0,59, Rf2 = 0,66, Rf3= 0,73. 6 образец (фракции 15- 34) - пять пятен, Rn = 0,42, Rf 2 = 0,59, Rf з = 0,66, Rf4= 0,73, Rf 5=0,76. При элюировании 70% этанолом была получена 21 фракция, объединенная в три образца. Фракции 1- 2 - одно пятно, Rn = 0,76, поэтому их объединили с предыдущим образцом 6. 7 образец (фракции 3- 9) - два пятна, Rn = 0,62, Rf2 = 0,59. 8 образец (фракции 10- 21) - три пятна, Rn = 0,59, Rf2 = 0,62, Rf3= 0,74. При элюировании 80% этанолом, полученные 14 фракций, объединили в один образец. 9 образец (фракции 1-14) - два пятна, Rfi = 0,72, Rf2 = 0,62. В полученных образцах, идентификацию веществ проводили методом ВЭЖХ-МС. На основании полученных данных (рис. 1, 2, 3, 4, 5) можно гово рить, что в исследуемом суммарном экстракте содержится не менее 120 индивидуальных веществ, не учитывая тех, которые удалены из него с помощью гексана. Из них на данном этапе исследования удалось идентифицировать 9: кверцетин; дигидрокверцетин; тетраметоксикверцетин (3 ,4 ,5,7-тетраметоксифлавонол); гиперозид; дигидрогиперозид (дигидрокверцетин-3-O-P-D-галактозид); рутин (кверцетин-3-О-рутинозид); рамнетин; мирицетин-З-О-а-Ь-арабинозид; 3,5-диметокси-4-(3-В-глюкопиранозид бензойной кислоты (глюкопиранозид триметоксигалловой кислоты). С целью уточнения полученных данных и расширения возможностей для идентификации индивидуальных веществ, нами было проведено разделение суммарного экстракта на фракции, путем последовательной обработки его гексаном, хлороформом, этилацетатом (раздел 2.2.).
ВЭЖХ-МС-анализу подвергали хлороформную и этилацетатные фракции (колонка Zorbax Rx-C18 (4.6x150mm), 0.4% НСООН-МеОН (градиент от 40 до 90% метанола с 5-ой до 10-ой минуты), 1 мл/мин. Масс-селективный детектор в режиме химической ионизации (ХИ), сканирование от 100 до 1000 m/z) (раздел 2.3.). Для идентификации были использованы некоторые стандартные образцы фенолокислот, кумаринов и флавоноидов. В качестве основных критериев при выборе предполагаемой структуры использовали время удерживания в сравнении с известными образцами, УФ-спектры и масс-спектры соответствующих пиков на ВЭЖХ, а так же базы данных и обзорные статьи по основным спектральным и физико-химическим характеристикам природных соединений [44, 98, 106, 111, 112, 151]. В идентификации флавоноидов опирались на фундаментальную монографию В.Г. Минаевой [121], на данные исследований проф. Оганесяна Э.Т. [141], проф. Бандюковой В.А. [12], Harborne J.B [190, 191], а также на обзорные и оригинальные статьи [113, 114]. Полученные ВЭЖХ хроматограммы имели различный вид в зависимости от способа детектирования (рис.6, 7, 8, 9). Так при УФ-детектировании при длине волны 290 нм имелся лишь один интенсивный пик на ВЭЖХ. В тоже время при 340 нм на хроматограмме зафиксировано существенно больше компонентов.
