Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе Кайшева Нелля Шаликовна

Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе
<
Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Кайшева Нелля Шаликовна. Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе : диссертация ... доктора фармацевтических наук : 15.00.02 / Кайшева Нелля Шаликовна; [Место защиты: Пятигорская государственная фармацевтическая академия].- Пятигорск, 2004.- 358 с.: ил.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1 Полиурониды, использование их в фармации и медицине 17

1.1 Общая характеристика антидотов и актуальные проблемы их создания и изучения 17

1.2 Общая характеристика полиуронидов 25

1.2.1 Пектины 25

1.2.2 Полисахариды ламинарии сахаристой 31

1.3' Способы получения полиуронидов 36

1.4 Методы стандартизации полиуронидов 40

1.5 Исследование продуктов взаимодействия полиуронидов с ионами металлов 43

1.5.1 Исследование взаимодействия полиуронидов с ионами металлов в растворах различными методами 45

1.5.1.1 Оптические методы 45

1.5.1.2 Метод спектроскопии ЯМР 48

1.5.1.3 Прочие методы 49

1.5.2 Исследование продуктов взаимодействия в твердом состоянии различными методами 51

1.5.2.1 Метод ИК спектроскопии 51

1.5.2.2 Термоаналитические методы 54

1.5.2.3 Методы рентгеноструктурного и рентгенофазового анализа... 56

1.5.2.4 Прочие методы 58

1.6 Биологическое действие и применение полиуронидов 59

1.7 Использование полиуронидов в качестве вспомогательных веществ при создании лекарственных форм 67

Экспериментальная часть 73

Объекты и методы исследований 73

ГЛАВА 2 Исследование химического состава водорослей, оптимизацияспособов выделения полиуронидов и изучение их физико-химических свойств 86

2.1 Сравнительный анализ водорослей Северного бассейна родов Laminaria, Fucus, Ahnfeltia 86

2.1.1 Установление подлинности сырья по морфолого-анатомичес-ким признакам и качественным реакциям 86

2.1.2 Изучение доброкачественности водорослей по числовым показателям 89

2.1.2.1 Товароведческий анализ сырья 89

2.1.2.2 Фитохимический анализ сырья 90

2.1.3 Исследование влияния факторов среды обитания, района и периода заготовки, условий сушки и хранения слоевищ ламинарии на качество сырья 92

2.2 Оптимизация способов получения полиуронидов 95

2.2.1 Разработка технологической схемы комплексного использования ламинарии с целью получения ряда биологически активных веществ 95

2.2.2 Разработка технологии полиуронидов с высоким выходом и степенью очистки 98

2.2.3 Разработка способов фракционирования полиуронидов с помощью электролитов 101

2.2.3.1 Фракционирование пектина 102

2.2.3.2 Разделение альгинатов на уроновые составляющие 105

2.2.4 Получение производных полиуронидов (2,3-дикарбокси- и

сульфопроизводные, соли с аминокислотами) 107

2.3 Изучение физико-химических характеристик полиуронидов 108

2.3.1 Изучение растворимости, вязкости, молярной массы, рН растворов, содержания золы 108

2.3.2 Изучение констант диссоциации полиуронидов 111

2.3.3 Оптимизация методики определения массовой доли функциональных групп полиуронидов 112

2.3.4 Изучение распределения полиуронидов и их со л ей 115

2.3.4.1 Изучение распределения полиуронидов в системе двух не-смешивающихся жидкостей. Определение свободной энергии Гиббса процесса распределения полиуронидов 116

2.3.4.2 Изучение распределения полиуронидов через мембраны 123

2.3.5 Определение оптического вращения полиуронидов 128

2.4 Изучение стабильности водных растворов полиуронидов 129

Выводы по главе 2 130

ГЛАВА 3 Изучение взаимодействия полиуронидов с неорганическими солями 132

3.1 Изучение взаимодействия полиуронидов с неорганическими солями в растворе 132

3.1.1 Изучение взаимодействия полиуронидов с солями методом спектрофотометрии 132

3.1.1.1 Выбор оптимальных условий спектрофотометрического анализа 132

3.1.1.1.1 Изучение зависимости оптической плотности от рН 133

3.1.1.1.2 Изучение устойчивости пектината меди (II) во времени 136

3.1.1.2 Определение соотношения реагентов и устойчивости поли-уронатов d-металлов методом Бьеррума (способ градуировоч-ных кривых) 138

3.1.1.3 Определение соотношения реагентов и устойчивости пектината меди (II) методами молярных отношений, ограниченного логарифмирования и наименьших квадратов 146

3.1.2 Кислотно-основное определение соотношения реагентов и устойчивости полиуронатов меди (II) методом Бьеррума (способ экстраполяции) 152

3.1.3 Комплексиметрическое определение соотношения реагентов и устойчивости полиуронатов металлов методом пересечения кривых 159

3.1.4 Комплексиметрическое определение соотношения реагентов в пектинатах d-металлов 171

3.1.5 Потенциометрическое определение устойчивости пектината меди (II) методом сдвига равновесия 173

3.1.6 Обобщение результатов изучения соотношения реагентов и констант устойчивости полиуронатов металлов различными методами 175

3.1.7 Изучение произведения растворимости пектината меди (II) 178

3.1.8 Изучение кинетики реакций взаимодействия пектинов с солями магния, меди (II) 182

3.2 Исследование полиуронатов металлов в твердом состоя- 186

НИИ

3.2.1 Изучение соотношения компонентов в пектинатах металлов в твердом состоянии 187

3.2.2 Определение констант обмена ионов металлов на полиурона-тах методом динамической сорбции 191

3.2.3 Изучение диализа пектинатов меди (II), железа (II), кобаль- 196 та (II)

3.2.4 Изучение связывающей способности некоторых производных полиуронидов 203

3.2.5 Исследование полиуронатов металлов методом ИК спектроскопии 206

3.2.5.1 Изучение ИК спектров пектинатов 206

3.2.5.2 Изучение ИК спектров альгинатов 215

3.2.6 Термоаналитические исследования полиуронатов металлов 220

3.2.6.1 Изучение пектинатов 220

3.2.6.2 Изучение альгинатов 226

3.2.7 Изучение полиуронатов металлов методом дифракции рентгеновских лучей 229

3.2.7.1 Изучение пектинатов 230

3.2.7.2 Изучение альгинатов 241

3.2.8 Применение метода спектроскопии ЭПР для изучения строения полиуронатов 243

Выводы по главе 3 250

ГЛАВА 4 Изучение биологической активности полиуронидов 252

4.1 Изучение слабительного действия полисахаридов ламинарии... 252

4.2 Определение острой токсичности полисахаридов 253

4.3 Изучение распределения, накопления и выведения гексуроно-вых кислот после введения полиуронидов животным 255

4.4 Исследование влияния полиуронидов на выведение катионов металлов 258

4.4.1 Изучение влияния полиуронидов на выведение естественно содержащихся в организме ионов свинца (II) и кальция 258

4.4.2 Изучение действия полиуронидов до развития свинцовой интоксикации 261

4.4.3 Изучение действия полиуронидов после развития свинцовой интоксикации 263

4.4.4 Изучение радионуклидсвязывающей активности полиуронидов 268

4.5 Исследование влияния полиуронидов на процессы биологического окисления на фоне свинцовой интоксикации 269

4.5.1 Изучение окислительного фосфорилирования, синтеза АТФ, активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени и ацетилирующей активности ферментов 269

4.5.2 Изучение реакции пероксидного окисления липидов мембран

и состояния ферментных антиоксидантов 272

4.5.3 Изучение осмотической резистентности эритроцитов, спонтанного гемолиза эритроцитов по Ягеру, гематологических показателей 278

4.5.4 Изучение процессов биосинтеза веществ 282

4.6 Изучение влияния полиуронидов на процессы метаболизма при свинцовой интоксикации 285

4.7 Изучение антигипоксического действия полиуронидов 288

4.8 Изучение влияния полиуронидов на слизистую оболочку желудка 289

Выводы по главе 4 290

ГЛАВА 5 Обоснование использования полиуронидов в качестве вспомогательных веществ в технологии лекарственных форм 292

5.1 Изучение поверхностно-активных свойств полиуронидов 292

5.2 Изучение гидрофильно-липофильного баланса полиуронидов.. 296

5.3 Исследование влияния полиуронидов на растворимость гидрофобных веществ 298

5.4 Изучение возможности использования полиуронидов в качестве мазевых основ 302

5.5 Исследование стабилизирующего действия пектинов в растворах и растительных извлечениях, содержащих кислоту аскорбиновую 305

Выводы по главе 5 309

ГЛАВА 6 Разработка лекарственных и профилактических средств на основе полиуронидов 310

6.1 Разработка полисахаридно-аминокислотного препарата «Ламинарид СБ гранулы» 310

6.1.1 Разработка технологии субстанции и гранул ламинарида СБ... 310

6.1.2 Оптимизация методик стандартизации субстанции и гранул ламинарида СБ 312

6.1.2.1 Выбор методик стандартизации для установления подлинности основных компонентов ламинарида СБ 312

6.1.2.2 Выбор оптимальных условий количественного определения восстанавливающих Сахаров в ламинариде СБ 314

6.1.2.2.1 Изучение реакции взаимодействия гидролизата ламинарида СБ с кислотой пикриновой методом добавок 315

6.1.2.2.2 Изучение кинетики реакции взаимодействия гидролизата ламинарида СБ с кислотой пикриновой 318

6.1.2.2.3 Количественное определение восстанавливающих Сахаров 320

6.1.3 Изучение стабильности препарата в процессе естественного

хранения 324

6.2 Разработка препарата «Пектин» 324

6.2.1 Разработка технологии и методов стандартизации препарата «Пектин» 324

6.2.2 Изучение стабильности препарата в процессе естественного хранения 326

6.3 Разработка препарата «Напиток «Pecto» 327

Выводы по главе 6 329

Общие выводы 330

Литература

Введение к работе

з

Актуальность темы. По данным Всемирной Федерации токсикологических центров в настоящее время наблюдается рост интоксикаций, вызванных ухудшением экологических условий и профессиональными отравлениями, что обусловило проблемы предупрежцения накопления в организме и выведения из него экзогенных токсинов, в том числе ионов тяжелых металлов.

С целью выведения катионов тяжелых металлов широко применяются различные группы антидотов, наиболее распространенными из которых являются соединения, содержащие сульфгидрильные группы, и комплексоны. Наряду с эффективностью выведения большого числа ионов металлов, использование этих антидотов имеет существенный недостаток, связанный с образованием очень прочных соединений с ионами не только токсичных, но и биогенных металлов, что приводит к дисфункции печени, почек, ретикулоэндотели-альной системы, костного мозга.

Адсорбенты в связи с малой токсичностью, незначительной способностью выведения катионов биогенных металлов используются в большей мере, чем соединения, содержащие сульфгидрильные группы, и комплексоны. Однако, адсорбенты, образуя неустойчивые соединения с ионами металлов, десор-бируют катионы металлов со своей поверхности уже в желудочно-кишечном тракте, в результате чего возникает необходимость назначения средств, ускоряющих перистальтику кишечника и эвакуацию кишечного содержимого. Поэтому требуется поиск новых высокоэффективных и биологически совместимых с организмом человека антидотов.

Основные требования, предъявляемые к выбору потенциальных антидотов, заключаются в максимальном выведении катионов токсичных металлов при сохранении содержания катионов биогенных элементов. В этом отношении перспективными антидотами должны быть полиурониды, особенно пектины и альгинаты, которые, наряду с проявляемыми физиологическими эффектами связывания катионов токсичных металлов и усиления обезвреживающей функ-

ции печени, вызывают ускорение эвакуации кишечного содержимого. Однако выпускаемые отечественной промышленностью пектины и альгинаты предназначены для пищевых и технических целей и по качеству не удовлетворяют медицинским требованиям. Лекарственным препаратом на основе альгинатов является «Ламинарид», для промышленного получения которого используется водоросль - ламинария сахаристая Дальневосточного бассейна. Ввиду того, что в Северном бассейне ламинария образует более обширные и разреженные заросли, чем в Дальневосточном бассейне, представляет интерес изучение возможности использования ламинарии Северного бассейна (СБ) для получения препарата «Ламинарид СБ».

Системных исследований, направленных на изучение физико-химических и биологических свойств пектинов, альгинатов и ламинарида, до сих пор не проводилось. Лечебно-профилактическое применение полиуронидов нуждается в серьезном экспериментальном химическом и доклиническом обосновании как в силу значительного разнообразия их строения, свойств и различного механизма взаимодействия с ионами металлов, так и в связи со слабой изученностью механизмов их лечебного действия.

Установление способности пектина и альгинатов образовывать продукты взаимодействия с катионами металлов, изучение соотношения реагентов, устойчивости и структуры полиуронатов, исследование влияния пектина и ламинарида СБ на биохимические процессы окисления для обоснования разработки эффективных лечебно-профилактических средств ускоренного выведения катионов токсичных металлов является одной из актуальных проблем фармации.

Цель и задачи исследования. Целью работы является теоретическое и экспериментальное обоснование создания и возможности использования лекарственных средств на основе пектинов и альгинатов для связывания и ускоренного выведения из организма ионов токсичных металлов.

В задачи исследований входило:

поиск перспективных источников получения альгинатов и совершенствование технологии получения альгинатов и пектина;

создание лекарственных препаратов на основе альгинатов и пектина и их стандартизация;

изучение возможности образования полиуронатов металлов в растворе и исследование их состава и устойчивости химическими и физико-химическими методами;

получение полиуронатов металлов в твердом состоянии, изучение их состава, свойств и химической структуры физико-химическими методами;

- определение общетоксического влияния полиуронидов в опытах на
крысах;

сравнительное исследование влияния пектина и ламинарида СБ на выведение катионов свинца (II) и радионуклида стронция-90;

изучение влияния пектина и ламинарида СБ на процессы биологического окисления и метаболизма на фоне интоксикации ацетатом свинца (II).

Научная новизна и теоретическая значимость работы. На основании сравнительных исследований полиуронидов и продуктов их взаимодействия (ПВ) с неорганическими солями доказано образование координационных соединений и выявлены закономерности межмолекулярного взаимодействия. Методами УФ, ИК и ЭПР спектроскопии, дифракции рентгеновских лучей, термо гравиметрии, потенциометрии, титриметрического анализа определены соотношение реагентов, устойчивость полиуронатов, их химическая структура, характер связей, геометрия кристаллитов, конфигурация металлоцентров.

Показано, что при взаимодействии пектина и альгината натрия с ионами меди (II) образуются продукты с соотношением ион металла : структурное звено полиуронида 1:1, 1:2 и 1:1, 1:2, 1:3 соответственно. В результате взаимодействия полиуронидов с ионами других металлов (II) образуются ПВ со стехио-метрическим отношением реагентов 1:2. Относительно устойчивые ПВ с ионами металлов образуют как полиурониды, так и олигоурониды. Пектинаты ме-

таллов являются более устойчивыми соединениями, чем альгинаты. Установлено, что при координации катионов металлов электронодонорными атомами ли-гандов являются атомы кислорода карбоксильных, гидроксильных групп, пира-нозных циклов полиуронидов, а также атомы кислорода молекул воды. Ионы металлов, кроме меди (II), образуют с карбоксильными группами полиуронидов симметричные структуры (карбоксильные группы являются бидентатными ли-гандами), а ионы меди (II) образуют несимметричные структуры (карбоксильные группы являются монодентатнымилигандами). Определены конфигурации металлоцентров: октаэдрическая в альгинате меди (II), искаженный квадрат в пектинате меди (II), тетрагональная пирамида в полиуронатах хрома (III), би-пирамида в полиуронатах марганца (II). Координационное число (к. ч.) ком-плексообразователей составляет 4, кроме ионов хрома (III) (к. ч. 5) и ионов меди (II) в альгинате меди (II) (к. ч. 6).

Эффективность связывания катионов металлов в биологических тканях в первую очередь определяется избирательностью распределения антидотов. В результате предварительного исследования распределения полиуронидов из воды в слой октанола установлено, что концентрация пектина в неполярном растворителе в 15 раз превышает концентрацию альгината натрия. Эта закономерность подтверждена в опытах по определению содержания гексуроновых кислот в липидонакапливающих тканях крыс после введения полиуронидов: во всех исследованных тканях концентрация кислот в результате введения животным пектина была выше, чем после введения ламинарида СБ.

Установлено, что пектин и ламинарид СБ ускоряют выведение катионов тяжелых металлов до и после развития интоксикации ацетатом свинца (II) и радионуклидом стронций-90. При этом профилактический эффект полиуронидов превышает лечебное действие на 12,5-19%. Показано, что полиурониды способствуют ускорению выведения естественно депонированных ионов свинца (II), сохраняя содержание катионов кальция в биологических тканях.

В опытах на животных впервые выявлено нормализующее влияние поли-уронидов на измененные процессы биологического окисления при интоксикации ацетатом свинца (II). Путем определения биохимических и гематологических показателей установлено антигипоксическое, антиоксидантное, мембрано-стабилизирующее действие пектина и ламинарида СБ.

Результаты изучения взаимодействия пектина и альгината натрия с ионами металлов являются обоснованием разработки профилактических и лекарственных средств детоксического действия на основе полиуронидов.

Новизна исследований подтверждена 7 авторскими свидетельствами СССР, 14 патентами РФ и 1 положительным решением на выдачу патента РФ.

Практическая значимость результатов исследования заключается в том, что в результате установленной способности полиуронидов связывать ионы металлов, на основе пектина и альгинатов предложены средства для профилактики и лечения интоксикаций соединениями металлов. Разработан лекарственный препарат «Пектин», на основе которого предложена биологически активная добавка «Напиток «Pecto». На основе альгинатов разработан лекарственный препарат «Ламинарид СБ», лекарственной формой которого являются гранулы.

С целью оптимизации технологии пектина разработаны способы его вихревой и электроразрядной экстракции из свекловичного жома. В процессе изучения взаимодействия пектина с ионами металлов показано, что под действием 25% раствора сульфата магния пектин можно фракционировать по степени полимеризации; это в дальнейшем использовалось для исследования устойчивости и состава олигогалактуронатов и моногалактуроната меди (И).

В результате совершенствования технологии ламинарида СБ предложена технологическая схема комплексной переработки сырья ламинарии сахаристой с целью получения липидно-минеральной фракции (смолки), маннита, мине-рально-аминокис лотной фракции (спиртового экстракта), ламинарана и фу-коидана, альгината натрия и пищевых волокон. При этом оптимизирован способ обогащения альгината натрия фракцией полигулуроновой кислоты, осно-

ванный на экстракции оксалатом натрия, растворении в растворе хлорида калия и деминерализации.

Степень внедрения. Утверждена ВФС «Пектин» (ВФС 42-3433-99, регистрационное удостоверение № 99/363/10 от 08.10.99). Разрешен промышленный выпуск пектина для медицинских целей в качестве вспомогательного вещества для приготовления лекарственных форм. В связи с истечением срока действия ВФС «Пектин», подготовлен проект ФСП «Пектин» и пояснительная записка к нему, которые переданы ОКТБ «Марс» (г. Нальчик) для направления в Департамент государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ с целью перерегистрации лекарственного препарата «Пектин». Получены акты внедрения технологии и стандартизации пектина от ОКТБ «Марс».

Проекты ФСП «Ламинарид СБ» и «Ламинарид СБ гранулы», пояснительные записки к ним переданы в Департамент государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ и рекомендованы Фармакопейным Государственным комитетом МЗ РФ к утверждению (исх. номер 3127 от 06.10.2003, от 05.04.2004). Получены акты внедрения технологии и стандартизации «Ламинарида СБ» и «Ламинарида СБ гранулы» от ООО «НТЦ Экобио-тек — Мурманск» и ОАО «Московская фармацевтическая фабрика».

Утверждены ТУ «Напиток «Pecto» (ТУ 9185-011-01962942-97). Получены акты внедрения технологии и методов стандартизации БДД «Напиток «Pecto» от ОКТБ «Марс» (г. Нальчик). Получено заключение о перспективности использования БДД «Напиток «Pecto» в медицинской практике от инфекционной больницы г. Пятигорска, центра инфекционных болезней КБР (г. Нальчик).

Утверждены ТУ «Жом из корнеплодов сахарной свеклы для производства пектина» (ТУ 9112-026-01962492-99). Получен акт внедрения методов стандартизации жома от ОКТБ «Марс» (г. Нальчик).

Разработанные методические рекомендации по использованию в лечебно-профилактических целях пектинов, альгинатов и средств на их основе утвер-

9 ждены в ОКТБ «Марс» (г. Нальчик), НИИ биотехнологии и сертификации пищевых продуктов Кузбасского центра здорового питания (г. Кемерово) и ОАО «Гидрометаллургический завод» (г. Лермонтов). Получены акты о внедрении использования средств на основе полиуронидов от Кузбасского центра здорового питания, ООО «Импресс» (г. Пятигорск).

Получены акты внедрения технологии вихревой, электроразрядной экстракции пектина, медицинского очищенного пектина и гемицеллюлоз от ОКТБ «Марс» (г. Нальчик).

По решению центрального методического совета ПятГФА изданы методические указания для преподавателей и методические указания для студентов «Координационные соединения с ионами металлов». Получены акты внедрения методических указаний в учебный процесс кафедры неорганической химии ПятГФА и кафедры химических дисциплин Пятигорского государственного технологического университета.

Положения, выдвигаемые на зашиту:

обоснование использования слоевищ ламинарии сахаристой Северного бассейна для получения ламинарида СБ и разработка профилактических и лекарственных препаратов на основе полиуронидов;

результаты исследования условий образования, состава и устойчивости пектинатов и альгинатов металлов [магния, кальция, свинца (II), меди (II), цинка, кадмия, марганца (II), кобальта (II), никеля (II)] в растворе;

результаты изучения физико-химических свойств, состава и химического строения пектинатов и альгинатов металлов [натрия, калия, магния, кальция, свинца (II), меди (II), цинка, кадмия, хрома (III), марганца (II), железа (II), кобальта (II), никеля (II)] в твердом состоянии;

- использование теоретических предпосылок для экспериментального
изучения распределения, накопления гексуроновых кислот и результаты иссле
дования влияния полиуронидов на ускорение выведения катионов токсичных
металлов и содержание катионов кальция в тканях крыс;

- результаты исследования влияния полиуронидов на основные биохимические процессы и функциональное состояние биологических тканей при свинцовой интоксикации.

Апробация работы. Фрагменты диссертации докладывались и обсуждались на международных научно-практических конференциях (Москва, 2003; Воронеж, 1992, 2003), Всероссийской научно-практической конференции (Орел, 2003) и 5 региональных научных конференциях по проблемам фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 1999 - 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, в том числе 1 монография; 7 авторских свидетельств, 14 патентов, 1 положительное решение на выдачу патента.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ПятГФА (номер государственной регистрации 01.2001.12857) в рамках проблемы «Фармация» секция № 38 Ученого совета МЗ РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 369 стр., состоит из введения, обзора литературы и пяти глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 80 рисунками и 93 таблицами. Библиография имеет 343 наименования, из которых 121 на иностранных языках.

Исследование взаимодействия полиуронидов с ионами металлов в растворах различными методами

В растворах полиуронидов существенна роль ассоциации. Цепные макромолекулы кислых полисахаридов содержат десятки и сотни звеньев, способных к образованию дипольных связей. Если средняя энергия взаимодействия молекул полимера между собой больше средней энергии их взаимодействия с растворителем и энергии теплового движения, то образующиеся и распадающиеся в растворе ассоциаты цепных макромолекул превращаются в устойчивые ассоциаты с низкой растворимостью. Чем больше звеньев в полиуронидной цепи, обладающей ограниченной гибкостью, тем больше точек контакта и возможности образования межмолекулярных связей. Как энергия взаимодействия растворенных полиуронидных молекул друг с другом, так и энергия сольватации зависят в основном от степени этерификации функциональных групп полиуронидов, содержания в их молекулах свободных карбоксильных групп и от степени замещения атомов водорода карбоксильных групп катионами металлов.

Пектины в водных растворах обладают способностью к светорассеянию, интенсивность которого определяется не величиной молекул, а размером находящихся в растворе молекулярных ассоциатов [1, 201, 225].

Водные растворы свекловичного пектина в зависимости от рН среды имеют различную оптическую плотность. Обнаружено [225], что оптическая плотность растворов пектина достигает максимального значения в сильнокислой среде и минимальной величины при рН 12-43. При рН 13 происходит сильное увеличение оптической плотности в связи с начавшимся процессом образования студня. При различных значениях рН, даже при рН 12-НЗ, где агрегация либо минимальна, либо отсутствует, изменение оптической плотности пектинов сопровождается изменением содержания этерифицированных карбоксильных групп. Исследователи [225] приходят к выводу о том, что оптическая плотность пектиновых растворов обусловлена свободными карбоксильными группами и находится в прямой зависимости от содержания этих групп, т.е. оптическая плотность определяется не межмолекулярными, а внутримолекулярными параметрами пектина. Установленная закономерность проявляется в растворах пектина с концентрацией от 0,1 до 1,0%, т.е. от самых низких концентраций, при которых еще можно различить колебания оптической плотности и при которых отсутствует агрегирование, до самых высоких концентраций, соответствующих практически насыщенным растворам.

Пектиновые растворы оптически активны, вращают плоскость поляризованного света вправо [242].

Для изучения стереохимии природных углеводов в последнее время стал использоваться метод дисперсии оптического вращения (ДОВ) [135]. Анализ кривых ДОВ альдобиуроновых кислот показывает наличие положительного эффекта Коттона с максимумом при 225 нм и минимумом при 195 нм, пересечение кривой ДОВ с нулевой линией оптического вращения наблюдается при 210 нм. Эффект Коттона может быть отнесен к п— п переходу карбоксильной группы, поглощающей около 210 нм. В соответствии с правилом октантов положительный знак эффекта Коттона обусловлен экваториальным расположением карбоксильных и карбоксиметильных групп в пираноз-ных циклах с конформацией кресла 4Q (D). Кривые ДОВ сложных эфиров ме-тилгликозидов альдобиуроновых кислот, так же как удельные оптические вращения при D-линии натрия, имеют положительный знак. Свободные аль-добиуроновые кислоты (галактобиуроновая, глюкобиуроновая и др.) обладают отрицательным удельным вращением, абсолютная величина которого возрастает до области « 260 нм, где начинает сказываться влияние оптически актив зоного хромофора. Разный знак оптического вращения альдобиуроновых кислот и соответствующих сложных эфиров метилгликозидов может быть связан с заметным вкладом положительного вращения а-аномера, который доминирует в эфирах метилгликозидов. Амплитуды эффекта Коттона указанных альдобиуроновых кислот близки по величине; карбоксиметильная группа дает более интенсивное поглощение, чем карбоксильная.

Оптическое вращение полисахаридов в воде рассматривается как результат двух вкладов, обусловленных первичной и четвертичной (надмолекулярной) структурой цепей. Хирано [135] дал сравнительную оценку оптических свойств полисахаридных цепей в воде и растворах с добавкой кислоты хлористоводородной, гидроксида натрия, мочевины, гуанидина хлоргидрата (в растворах двух последних соединений надмолекулярная структура полисахаридов полностью разрушалась). Анализ кривых ДОВ пектиновой кислоты в воде и в растворе мочевины показал, что в растворе мочевины вследствие разрушения внутримолекулярных водородных связей в макромолекуле, стабилизирующих спиральные структуры, полисахаридные цепи принимают конфор-мацию клубка, вклад которой в оптическое вращение ничтожно мал.

Полиурониды трудно поддаются кислотному гидролизу, для проведения которого требуются жесткие условия (низкая рН среды, длительное нагревание, иногда под давлением), следствием чего является декарбоксилирование и Р-элиминирование полигалактуроновой кислоты [65, 123]. Объяснение трудности гидролиза за счет индукционного эффекта атома кислорода карбонильной группы, перемещающего электроны от гликозидного кислорода [69], вряд ли реально, т.к. индукционный эффект должен передаваться через три связи и он должен быть незначительным. Скорее всего, трудность гидролиза связана с влиянием сильных межмолекулярных взаимодействий.

Установление подлинности сырья по морфолого-анатомичес-ким признакам и качественным реакциям

Некоторые исследователи [50, 261] указывают на связь между защитным действием пектинов и альгинатов и их коллоидными свойствами. Ряд ученых [267] придерживается мнения, что не сами полиурониды, а продукты их расщепления в сочетании с другими соединениями обладают действием антидотов. При этом некоторые исследователи [192] считают неэффективными моноуроновые кислоты для ингибирования всасывания катионов тяжелых металлов. В ряде публикаций [120, 133, 181, 188, 315] терапевтический эффект пектинов и альгинатов связывается с комбинированным действием механических и химических факторов: полиурониды, попадая в ЖКТ, образуют студни; при этом разбухшая масса полиуронидов, продвигаясь по кишечнику, захватывает токсины. Вместе с тем, в результате метаболизма пектинов и альгинатов образуются олиго- и моноуроновые кислоты, которые связывают токсины в кишечнике.

По мнению некоторых ученых [25, 33], связывание полиуронидами ионов тяжелых металлов интенсивнее происходит в кислой среде желудочного сока (рН 1,8+2,2) по сравнению со слабощелочной средой кишечного содержимого. Другие исследователи [34, 194] считают, что слабощелочная реакция кишечного содержимого создает условия для более интенсивного взаимодействия за счет деэтерификации полиуронидов.

Наряду с этими данными в литературе приведены результаты изучения влияния пектинов на содержание катионов свинца (И) и стронция в костной ткани и печени [33, 134]. Установлено, что ежедневное введение в течение трех недель пектина в возрастающей дозе (от 200 до 2200 мг/кг) крысам приводит к снижению содержания катионов свинца (II) примерно до двух раз. Показано, что действие пектина как антидота ионов свинца (II) эффективно как при пероральном введении животным ацетата свинца (II), так и при введении его в виде аэрозоля.

Основное токсическое влияние катионов свинца (II) проявляется в развитии различных видов анемии и ингибировании ферментных систем [68]. Поэтому исследователями [181] были поставлены опыты по использованию при свинцовых интоксикациях животных в качестве защитных средств неорганических солей кобальта (II) и меди (И). Установлено, что неорганические соли кобальта (II) и меди (И) на фоне свинцовой интоксикации нормализуют уровень гемоглобина и эритроцитов, не влияя при этом на содержание сульфгидрильных групп и активность ферментов. Комплексное использование пектина и солей меди (II) или кобальта (II) в качестве антидотов при отравлении ацетатом свинца (II) оказалось менее эффективным, чем неорганических солей кобальта (II) и меди (II), что, по-видимому, объясняется образованием более прочных пектинатов кобальта (II) и меди (И) в сравнении с пектинатом свинца (II). В этой связи интересными были бы данные о влиянии полиуронидов, а не их смесей с солями, на указанные биохимические показатели на фоне свинцовой интоксикации.

В ряде публикаций [50, 120, 133, 181, 188, 192] сообщается о влиянии полиуронидов на связывание и ускорение выведения из организма животных ионов кобальта (II), ртути (II), кадмия, магния, железа (II) и радионуклидов (железа-59, кобальта-60, стронция-90). Показано, что оптимальной дозой полиуронидов при профилактике интоксикаций является доза 100-150 мг/кг, а при лечении - 400 - 600 мг/кг. Установлено, что выведение катионов тяжелых металлов происходит в основном с фекалиями. При этом степень выведения стронция-90 пектинами выше по сравнению с контролем на 88%, железа-59 - на 16%, кобальта-60 - на 9%. Имеются данные [25, 26] об ускорении выведения катионов f-металлов пектовой кислотой. В результате сравнения детоксических свойств альгинатов отечественного и импортного производства показано [133], что первые по своей активности в 20 - 25 раз менее эффективны импортных, что объясняется высоким содержанием ионов поливалентных металлов и высоким значением величины MIG [133, 173, 311, 317]. В связи с этим возникает проблема оптимизации технологии получения альгинатов с выраженными детоксическими свойствами путем деминерализации и обогащения альгинатов остатками полигулу-роновой кислоты.

Из препаратов, содержащих пектины и альгинаты и применяющихся в качестве антидотов при отравлениях тяжелыми металлами, известны магния галактуронат, манукол, альгисорб [133, 188, 216], из которых два первых препарата выпускаются и применяются за рубежом.

В последнее время большой популярностью пользуются биологически активные добавки, созданные на основе экологически чистых пектинов или морских водорослей и предназначенные для выведения из организма радионуклидов, токсинов, а также регуляции нарушенного обмена веществ и оздоровления населения, проживающего в загрязненных радионуклидами и токсинами регионах. К таким добавкам относятся витапектин (гранулированный порошок) и фитосорбент (гелеподобный раствор), созданные на основе фруктового пектина, антиоксидантов и витаминов [102], а также смеси галактуро-натов s- или d-металлов с пектином, растительными волокнами, олиго- и по-лигалактуроновыми кислотами (суспензии и порошки) [37, 252, 263].

Выбор оптимальных условий спектрофотометрического анализа

Концентрацию ацетата меди (II) в растворе определяли методом ком-плексиметрического титрования [223], раствора альгиновой кислоты - методом кислотно-основного титрования с помощью 0,02 моль/л раствора гидро-ксида кальция с потенциометрической индикацией точки эквивалентности. Определение объема титранта (VT) в точке эквивалентности проводили дифференциальным методом [220]. После смешивания концентрация растворов ацетата меди (II) составила 1,67 10"4 моль/л, альгиновой кислоты (0,54ч-2,69)- 10"2 моль/л. Ни в одном из растворов после установления равновесия не образовалось нерастворимых ПВ.

Равновесную концентрацию альгиновой кислоты в растворе определяли методом кислотно-основного титрования аналогично определению исходной концентрации кислоты.

По полученным статистически достоверным данным (п = 7) вычисляли значения функций образования, приведенные в таблице 25.

В соответствии с рисунком 34, отсекаемый на оси ординат отрезок численно равен 28,8 105. Значит, ПВ в соотношении ионы меди (II) : альгиновая кислота 1:3 имеет константу устойчивости ft 1,5 10 л/моль (/g/?7,18).

Таким образом, ионы меди (II) при взаимодействии с альгиновой ки-слотой в водном растворе образуют три ПВ в соотношении 1:1 (ft 4,5 10 л/моль, lg 02,65), 1:2 (ft 9,9 " Ю4 л/моль, lg р 5,00), 1:3 (ft 1,5 107 л/моль, /g/?7,18).

Аналогично альгинату меди (II) изучали соотношение компонентов и устойчивость пектината меди (II). Для проведения исследования готовили растворы пектина и ацетата меди (II) с концентрациями 5,5 10 4 и 1 10 3 моль/л соответственно. Раствор ацетата меди (II) объемом 5 мл смешивали с различными объемами раствора пектина (от 5 до 50 мл), прибавляли воду до одинакового общего объема растворов и оставляли на сутки для установления равновесия в системе. Ни в одном из растворов не выпал осадок. Исходную концентрацию ацетата меди (II) определяли методом комплексиметри-ческого титрования [223], исходную и равновесную концентрацию пектина-методом кислотно-основного титрования с помощью раствора гидроксида кальция с потенциометрической индикацией точки эквивалентности [177].

При экстраполяции полученной зависимости на нулевое значение равновесной концентрации пектина установлено, что /?; 0, это свидетельствует об отсутствии в растворе ПВ в соотношении ионы меди (II): пектин 1:1.

Отсекаемый на оси ординат отрезок, в соответствии с рисунком 36, равен 1,3- 107, а в соответствии с рисунком 37, равен 40- 1010. Следовательно, образующийся в растворе ПВ в соотношении ионы меди (II) : пектин 1:2 имеет 8,8- 107 л/моль (lg/?7,94), ПВ в соотношении 1:3 отсутствует (fl3 0).

Метод пересечения кривых позволяет получить надежные результаты изучения состава и прочности комплексов, если состав комплексов в исследуемых растворах остается постоянным. Данный метод используется для изучения как одноступенчатого, так и многоступенчатого комплексообразо-вания, однако, необходимым условием в последнем случае является доминирование в сравниваемых растворах комплекса одинакового состава [224].

По условиям опыта известны начальные концентрации ионов металла (См) и полиуронида (CL) в исследуемых растворах. Равновесную концентрацию катионов металла [Щ определяли методом комплексиметрического титрования [223]. Из этих данных можно вывести выражение константы устойчивости ПВ:

В выражении (44) содержится два неизвестных: /3 и N, которые находили, используя метод пересечения кривых в графическом варианте [25, 26, 224]. Исследование устойчивости ПВ полиуронидов с ионами металлов проводили с деэтерифицированными и деминерализованными полиуронидами.

Для проведения исследования смешивали растворы альгината натрия и ацетата меди (II). Концентрации альгината натрия (в пересчете на структурное звено) и ионов меди (II) после смешивания растворов составили соответственно (3,0-f-7,0)- Ю"3 и 2,0- 10"4 моль/л. Для установления равновесия в системе растворы с образовавшимися осадками выдерживали в течение суток, после чего осадки отделяли фильтрованием через бумажные фильтры «синяя лента». Равновесную концентрацию катионов меди (II) определяли в фильтратах методом комплексиметрического титрования [223].

Найденные величины исходных концентраций катионов меди (II) и аль-гината натрия, равновесной концентрации катионов меди (II) подставляли в уравнение (44), задавая неизвестному N ряд значений. По вычисленным значениям /? в графической системе lg Р — f (N) строили кривые зависимости. Аналогичным образом производили вычисления и построение кривых для растворов с иными концентрациями реагирующих веществ. При этом на графиках получались прямые. Статистически достоверные данные (п = 7) для определения констант устойчивости альгината меди (II) приведены в таблице 27. Таблица 27 - Данные для вычисления ft (л/моль) альгината меди (II)

В соответствии с рисунком 38, все три прямые общей точки пересечения не имеют, значит, взаимодействие альгината натрия с ионами меди (II) имеет ступенчатый характер. В этом случае можно определить доминирование в сравниваемых растворах продуктов одинакового состава [224]. В области N= 1 прямые не пересекаются, что свидетельствует об отсутствии ПВ в соотношении реагентов 1:1. Точки пересечения прямых, в соответствии с рисунком 38, находятся вблизи значений N между 2 и 3. Поскольку линии пересекаются под таким острым углом, что надежное определение констант устойчивости становится затруднительным, то нами построен график зависимости, где по одной оси ординат отложены значения Ig /Г, а по другой - Ig (/Г//?") (где /Г и /Г - константы устойчивости, вычисленные для первого и второго растворов при различных значениях N). При этом прямая, выражающая зависимость Ig {(31(3") от N, пересекает ось абсцисс в точке, указывающей соотношение реагентов в ПВ. Перпендикуляр, восстановленный из этой точки до пересечения с прямой, выражающей зависимость Ig (3 от N, дает значение логарифма константы устойчивости ПВ в первых двух растворах.

Исследование влияния полиуронидов на процессы биологического окисления на фоне свинцовой интоксикации

Целью исследования явилась сравнительная оценка некоторых производных полиуронидов по связывающей способности в отношении катионов свинца (II).

Поскольку пектины, вводимые в организм в лечебно-профилактических целях, могут контактировать с различными аминосоединениями, изучено влияние этих соединений на связывающие свойства пектина по отношению к ионам свинца (II). Кроме того, изучена связывающая способность пектина, альгиновои кислоты и ее составляющих (полиманнуроновой и полигу-луроновой кислот), а также сульфопектина и окисленных полиуроновых кислот: 2,3-дикарбоксипектовой, 2,3-дикарбоксиальгиновой кислот.

Связывающую способность (С, мг РЬ2+/г) полиуронидов и их производных определяли методом комплексиметрического титрования [223]. Статистически достоверные результаты исследования (п = 7) связывающей способности производных полиуронидов представлены в таблице 48.

Полученные результаты свидетельствуют о наиболее выраженных свя зывающих свойствах по отношению к ионам свинца (II) из всех исследованных производных 2,3-дикарбоксипектовой и 2,3-дикарбоксиальгиновой кислот. Можно предположить, что именно эти производные могут наиболее эффективно связывать ионы тяжелых металлов в нерастворимые соединения и выводить их из организма при отравлениях.

Относительно невысокая связывающая способность производственных образцов пектина и альгината натрия обусловлена низким содержанием свободных карбоксильных и гидроксильных групп. Из двух составляющих компонентов альгиновой кислоты более выраженная способность к связыванию катионов свинца (II) наблюдается у полигулуроновой кислоты.

В присутствии аминосоединений связывающая способность пектина резко снижается, особенно в присутствии 6-аминоурацила, DL-p-фенил-а-аланина и DL-лизина гидрохлорида. Несмотря на то, что а-аминокислоты (к числу которых не относится 6-аминоурацил) с катионами тяжелых металлов образуют внутрикомплексные соли [10], и следовало бы ожидать увеличения количества связанных ионов свинца (II) производными пектина, последнее не произошло, возможно, вследствие блокирования карбоксильных групп пектина аминогруппами аминосоединений.

Для предварительной оценки связи пектина и аминокислот мы провели хроматографическое исследование 0,1% водных растворов аминокислот и водных растворов, содержащих по 0,1% аминокислоты и 0,5% пектина (растворы были выдержаны в течение суток при комнатной температуре). На хроматограммах обнаруживались пятна, характерного для аминокислот цвета: розово-фиолетового - для триптофана, фенилаланина и метионина, оранжевого цвета - для лизина гидрохлорида. При равной концентрации аминокислот в растворах без пектина и в присутствии пектина площадь пятен была различной, а значения R/ примерно одинаковыми. Статистически достоверные данные хроматографического анализа (п=7) приведены в таблице 49.

Полученные результаты показывают, что площадь пятен аминокислот в присутствии пектина меньше площади пятен свободных аминокислот. По-видимому, это обусловлено тем, что аминокислоты, частично связанные пектином, не способны к распределению. Возможно, что пятна меньшей площади образуют аминокислоты, не вступившие во взаимодействие с пектином.

Таким образом, учитывая возможность снижения связывающей способности пектина в присутствии аминокислот в условиях in vivo, необходимо соответственно увеличивать принимаемые дозы пектина.

В отличие от электронных спектров поглощения, колебательные спектры углеводов в большинстве случаев состоят из большого числа дискретных линий и полос, появление которых связано с наличием в молекулах тех или иных атомных группировок. Поэтому по самой своей природе ИК спектры могут нести важную информацию о строении полиуронидов и полиуронатов. Объектами исследования были наблюдаемые сдвиги полос поглощения, изменение интенсивности полос поглощения и энергии водородных связей. Характерные полосы поглощения в ИК спектрах пектина и пектинатов (п = 7) приведены в таблице 50.

Наиболее характерная спектральная область, в которой заметно наблюдаются различия в характере и интенсивности полос поглощения в ИК спектрах пектина и пектинатов, относится к диапазону 3400 -3100 см-1, эта область относится к валентным колебаниям гидроксильных групп. Наряду с указанной областью, для полиуронатов наблюдалось поглощение в более длинноволновой области, что характерно для двухцентровых донорно-акцепторных водородных связей гидроксила с замещенным гидроксилом [135].

Похожие диссертации на Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе