Введение к работе
Актуальность темы, Перспективы промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений привлекают все большее внимание исследователей. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. 25% всех применяемых лекарственных средств содержат соединения растительного происхождения. Если приплюсовать к этому потребности парфюмерии, пищевой нромыш — ленности, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантировано получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения 3 достаточном количестве.
Широкое использование шиконина в медицинской практике, пищевой и парфюмерной промышленности предполагает поиск источников этого красного пигмента, обладающего к тому же антимикробными, противовоспалительными, ранозаживлятощими и противоопухолевыми свойствами. Шиконин может быть получен КЗ корней растений семейства Boraginaceae (виды родов Arnebia, Lithospermum, Ouosma, Echium и др.), однако запасы дикорастущего сырья во всем мире ограничены, а работы по интродукции видов, содержащих это биологически активное соединение, не привели к желаемым результатам.
Высокий спрос на природные красители, обладающие к тому же антимикробными свойствами, для парфюмерной и пищевой промышленности, текстильного производства, а также для медицинских препаратов стимулировал исследования по разработке биотехнологических приемов получения шиконина.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было фармакогностическое и биотехнологическое исследование культуры ткани — источника красящих антимикробных препаратов и разработка условий ее выращивания, необходимых для промыш — ленного получения биомассы.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить особенности роста и синтеза производных ши — конина культур тканей арнебии красящей Arnebia euchroma (Royle) Johnst. и воробейника краснокорневого Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. при поверхностном и глубинном методах выращивания.
2. Провести селекционные исследования в культурах тканей
а. красящей и в. краснокорневого и получить высокопродуктивные
штаммы.
3. Установить особенности питания культур — продуцентов
шщсонина и разработать питательные среды для их выращивания,
способствующие максимальной продуктивности, исследовать
возможность замены дорогостоящих компонентов питательных
сред с целью снижения себестоимости конечного продукта.
4. Дать фотохимическую характеристику биомассы культуры
ткани, полученной на основе высокопродуктивного штамма.
-
Провести морфолого— физиологическое, анатомическое изучение, установить товароведческие показатели и разработать проект ГОСТ на новый вид сырья.
-
Изучить возможность использования шиконина в лекарственных и косметологических формах, установить спектр антимикробных свойств шиконина, выделенного из культур растительных тканей, и его препаратов.
Научная новизна. Впервые изучена динамика накопления производных шиконина в процессе роста культуры ткани а. красящей на агаризованной и жидкой питательных средах, и установлена зависимость между скоростью поглощения клетками основных компонентов среды и активностью процессов прироста биомассы и биосинтеза нафтохиноновых пигментов.
Разработаны питательные среды, способствующие высокой продуктивности культур тканей а. красящей и в. краснокорневого, предложены дешевые заменители некоторых компонентов питательных сред (сахарозы, агара).
С учетом физиологических особенностей культур проведены селекционные исследования, предприняты методические подходы, обеспечившие успех в получении высокопродуктивного штамма.
Изучены анатомические, физиологические и фотохимические характеристики сырья, полученного на основе штамма культуры ткани а. красящей, установлены числовые показатели, регламентирующие его качество. Изучена внутриклеточная локализация процессов биосинтеза и накопления нафтохиноновых пигментов в тканях а. красящей.
Установлен спектр микроорганизмов, чувствительных к шиконину, полученному из культивируемых клеток а. красящей.
Впервые исследована совместимость шиконина с наиболее часто используемыми компонентами мягких лекарственных и косметологических форм.
Теоретическая и практическая значимость. Впервые выявлен комплекс биотехнологических особенностей и закономерностей клеток а. красящей и в. краснокорневого.
Для разработки питательной среды в качестве теоретической основы была взята гипотеза АГ.Воллосовича о возможности эффективной утилизации клетками концентрированных растворов углевода. Выбранная нами стратегия разработки питательной среды позволила в короткие сроки создать питательную среду, в которой, благодаря высокой концентрации сахарозы и соотношению элементов питания, были, вероятно, смоделированы условия корневого метаболизма а. красящей, т.к. в клетках биомассы содержание шиконина достигало уровня его содержания в корнях растения.
Установлены общие закономерности влияния отдельных факторов питания на продуктивность тканей а. красящей и в. краснокорневого, по — видимому, отражающие близость путей биосинтеза шиконина в культурах. Эти данные свидетельствуют о возможности управления процессами синтеза кафтохиноновых пигментов in vitro путем изменения состава питательных сред и условий культивирования.
В результате электронномикроскопического исследования растущей биомассы а. красящей было установлено, что нафто — хиноновые пигменты синтезируются на мембранах эндоплазма — тического ретикулума, а затем транспортируются из клеток и накапливаются на наружной поверхности клеточных оболочек. Этот факт является теоретической предпосылкой к разработке соответствующих способов выращивания культуры.
Показана возможность использования различных моделей селекции и их эффективность для получения высокопродуктивных штаммов растительных клеток, синтезирующих производные шиконина.
Получен штамм культуры ткани а. красящей, продуктивность которого позволяет рекомендовать его к промышленному использованию, и найдены условия выращивания, гарантирующие стандартность данного вида сырья.
Дана полная фармакогностическая характеристика нового вида лекарственного сырья, которая включена в разработанный проект ГОСТ "Биомасса культуры ткани арнебии красящей".
Проведен фитохимическин анализ сырья, установлен состав нафтохиноновой фракции и соотношение отдельных пигментов в сумме нафтохннонов.
Разработана методика количественного определения производных шиконина, характеризующаяся высокой точностью и позволяющая значительно снизить временные затраты на проведение анализа.
Отработана методика выделения препарата "шиконин" из нового вида сырья иутем гидролиза сложных эфиров шиконина в щелочной среде и последующего осаждения пигментов минеральной кислотой. Проведен качественный и количественный анализ препарата.
Даны практические рекомендации по использованию вспомогательных веществ для приготовления мягких лекар — ственнных и косметологическия форм с шиконином, способствующие максимальному проявлению его антимикробной активности.
Апробапня работы. Основные результаты исследований докладывались на V — й конференции молодых ученых Ботанического института им. ВЛ.Комарова РАН (Санкт-Петербург, май 1994), Всероссийской конференции "Химия и технология лекарственных средств" (Санкт-Петербург, нюнь 1994), научной конференции, посвященной 50—летию НИИ фармации (Москва, 1994), VIII Международном конгрессе по культуре растит ачьных тканей и клеток (Флоренция, 1994).
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно — исследовательских работ Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института по проблеме "Фармация" межведомственного научного совета №47.
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 188 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 34 таблицы, приложение. Список литературы включает 252 источника, из них 141 иностранных авторов.
