Введение к работе
Актуальность темы. Последние годы характеризуются возросшим интересом к методам культивирования растительных клеток и тканей. Это связано с перспективностью использования клеточных культур в качестве продуцентов различных биологически активных веществ, широко используемых в медицине, промышленности, сельском хозяйстве. Метод культивирования растительных клеток открывает новые возможности в биохимических, цитологических и генетических исследованиях, позволяя достаточно адекватно оценить процессы обмена веществ в растениях. Изолированные клетки растений находят также все более широкое применение в качестве модельных систем для изучения не опосредованных другими тканями растения реакций на действие разнообразных внешних факторов (Слепян и соавт.,1068; Урманце-ва,1992; Butenko et al.,1993). Исследование молекулярных механизмов метаболизма (прежде всего белкового) в дедифференцированных клетках создает предпосылки для более эффективного развития биотехнологии культивируемых клеток.
Объектом данного исследования была пероксидаза, являющаяся одним из основных ферментов метаболизма кислорода и принимающая участие в ферментативном окислении различных субстратов (фенолов, ароматических аминов, индоламинов, ИУК, НАД(Ф)Н и др.). Присутствие этого полифункционального фермента в растительных и животных тканях, а также в составе грибов и бактерий дает основание считать его жизненно важным соединением высших и низших организмов (Андреева,1988). Одной из основных функций пероксидазы является защита растения при действии на него различных неблагоприятных факторов абиотической и биотической природы. Однако до сих пор анализ синтеза и стабильности этого фермента в условиях стресса не был предметом специального исследования. Поскольку в настоящее время рассматривается возможность использования пероксидазы в качестве маркера физиологического состояния растений, сопоставление биосинтетических способностей клеток родственных штаммов по отношению к этому ферменту было бы весьма актуальным. Отсутствие подобных данных в литературе позволяет рассматривать предпринятое нами сравнительное исследование пероксидазы каллусных культур ткани женьшеня в норме и при действии низко- и высокотемпературного шока как перспективное и своевременное.
-4.-
Задачи. исследования. В работе были поставлены следующие задачи:
-
Охарактеризовать динамику изменения активности, физико-химические свойства и молекулярную гетерогенность пероксидазы в течение роста каллусных культур P.ginseng, P.ginseng LX-5, P.ginseng LX-13, P.quinquefolius.
-
Выделить и очистить до гомогенного состояния пероксидазу из культуры ткани P.ginseng LX-5, изучить ее физико-химические свойства и получить к ней моноспецифические антитела.
-
Оценить скорости синтеза, распада и время "полужизни" пероксидазы в клетках ткани P.ginseng, P.ginseng LX-5, P.quinquefolius.
-
Исследовать влияние температурного шока на содержание и физико-химические свойства пероксидазы. ее молекулярную гетерогенность и обмен в клетках культур ткани женьшеня.
Научная новизна. В настоящей работе была впервые изучена и сопоставлена динамика изменения активности, физико-химические свойства, молекулярная гетерогенность и обмен пероксидазы в клетках штаммов двух родственных видов рода Panax, выращиваемых на стандартной и селективных средах. Установлено, что культивирование P.ginseng на средах, обогащенных органическими соединениями германия, приводит к значительным изменениям всех вышеназванных параметров и их сходству с P.quinquefolius: уровень активности пероксидазы увеличивается в 4,5 раза, происходит усложнение ее изоферментного спектра, скорость синтеза фермента возрастает в 5,2 и 4,5 раза соответственно.
Был разработан способ выделения и очистки до гомогенного состояния пероксидазы из культуры ткани P.ginseng LX-5, изучены некоторые физико-химические свойства фермента.
В работе оценено влияние температурного шока на состояние пероксидазы и общего белка в каллусах женьшеня. Установлено, что как при низко-, так и высокотемпературном стрессе активность пероксидазы повышалась за счет увеличения ее содержания в клетках и изменения активности отдельных изоформ. Обнаружено, что действие низких температур приводит к значительному снижению скорости спонтанной деградации фермента, а высокие температуры вызывают существенное увеличение скорости его синтеза. Показано более сильное повреждающее действие низкотемпературного шока.
Теоретическая и практическая значимость. Выполненная работа является теоретическим исследованием. Полученные данные о физико-химических свойствах, скоростях синтеза и распада, времени функционирования и содержания пероксидазы в клеточных культурах ткани женьшеня позволяют расширить наши представления об обмене индивидуальных белков в культурах растительных клеток. Кроме того, результаты исследования содержат информацию о влиянии экстремальных температур на состояние растительной клетки и подтверждают данные о том, что пероксидаза. наряду с белками теплового шока, защищает клетку от повреждения токсичными продуктами обмена и обеспечивает ее функционирование в изменившееся условиях. Работа по выделению и очистісе фермента показала, что культура ткани женьшеня может рассматриваться как один из альтернативных источников пероксидазы.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 150 страницах, содержит 20 таблиц и U2 рисунка . Она состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы, который включает в себя 228 наименований, из них -/SO на иностранном языке.
