Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 15
1.1. Особенности современных способов получения липофильных фракций из сырья природного происхождения и перспективные технологии 15
1.1.1. Специфика традиционных способов извлечения липофильных фракций из сырья природного происхождения 15
1.1.2. Ферментативные способы извлечения липофильных фракций из растительного сырья 21
1.1.3. Проблемы использования органических растворителей для извлечения биологически активных веществ липофильной природы из растительного сырья 22
1.2. Теоретические основы извлечения биологически активных веществ из растительного сырья сжиженными и сжатыми газами 30
1.2.1. История технологии обработки растительного сырья сжиженными и сжатыми газами 30
1.2.2. Физико-химические свойства диоксида углерода как растворителя 36
1.2.3. Технологические основы производства СОг-экстрактов растительного сырья 40
1.3. Современные подходы к процессу разработки, стандартизации и валидации производства лекарственных средств растительного происхождения 45
1.3.1. Ключевые принципы создания лекарственных средств растительного происхождения 45
1.3.2. Проблемы идентификации лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья и выявления фальсифицированной продукции 48
Обобщение 57
Глава II. Объекты и методы исследования 59
2.1. Обоснование выбора объектов исследования. Технологические особенности получения С02-экстрактов и липофильных фракций растительного сырья 59
2.2. Общие подходы к созданию аутентичной системы спецификаций и методы определения основных показателей состава и качества объектов исследования 67
2.3. Статистическая обработка и интерпретация результатов исследования 91
Выводы 97
Глава III. Исследование липофильных фракций растительного сырья, полученных экстракцией жидким оксидом углерода (IV), и разработка спецификаций для контроля качества 99
3.1. Сравнительный анализ состава биологически активных веществ липофильных фракций растительного происхождения, извлекаемых сверхкритическим диоксидом углерода и неполярными органическими растворителями 99
3.2. Исследование влияния химической природы экстрагента на элементный состав липофильных фракций растительного сырья 105
3.3. Разработка спецификаций для контроля качества С02-экстрактов растительного сырья и экспериментальное доклиническое изучение 109
Выводы 142
Глава IV. Изыскание средств и способов получения конституентов природного происхождения для производства мягких лекарственных форм 144
4.1. Разработка технологии извлечения твердой липофильной фракции из плодов растений семейства Сельдерейные 144
4.2. Стандартизация твердой липофильной фракции из плодов растений семейства Сельдерейные как конституента для производства мягких лекарственных форм 169
Выводы 177
Глава V. Обнаружение потенциальных фальсификаций и недоброкачественной продукции среди лекарственных средств растительного происхождения, имеющих неспецифичный состав биологически активных веществ 178
5.1. Общие аспекты выявления фальсификатов и недоброкачественной продукции среди лекарственных средств, изготовленных из масличного растительного сырья 178
5.2. Расчет состава жирных кислот и глицеринов в оценке качества лекарственных средств 190
Выводы 206
Глава VI. Патогенетическое обоснование использования лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья в комплексе лечебно-профилактических мероприятий при социально значимых заболеваниях человека 208
6.1. Перспективы применения лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья для профилактики и лечения воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы неспецифической этиологии 208
6.2. Обоснование использования комплекса полиненасыщенных жирных кислот и антиоксидантов растительного происхождения для профилактики осложненного течения беременности 219
Выводы 227
Общие выводы 229
Глоссарий 231
Литература 246
Приложения 271
- Специфика традиционных способов извлечения липофильных фракций из сырья природного происхождения
- Общие подходы к созданию аутентичной системы спецификаций и методы определения основных показателей состава и качества объектов исследования
- Разработка спецификаций для контроля качества С02-экстрактов растительного сырья и экспериментальное доклиническое изучение
- Стандартизация твердой липофильной фракции из плодов растений семейства Сельдерейные как конституента для производства мягких лекарственных форм
Введение к работе
Критический анализ медико-социальной проблемы лекарственной полипрогмазии указывает на целесообразность углубления теоретических и эмпирических знаний в области разработки лекарственных средств природного происхождения, обладающих сочетанным фармакологическим действием за счет содержания комплекса биологически активных веществ (БАВ). В контексте проблемы актуальным представляется проведение изысканий по созданию лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.
Перспективным технологическим способом получения липофильных фракций природного происхождения, обладающих указанным комбинированным фармакологическим действием, является экстракция сверхкритическими флюидами (СКФ), в частности, сверхкритическим диоксидом углерода. Разработки по экстракции липофильных фракций из растительного сырья диоксидом углерода в сверхкритических условиях имеют отечественный приоритет и находят широкое применение в пищевой отрасли промышленности с 60-х гг. XX века. С 90-х гг. XX века по настоящее время отмечается возрастание практического интереса фармацевтической отрасли к созданию лечебно-профилактических средств на основе липофильных фракций, извлекаемых из растительного сырья сверхкритическим диоксидом углерода. Данные изыскания имеют локальный характер и в целом направлены на разработку биологически активных добавок (БАД).
Системный анализ научных информационных источников показывает, что в контексте решения проблемы лекарственной полипрогмазии и ятрогенной патологии актуальным направлением также является изыскание средств и способов получения из отечественных видов лекарственного растительного сырья (ЛРС) и пищевых растительных источников
фармакологически активных конституентов для производства мягких лекарственных форм (суппозиториев и мазей).
Однако современная тенденция роста производства, распространения, использования низкокачественных и фальсифицированных лекарственных препаратов и БАД природного происхождения, в частности изготовленных на основе масличного растительного сырья, определяет несовершенство существующих подходов к процессу их разработки, стандартизации и валидации производства. Увеличение доли фальсифицированных лекарственных средств представляет значимую медико-социальную проблему, связанную с угрозой здоровью населения страны и оборачивающуюся многомиллионными убытками для государственной казны и частных производителей. В соответствии с разработанным ВОЗ «Планом действий по борьбе с фальсифицированными лекарственными средствами» определение показателей состава и качества (ПСК) лекарственных средств является одной из основных составляющих процесса выявления фальсифицированной и низкокачественной продукции среди препаратов и БАД, изготовленных из масличного ЛРС.
Вышеуказанная проблематика обусловливает необходимость проведения комплексных изысканий, базирующихся на постулатах фармацевтической и медицинской науки и направленных на формирование единообразных подходов к разработке, стандартизации и валидации производства лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, обладающих сочетанным фармакологическим действием.
Направление исследований предусматривает сопоставительный априорный и апостериорный анализ особенностей производства, характеристик показателей состава и качества липофильных фракций растительного сырья, извлекаемых с использованием различных по химической природе экстрагентов; формирование экспериментально-теоретической базы и синтез аутентичной системы, позволяющей создавать
качественные лечебно-профилактические средства на основе липофильных фракций растительного сырья, обладающих сочетанной фармакологической активностью.
Целью исследования является создание аутентичной системы разработки и спецификации лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.
Сформулированная цель исследования обусловила постановку следующих задач исследования:
Провести сопоставительный анализ показателей состава и качества липофильных фракций, полученных из различных видов растительного сырья экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода и неполярными органическими растворителями, и обосновать критерии спецификаций для контроля качества СОг-экстрактов, как новых лекарственных средств растительного происхождения, содержащих комплекс биологически активных веществ, обладающих сочетанной фармакологической активностью.
Разработать способ получения фармакологически активных конституентов растительного происхождения для производства мягких лекарственных форм из отечественного сырья.
Обосновать концептуальные подходы обнаружения недоброкачественной продукции и потенциальных фальсификаций среди препаратов и биологически активных добавок, изготовленных из масличного растительного сырья.
Разработать эмпирическую расчетную методику скрининговой оценки доброкачественности объектов растительного происхождения, характеризующихся неспецифичным составом биологически активных веществ, в частности ацилглицеринов жирных кислот.
На основании результатов теоретических и эмпирических изысканий сформировать аутентичную систему разработки и спецификации
лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ММА им. И.М. Сеченова и является составной частью комплексной программы НИР кафедры общей химии «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники (технологические аспекты)» (номер Государственной регистрации 01.200.118.796).
Научная новизна.
Впервые проведено теоретическое обобщение и обоснование
априорной информации, касающейся процесса получения липофильных
фракций из ЛРС экстракцией жидким оксидом углерода (IV) и перспектив
использования СОг-экстрактов ЛРС для производства лечебно-
профилактических лекарственных средств, сочетающих
противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и
фунгистатической активностью. Апостериорные сопоставительные
экспериментальные исследования липофильных фракций, полученных из 7
родов растительного сырья экстракцией сверхкритическим диоксидом
углерода, позволили, с учетом требований Государственных стандартов
качества лекарственных средств (ГСКЛС), разработать аутентичную систему
спецификаций для контроля качества СОг-экстрактов, как новых
лекарственных средств природного происхождения.
Впервые доказана бактериостатическая и фунгистатическая активность С02-экстрактов семян винограда культурного (Vitis vinifera L.), жома плодов смородины черной (Ribes nigrum L.), а также ССЬ-экстракта шрота семян тыквы в отношении Staphylococcus aureus и Candida albicans. Также впервые
выявлена фунгистатическая активность СОг-экстрактов плодов кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), укропа огородного (Anethum graveolens L.) и травы полыни горькой (Artemisia absinthium L.) в отношении наиболее распространенных поверхностных дерматофитов, а именно Microsporum amis и Trichophyton rubrum.
Разработан способ получения конституентов растительного происхождения для производства мягких лекарственных форм из отечественных видов растительного сырья. Способ основан на использовании ЛРС, произрастающего на территории Российской Федерации, и экстрагента (гексана), широко применяемого в фармацевтическом и пищевом производстве. Оригинальная технологическая схема позволяет упростить процесс извлечения твердой липофильной фракции (ТЛФ) из плодов растений семейства Сельдерейные, увеличить в-ней содержание сбалансированного комплекса БАВ, обладающих антиоксидантным и противовоспалительным действием (каротиноидов, токоферолов, фосфолипидов), обеспечивает получение стабильного целевого продукта. Предложенный способ предусматривает рациональное применение отечественных сырьевых запасов лекарственных растений и позволяет провести замены импортных конституентов для производства мягких лекарственных форм.
Впервые обоснованы принципиальные подходы и разработаны критерии для обнаружения недоброкачественной продукции и потенциальных фальсификаций среди препаратов и биологически активных добавок, изготовленных из масличного растительного сырья, характеризующегося неспецифичным составом биологически активных веществ.
Для скрининговой оценки потенциальных фальсификаций и выявления недоброкачественной продукции среди указанной группы лекарственных средств разработана методика расчета состава жирных кислот и глицеринов на основании значений эмпирических показателей состава и качества.
Экспериментально-теоретические исследования формируют основу аутентичной системы создания и стандартизации лекарственных средств растительного происхождения на основе липофильных фракций, обладающих сочетанной фармакологической активностью. Аутентичная система показателей состава и качества включает спецификации и общедоступные сертифицированные методы и позволяет достоверно обнаруживать потенциальные фальсификации или несоответствия требованиям, предъявляемым Государственными стандартами качества к оценке и валидации технологии производства лекарственных средств природного происхождения.
Степень новизны проведенных исследований подтверждена шестью патентами РФ.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования.
В результате проведенных изысканий сформирована
экспериментально-теоретическая база для создания лечебно-профилактических лекарственных средств природного происхождения, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио-и фунгистатической активностью.
Разработанная аутентичная система спецификаций для контроля качества лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью, позволяет объективно установить подлинность изученных объектов и обнаружить потенциальные фальсификации или несоответствия требованиям, предъявляемым Государственными стандартами качества к лекарственным средствам, получаемым из растительного сырья. Предварительные результаты доклинических испытаний являются основой для достоверного выявления, оценки и доказательства прогнозируемой терапевтической активности в ходе отдаленных клинических исследований лекарственных препаратов на основе С02-экстрактов растительного сырья.
Результаты исследования положены в основу инновационной разработки и инновационного бизнес-предложения: «Лекарственные средства на основе липофильных фракций лекарственного растительного сырья для профилактики и лечения воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы: технология создания и перспективы применения». Данный инновационный проект был представлен в финале конкурсной программы инновационных проектов «Фабрика инноваций: прорыв в будущее», проводившейся в рамках V Московского Международного Салона инноваций и инвестиций (15-18 февраля 2005 г.), и награжден Дипломом Федеральной Службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.
Разработанная автором методика расчета состава жирных кислот и глицеринов объектов природного происхождения внедрена в учебный процесс на химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова и используется при изучении разделов, связанных с анализом подлинности и доброкачественности объектов липофильной природы. Указанная методика также внедрена в ГОУ ВПО РУДЫ (медицинский факультет, кафедра общей фармацевтической и биомедицинской технологии) при изучении модулей, включающих принципы валидации технологии производства и качества препаратов, изготовленных на основе липофильных фракций растений.
По результатам исследования в рамках реализации «Программы формирования инновационного образовательного пространства ММА им. И.М. Сеченова» (приоритетный национальный проект «Образование») автором выполнен проект «Разработка учебно-методического пособия курса дистанционного обучения «Технологии получения лекарственных средств на основе липофильных фракций сырья природного происхождения» (тема № 138, приказ № Р-98 от 27 марта 2007 г.) и создан одноименный учебник, являющийся основой учебно-методического обеспечения курса дистанционного обучения для повышения квалификации и переподготовки специалистов, работающих на фармацевтическом производстве и в аптечной
сети, имеющей рецептурно-производственные отделы. Учебник «Технологии
получения лекарственных средств на основе липофильных фракций сырья
природного происхождения (курс дистанционного обучения)» рекомендован
Учебно-методическим объединением по медицинскому и
фармацевтическому образованию вузов России для системы послевузовского профессионального образования провизоров (УМО-51-Д 12 февраля 2008 г.). Курс дистанционного обучения «Технологии получения лекарственных средств на основе липофильных фракций сырья природного происхождения» внедрен в ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава, факультет послевузовского профессионального образования провизоров, кафедра фармации с курсом социальной фармации и в ГОУ Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства (ИПК ФМБА) России, кафедра фармации.
Апробация работы. Материалы исследования были представлены для обсуждения на следующих конференциях, съездах, конгрессах: III, IX-XI, XV и XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1996; Москва, 2002-2004; Москва, 2008; Москва 2009); 51-ой региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров ПГФА (Пятигорск, 1996); научно-практической конференции, посвященной 50-тилетию Ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 1996); юбилейной конференции «Актуальные вопросы фитотерапии» РОО «Фитотерапевтическое общество» (Москва, 2002); I и II научно-практических конференциях Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН «Традиционные методы лечения в акушерско-гинекологической практике» (Москва, 2001; Москва, 2003); 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии ПГФА «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Восстановительная медицина и традиционные методы профилактики и лечения в акушерстве, гинекологии и
перинатологии» (Волгоград, 2004); ІП-ІХ Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург-Пушкин, 1999; Великий Новгород, 2000; Санкт-Петербург, 2001; Санкт-Петербург, 2002; Санкт-Петербург-Пушкин, 2003; Миккели (Финляндия), 2004; Санкт-Петербург, 2005); Республиканской научно-практической конференции «Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Р.Л. Хазанович (Ташкент, 2006); VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007); научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации» (Ташкент, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 работ, в
том числе монография, учебник для системы послевузовского
профессионального образования провизоров, созданный в рамках программы формирования инновационного образовательного пространства ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава (Приоритетный национальный проект «Образование»), 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, 6 патентов на изобретения.
Специфика традиционных способов извлечения липофильных фракций из сырья природного происхождения
Обобщение тенденций экспериментально-теоретических исследований в области современных технологий получения липофильных фракций из лекарственного растительного сырья и анализ научных источников и патентной документации за период 1990-2008 гг. показывает, что традиционные методы получения липофильных фракций из ЛРС - это прессование и экстракция [6, 106, 148-150].
Существуют различные модификации методов прессования и экстракции, но первым технологическим этапом для всех является предварительная сушка ЛРС. Основная цель данного технологического этапа - это, во-первых, удаление избыточной влаги, т.к. при влажности более 7% в сырье происходит ряд биохимических процессов, затрудняющих прессование и экстракцию и снижающих выход липофильной фракции, в частности гидролиз триацилглицеринов (ТАГ) липазами.
Во-вторых, при достижении оптимальной влажности лекарственного растительного сырья наблюдается концентрирование биологически активных веществ. Так, установлено увеличение содержания линолевой кислоты в ТАГ масла семян тыквы почти в 2 раза по сравнению с семенами до тепловой обработки. Кроме того, тепловое воздействие способствует обогащению липофильной фракции такими группами БАВ, как токоферолы, каротиноиды, фосфолипиды и др. Это объясняется тем, что при тепловой обработке наблюдается разрыв связей указанных БАВ с белковой частью семян и переход их в липофильную фракцию (жирное масло) [39, 40, 52, 53, 59, 120].
Оптимизация процесса получения жирного масла из семян тыквы прессованием достигается, например, использованием метода, включающего двухстадийную влаготепловую обработку перерабатываемого сырья [39, 40].
На первой стадии измельченные семена, увлажненные до 12—14%, кратковременно обрабатывают при температуре 80—90С. При таком значительном увлажнении масло вытесняется на поверхность частиц за счет избирательного смачивания водой белков мятки и их набухания. Разрушение фермента липоксигеназы исключает окисление ненасыщенных жирных кислот ТАГ, тем самым, предотвращая увеличение кислотного числа масла. Между фосфатидами и другими веществами происходит расщепление связей, повышается растворимость фосфатидов в масле. На следующей стадии обработки влажность мятки снижается до 3% при низкотемпературном длительном прогревании. На этом этапе частицы мятки приобретают необходимую для прессования поверхностную жесткость. При этом происходит окончательное разрушение структур мятки, образование многочисленных пор, полное растворение фосфатидов в масле. Экспериментальные исследования показали, что увеличение температуры на первой стадии выше 90С отрицательно сказывается на качестве масла, т.к. происходит разрушение БАВ. Деградация температуры ниже 80С уменьшает эффективность разрушения клеточных структур, увеличивая долю трудно извлекаемых липидов, что также приводит к уменьшению выхода масла. Повышение влагосодержания мятки выше 14% способствует снижению ее пористости из-за вытеснения масла из трещин и пор частиц, агрегирования и слипания частиц друг с другом. При снижении влагосодержания мятки ниже 12% не происходит полного заполнения пор и полостей мятки влагой. В результате из-за недостаточной степени набухания не достигается необходимая глубина разрушения клеточных структур, снижается пористость [39,40].
Технологический процесс производства препарата тыквеол заключается в следующем. Семена фармакопейных видов тыкв измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 3-7 мм. Далее слоем 70-80 мм измельченные семена подают на жаровню, разогретую до 80-90С, затем массу увлажняют до 20-25% и подогревают до 65—70С (при постоянном перемешивании) в течение 10-12 мин. При достижении влажности 6-7% прессуют при температуре 50-55С. Считается, что для получения масла семян тыквы температурный режим 50—55С является наиболее оптимальным. При повышенной температуре происходит разрушение БАВ [95, 103].
Несмотря на большое давление, методом прессования удается извлечь лишь небольшое количество (примерно 10-15% общего содержания) жирного масла, содержащегося в сырье. Это обусловлено тем, что масло, распределенное в мятке в виде тонких пленок на поверхности измельченного ядра, удерживается поверхностными силами, величина которых намного больше давлений, развиваемых лучшими прессами, применяемыми для извлечения масла.
Метод прессования не приемлем для получения жирных масел из жомов плодово-ягодных культур [24, 72, 95, 148-150]. Поэтому эффективным способом получения жирных масел из ЛРС, обеспечивающим практически полное извлечение целевого продукта, является метод экстракции.
Экстракционный метод, как известно, основан на максимально возможном извлечении липидов из ЛРС при многократной обработке растворителем. Процесс обезжиривания ведется до тех пор, пока содержание липидов в материале не будет представлять ничтожно малую величину. Затем из полученной вытяжки отгоняют растворитель, а остаток, содержащий липофильную фракцию (жирное масло) высушивают в условиях, исключающих его окисление. На этом принципе основаны широко применяемые в пищевой, фармацевтической и парфюмерной промышленности методы Сокслета, Фолча, Блая и Зайченко [71, 148-150].
Процесс экстракции липофильных фракций чаще всего ведут способами погружения экстрагируемого материала в противоточно движущийся растворитель или способами ступенчатого орошения растворителем противоточно перемещающегося обрабатываемого материала. Другие способы экстракции распространены меньше.
При экстракции погружением липофильная фракция из лекарственного растительного сырья извлекается в процессе непрерывного прохождения его через поток растворителя в условиях противотока, при котором и растворитель, и экстрагируемый материал непрерывно передвигаются относительно друг друга. К преимуществам экстракции погружением относятся: высокая скорость экстракции; малая продолжительность процесса обезжиривания; простота конструктивного оформления экстракционных аппаратов и малые площади, занимаемые ими; высокий коэффициент полезного использования геометрического объема (до 98%) аппарата, предотвращающий возможность образования в аппаратах взрывоопасных смесей воздуха и растворителя. Недостатками экстракцией погружением являются: низкие концентрации конечных мисцелл; относительно высокое содержание примесей в мисцелле и связанная с этим сложная система ее фильтрации; большие размеры экстракторов по высоте (высота экстракционной колонны 13,12 м, загрузочной — 9,33 м).
Общие подходы к созданию аутентичной системы спецификаций и методы определения основных показателей состава и качества объектов исследования
В соответствии с целью и задачами исследования предварительные этапы разработки лекарственных средств на основе липофильных фракций ЛРС, обладающих сочетанным противовоспалительным и антиоксидантным действием, бактерио- и фунгистатической активностью, включали скрининг источников липофильных фракций, а также выбор экстрагента и, соответственно, способа получения липофильной фракции из ЛРС. Скрининг видов ЛРС (источников липофильных фракций) проводился по содержанию БАВ, которые должны сочетать противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью.
Для получения препарата с низкой себестоимостью необходимо наличие достаточной сырьевой базы, т.е. в качестве источников липофильных фракций целесообразно использовать виды ЛРС, имеющие либо обширный ареал произрастания, либо широко культивируемые или являющиеся отходами пищевых производств.
Экспериментально-теоретическое обоснование аутентичных подходов к процессу создания лекарственных средств на основе липофильных фракций ЛРС, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью, проведено в настоящей работе на примере видов растительного сырья, относящегося к разным семействам и морфологическим группам.
Объектами для создания аутентичной системы разработки и спецификации лекарственных средств на основе липофильных фракций растительного сырья, сочетающих противовоспалительное и антиоксидантное действие с бактерио- и фунгистатической активностью:, явились официнальные виды ЛРС и пищевые растительные источники, являющиеся. отходами соответствующих производств: плоды кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), укропа пахучего (Anethum graveolens L.), облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides L.), трава полыни горькой (Artemisia absinthium L.), семена винограда культурного (Vitis vinifera L.), жом плодов смородины черной (Ribes nigrum L.)," шрот семян1 тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.)5 тыквы большой (Gucurbita maxima Duch. тыквы мускатной (Gucurbita moschata(Duch.) Poir.) (аптечная смесь), С02-экстракты из указанных видов растительного сырья : были г получены на экспериментально-промышленном оборудовании с учетом индивидуальных параметров процесса для, конкретной морфологической группы и вида сырья и в соответствии с ТУ 9169-001-51032622-99 и ТУ 9169-001-96932037-99 «Экстракты из растительного сырья».
Технологические особенности обработки растительного сырья в условиях экстракции сверхкритическим диоксидом углерода V предусматривали сокращение цикла обработки сырья и повышение производительности экстракционного оборудования за счет интенсификации , -процесса экстракции БАВ при параметрах, обеспечивающих постоянство; химического состава обрабатываемого растительного сырья и готового продукта. Интенсификация экстракции БАВ и увеличение полноты: их извлечения из капиллярно-пористых тел включала создание оптимальных . условий процесса экстракции, при котором возникает поток молярной ; фильтрации извлекаемых БАВ. С этой целью после пропитки измельченного растительного сырья жидким диоксидом углерода осуществлялся резкий: , сброс давления до величины ниже давления насыщения при температуре процесса. Данный сброс давления обусловливает нарушение термодинамического равновесия системы твердое тело — растворитель (экстрагент). Сброс давления осуществляется кратковременным соединением объема, в котором происходит процесс, с ресивером, в котором давление ниже давления насыщенных паров экстрагента. При этом создаются условия для вскипания экстрагента. За счет разности давления в объеме частиц твердого тела (сырья) и в экстрагенте (растворителе) возникает парожидкостной поток растворителя, способствующий извлечению находящихся в свободном состоянии компонентов к поверхности частиц. Известно, что применение периодического сброса давления обеспечивает увеличение выхода экстрактивных веществ и снижает продолжительность экстракции приблизительно в 2 раза [4, 84, 85, 97, 126, 155, 162, 173, 178, 179].
Сравнительные исследования процесса экстракции растительного сырья, измельченного в виде лепестка и крупки, соизмеримых по величине их поверхности и объема, указывают на целесообразность использования лепестковой структуры, которая, при прочих равных условиях, обеспечивает оптимальное извлечение экстрактивных веществ. Ранее было показано, что по сравнению с крупкой лепестковая вторичная структура обладает более выраженными дренажными свойствами, а усредненный размер частиц обеспечивает в целом равномерное прохождение растворителя (экстрагента). Разрушение клеточной структуры сырья является значимым фактором, влияющим на интенсификацию процесса экстракции. Толщина лепестка, обеспечивающая оптимальное для эффективной экстракции БАВ значение величины удельной поверхности сырья (отношения площади его поверхности к объему), составляет 0,1-0,2 мм [22, 97, 126].
В зависимости от морфологической принадлежности растительное сырье подвергалось предварительному измельчению в крупку (до размера частиц, проходящих через сито с диаметром отверстий 1 мм) или лепесткованию до толщины 0,2 мм. Либо использовалось измельчение растительного сырья в крупку с последующим лепесткованием. Режим экстракции: температура - 40С, давление - 20,0 МПа, время экстракции - 35 минут. Экстрагент - жидкий диоксид углерода (ГОСТ 8050-85) [41, 61, 97, 126]. Общая схема установки для экстракции сверхкритическими флюидами и схема экстракционного модуля С02-экстракции представлены на рисунках 5 и 6, соответственно.
Принцип работы экстракционного модуля заключается в следующем: подготовленное растительное сырье загружается в экстракторы модуля; после этого надевают самоуплотняющиеся люки, которые «запирают» подачей в их полость газообразного диоксида углерода. В верхнюю часть экстрактора самотеком подается растворитель из сборников. Экстракция осуществляется проточно. Мисцелла из экстракторов сливается в испаритель. Температуру мисцеллы в испарителе доводят до 40С подачей горячей воды в рубашку испарителя, в результате этого происходит кипение мисцеллы и испарение диоксида углерода, пары которого поступают в конденсатор. Жидкий диоксид углерода стекает в сборники. Таким образом, экстрагент проходит по замкнутому циклу, и обеспечивается многократная экстракция. Периодически, после стекания мисцеллы в испаритель, давление из экстракторов сбрасывается через ресивер, что, как было указано выше, обусловливает интенсификацию процесса, сокращая время экстракции, и способствует увеличению выхода продукта.
Разработка спецификаций для контроля качества С02-экстрактов растительного сырья и экспериментальное доклиническое изучение
Рабочая методика определения остаточных количеств растворителя (гексана) в экспериментальных образцах твердых липофилъных фракций (ТЛФ) плодов растений семейства Сельдерейные (см. главу IV настоящего исследования) : газо-жидкостная хроматография - пламенно-ионизационный детектор (ГЖХ-ПИД) с газовой экстракцией. Кварцевая капиллярная колонка 30м .25мм.25мкм Rtx-1. 40, 3Л-270С, 5/мин. Газ-носитель - гелий, давление -1,0 атм. Режим инжектирования со сбросом 30 мл/мин и с задержкой сброса 1 мин. Пробоподготовка: 1,0 г образца диспергировался с 5 мл бидистиллированной воды и 1 мл паровой фазы; проба инжектировалась в ГЖХ-ПИД. Температура виал с образцами — 80С, газового шприца - 80С. Микробиологический анализ липофильных фракций, полученных из вышеуказанных видов растительного сырья экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода, включал исследование микробиологической активности и контроль микробиологической чистоты.
Контроль микробиологической чистоты исследованных СО2-экстрактов растительного сырья проводился в соответствии с требованиями и согласно методикам ГФ XI и Изменению № 2 к статье ГФ XI «Методы микробиологического контроля лекарственных средств», ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота» ГФ XII. В соответствии с требованиями ГСКЛС полученные СОг-экстракты растительного сырья были отнесены к категории 3.2. — субстанции природного происхождения (растительного, животного или минерального) для производства нестерильных лекарственных препаратов.
Микробиологический контроль включал определение общего числа аэробных бактерий, общего числа грибов в 1 г исследуемого образца. Отсутствие Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, энтеробактерий в 1 г образца и отсутствие Salmonella в 10 г образца.
Известно, что липофильные фракции, извлекаемые из различных видов растительного сырья сверхкритическим диоксидом углерода, обладают антимикробной активностью [18, 159, 225]. Поэтому, во избежание неправильной интерпретации результатов контроля микробиологической чистоты, определяли действие исследуемых С02-экстрактов растительного сырья в отношении тест-микроорганизмов, которые согласно указаниям ГСКЛС используются для определения антимикробного действия лекарственных средств и ростовых свойств питательных сред. Испытание проводили в отношении следующих тест-штаммов: Bacillus subtilis АТСС 6633; Escherichia coli АТСС 25922; Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853; Staphylococcus aureus АТСС 25923; Candida albicans (больничный штамм). В исследовании была использована методика определения антимикробной активности, разработанная для СОг-экстрактов растительного сырья в лаборатории микробиологии Краснодарского НИИ хранения и переработки сельскохозяйственной продукции [61].
Для анализа около 0,2 г (точная навеска) исследуемого ССЬ-экстракта растворяют в 1,8 мл ацетона, получая разведение 100 000 мкг/мл (основной раствор). Из основного раствора десятикратным разведением в ацетоне каждого образца готовят раствор с концентрацией 10 000 мкг/мл (дополнительный раствор).
Питательная среда — мясо-пептонный агар на 0,4% переваре Хоттингера (гидролизат мясной панкреатический) с рН=7,2±0,1. Питательную среду разливают во флаконы по 20 мг. В каждый флакон со стерильной расплавленной и охлажденной до 50С питательной средой добавляют достаточное количество основного и дополнительного растворов С02-экстракта в ацетоне, чтобы получить ряд двукратных разведений СОг-экстракта в плотной питательной среде. Содержимое флаконов разливают в стерильные чашки Петри и составляют ряды с концентрациями исследуемых образцов 65-2000 мкг/мл. Контролем является питательная среда с добавлением ацетона в количестве 0,4 мл на 20 мл питательной среды.
В серию чашек Петри, содержащих различное количество исследуемого образца в питательной среде, засевают по секторам экспериментальные тест-микроорганизмы в количестве одного ушка бактериологической петли суспензии суточной агаровой культуры, содержащей 10 млн. клеток. Посевы инкубируют при 37С в течение 24 ч, результаты учитывают по наименьшей ингибирующей дозе [61].
В работе также была исследована активность изучаемых ССЬ-экстрактов растительного сырья в отношении Proteus vulgaris НХ 19 N 222 и поверхностных дерматофитов: Microsporum canis ВПКГ-326/16; Trichophyton ritbrum 248/700. С целью подтверждения литературных данных о возможности получения стерильных извлечений из растительного сырья в условиях экстракции сверхкритическим диоксидом углерода [104, 105, 115, 116, 128, 181, 193] нами также было проведено испытание С02-экстрактов на стерильность. Исследование проводили в соответствии с указаниями ОФС 42-0066-07 «Стерильность» ГФ XII.
Статистическая обработка результатов проведена с учетом указаний Общей статьи ГФ XI «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний», в основу которых положены принципы дескриптивного анализа и аналитической статистики [42, 43, 50, 129, 170, 187]. В исследовании использована программа SPSS for Windows 11.0.1.
Дескриптивный анализ включает описательное представление отдельных переменных. К данному виду статистического анализа относятся создание частотной таблицы, вычисление статистических характеристик или графическое представление. Задача аналитической статистики — предоставление методов позволяющих, например, объективно выяснить является или не является наблюдаемая разница в средних значениях или корреляция выборок случайной.
Стандартизация твердой липофильной фракции из плодов растений семейства Сельдерейные как конституента для производства мягких лекарственных форм
Изучение и обобщение тенденций экспериментально-теоретических исследований в области современных технологий получения липофильных фракций растительного происхождения указывает на целесообразность использования СКФ в качестве экстрагентов БАВ, обладающих широким спектром фармакологической активности. К достоинствам процесса сверхкритического экстрагирования БАВ липофильной природы по сравнению с экстракцией неполярными органическими растворителями относят: энергосберегающий характер процесса; высокие массообменные характеристики и селективность экстрагирования; значительную степень извлечения соответствующих БАВ, сочетающуюся с высоким качеством конечного продукта; легкость процесса регенерации большинства СКФ, их нетоксичность и химическую инертность.
Диоксид углерода является наиболее широко применяемым в сверхкритическом состоянии экстрагентом БАВ липофильной природы, поскольку использование его во флюидном состоянии гарантирует осуществление процесса экстракции в температурном режиме, обеспечивающем отсутствие термической деградации БАВ. Экстракт, получаемый в процессе сверхкритического экстрагирования диоксидом углерода, характеризуется практическим отсутствием остаточного растворителя. Нами проведено сравнительное изучение качественного и количественного состава основных групп омыляемых и неомыляемых БАВ (ТАГ жирных кислот, токоферолов, каротиноидов и фосфолипидов) фракций, полученных из ряда видов пищевого и лекарственного растительного сырья, экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода и неполярными органическими растворителями - пищевым бензином марки «Нефракс» и гексаном.
Для получения липофильных фракций были выбраны виды растительного сырья, относящегося к разным семействам и морфологическим группам: плоды кориандра посевного (Coriandrum sativum L.); плоды укропа пахучего (Anethhum graveolens L.); семена винограда культурного (Vitis vinifera L.); а также жом плодов смородины черной (Ribes nigram L.) и шрот семян тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.), тыквы большой (Cucurbita maxima Duch.), тыквы мускатной (Cucurbita moschata (Duch.) Poir.), являющиеся отходами пищевых производств.
СОг-экстракты из указанных видов растительного сырья были получены на экспериментально-промышленном оборудовании экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода с учетом индивидуальных параметров процесса для конкретной морфологической группы и вида сырья. Неполярными органическими растворителями липофильные фракции извлекались с использованием способа ступенчатого орошения растворителем противоточно перемещающегося обрабатываемого материала.
Как показано в таблице 12, липофильные фракции, извлекаемые сверхкритическим диоксидом углерода и традиционными неполярными органическими растворителями, имеют идентичный жирнокислотный состав, который также сопоставим по общему содержанию насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Известно, что при использовании сверхкритического диоксида углерода отмечается инактивация пероксидазы, активность которой в указанном случае уменьшается приблизительно в 10 раз.
Данный факт подтверждается в проведенном эксперименте и наглядно иллюстрируется значительно меньшим содержанием пальмитолеиновои кислоты в экстрактах, извлекаемых из плодов растений семейства Сельдерейные неполярными органическими растворителями, по сравнению с СОг-экстрактами тех же видов растительного сырья. Содержание пальмитолеиновои кислоты в ССЬ-экстракте плодов кориандра посевного на 92,3% превышает соответствующий показатель для экстрактов, извлекаемых органическими растворителями. Для СОг-экстракта плодов укропа пахучего — на 19%. Содержание пальмитиновой кислоты в С02-экстрактах плодов кориандра посевного и укропа пахучего на 80% и 15%, соответственно, меньше, чем в экстрактах, извлеченных с использованием бензина «Нефракс» и гексана.
Использование сверхкритического диоксида углерода позволяет получать экстракты из анализируемых видов растительного сырья идентичные по качественному составу БАВ неомыляемой фракции экстрактам, извлекаемым неполярными органическими растворителями по традиционной технологии (таблица 13). Однако суммарное содержание БАВ неомыляемой фракции в полученных СОг-экстрактах в целом меньше, чем для соответствующих экстрактов, извлеченных с использованием бензина «Нефракс» и гексана. Это может быть объяснено с точки зрения того, что в зависимости от технологических параметров процесса экстракции изменяется избирательная способность жидкого диоксида углерода, как экстрагента БАВ липофильной природы.
Как было указано в главе I, оптимальным для обеспечения максимального выхода БАВ является температурный режим экстракции в пределах 15-20С; повышение температуры процесса экстракции БАВ из растительного сырья жидким диоксидом углерода до его критической температуры (31,1 С) - фактор, снижающий выход экстрактивных веществ. Снижение выхода экстрактивных веществ при повышении температуры процесса экстракции жидким диоксидом углерода объясняется: агрегативной неустойчивостью жидкофазного состояния экстрагента в зоне его критической температуры; уменьшением градиента химических потенциалов по составу компонентов; снижением величины изотермической молекулярной диффузии извлекаемых компонентов в экстрагенте (несмотря на существование градиента концентрации).
Кроме того, изменяя давление в среде сверхкритического диоксида углерода можно получать вариабельные по составу экстракты. Но при этом ни одно из полученных извлечений не будет идентичным, в частности по количественному составу БАВ неомыляемой фракции, экстрактам, извлекаемым неполярными растворителями.
Также известно, что применение неполярных органических растворителей обычно способствует увеличению содержания БАВ, сопутствующих глицеринам жирных кислот в липофильных фракциях растительного сырья.
Необходимо отметить, что в изученных СОг-экстрактах растительного сырья не обнаружены фосфороорганические соединения. Этот факт согласуется с имеющимися данными, указывающими на то, что фосфолипиды в липофильных фракциях, полученных экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода, либо не обнаруживаются, либо присутствуют в следовых количествах. Указанный феномен объясняется малой растворимостью фосфолипидов в сверхкритическом диоксиде углерода.
![Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.].](/i/i/4243/375120.png "Исследования по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.]. Рыжов Виталий Михайлович")
![Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс]](/i/i/4374/196937.png "Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств [Электронный ресурс] Файзуллина Рената Ринатовна")